结核病实验室诊断技术新进展

1、 结核病实验室诊断技术新进展结核病实验室诊断技术新进展 主要内容主要内容l结核病实验室常用的诊断技术和方法l结核病实验室新的诊断技术和方法l未来实验室结核病的诊断模式 2 1、细菌学方法 2、免疫学方法 3、分子生物学方法33一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法 1、细菌学方法（抗酸染色双目显微镜、固体或液体培养）44一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法培养on plates or in broth identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colo

2、ny显微镜检查脱色复染染色unstained or stained with e.g. Gram stain 2、免疫学方法 抗体检测是结核病辅助诊断手段， 对菌阴肺结核有 一定的参考价值。 1、酶联免疫吸附试验 2、免疫胶体金标技术 55一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法67 潜伏结核感染者的筛查 结核菌素PPD试验 3、分子生物学方法 实时荧光定量PCR技术：也称分子信标技术，是今年发展起来的核酸定量技术。是PCR与核酸探针技术的结合，将PCR较高的灵敏度和核酸探针的高特异性相结合。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记

3、一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 88一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法99 二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法 分类 新方法 用途 细菌学检查 LED(发光二极管显微镜) 涂片检查 免疫学方法 -干扰素释放实验 潜伏感染者 分子生物学 LAMP( 等温扩增) 涂阴涂阳 LPA( 线性探针) MDR-TB,

4、 鉴定 Genechip(基因芯片) MDR-TB, 鉴定 GeneXpert(多色巢式定量PCR) 耐RFP, 涂阴 分子分型技术 指纹图谱分析 其他 DNA 测序法 突变检测 HPLC 胞壁成分检测 1010二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法1 1、细菌学检查 发光二极管（LEDLED）荧光显微镜光源寿命光源寿命长（30,000h30,000h）不不需要预热不需要暗室暗室可用现有的显微镜可使用可使用电池电源与通常通常荧光显微镜的判定一判定一致率致率98.0%98.0%两种方法观察结果Z-N染色镜检结果LED镜检结果二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法中盖项目LED评估结果 初

5、诊患者 LED涂阳患者检出率为14.96%（552/3691），萋尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46% (460/3691)，前者较后者提高2.5个百分点（P=0.000） 随访患者 LED和明场显微镜的检出率分别为7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26个百分点（P=0.000）中盖项目LED评估结果 读片时间 LED 读片时间120.0338.88秒，明场显微镜206.3175.86秒（p=0.00） 使用接受度调查 对于进一步推广建议，大多数(8/9)认为应进一步推广，但其中有2人认为应在日工作量大的实验室优先使用1414二、二、 新诊断技术和方

6、法新诊断技术和方法 单核细胞分离单核细胞分离TBTB抗原刺激，IFN-IFN- 释放与标记的二抗结合 酶作用标记物显色每一斑点代表释放 IFN- IFN- 的一个细胞Y Y Y YY Y Y YY Y Y YYYYYY Y Y YYYYYIFN-抗原一抗捕获IFN-IFN- 2 2、免疫学方法： - -干扰素释放实验BCG进化过程1616二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法分子生物学 LAMP( 等温扩增)LPA( 线性探针)Genechip(基因芯片)GeneXpert( 多色巢式定量PCR)分子分型技术1717二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（1）环介导等温扩增技术(Loo

7、p mediated isothermal amplification ，LAMP)：Eiken,Japan 可同时检测患者是否感染结核 所用仪器设备极其简单 63 扩增（避免非特异性扩增 多对引物（提高特异性和速度）：靶基因6个不同区域，设计4种引物对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性密闭系统(没有污染的风险）快速，两小时内即可得到检测结果，肉眼观察 1818二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)临床标本（咯痰等）等）DNADNA提取基因扩增基因检出标本处理Extrac

8、tion solution 1 and 210min ,1001min ,2000gSupernatant，capture DNAReconstitute reaction mix40min ,67LAMP amplificationPCR LAMP 需要使用PCRPCR扩增仪 设计特异性的两条引物 扩增效率:1:10 07 7 不需要使用PCRPCR扩增仪 多对引物保证扩增的特异性 扩增效率: :10101010二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)192020二、二、 新

9、诊断技术和方法新诊断技术和方法3、分子生物学（2） 线性探针检测技术（LPA）可进行结核杆菌复合群的鉴定可用于MDR-TB高危人群的筛查对利福平的抗药性(通过检测rpoB基因的最常见突变)对异烟肼的抗药性(通过检测katG基因和inhA基因的最常见突变)检测的样本可以是纯培养物或是涂片阳性的痰标本内部控制保证了结果的正确可以获得商品化的试剂盒约五小时内即可得到检测结果需要配备生物安全柜的生物安全二级实验室需要至少三间房子Who policy statement， June 20082121二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3、分子生物学（2） 线性探针检测技术（LPA）耐药分子诊断的基

10、本原理 利福平/异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特定基因某些位点 的突变相关。抗结核药抗结核药基因基因基因功能基因功能耐药百分比耐药百分比利福平利福平rpoB编码编码DNA依赖依赖RNA聚合酶，聚合酶，参与参与mRNA转录过程转录过程 90 %异烟肼异烟肼katG编码过氧化氢编码过氧化氢-过氧化物酶，过氧化物酶，参与参与INH体内的转化体内的转化40 - 100 %高水平耐药高水平耐药inhA编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖的依赖的enoyl-ACP还原酶，参与脂酸的合成还原酶，参与脂酸的合成appr25 %低水平耐药低水平耐药 2222DNADNA提取标本 固

11、体或液体培养基培养的菌种 抗酸染色涂片阳性标本方法 超声波裂解 GenoLyse试剂盒0.51 h2323 PCRPCR扩增不同标本, ,扩增参数不同 培养菌种：扩增2020个循环 涂阳标本：扩增3030个循环引物：生物素标记多重PCRPCR扩增2.5 3h2424 杂 交采用反向杂交法: :PCRPCR扩增产物变性（DNADNA成单链）与线性探针杂交洗涤显色判断结果1 2h2525结果判读0.5h中盖项目线性探针检测利福平评价利福平利福平线性线性探针探针传统药敏传统药敏合计合计一致率一致率灵敏度灵敏度特异性特异性PPVNPV耐药耐药敏感敏感合计合计耐药耐药1354117693.6%75.0%

12、96.5%76.7%96.2%敏感敏感451127172合计合HO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008通过系统评估和META分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本RIP ：敏感性97%， 特异性99%中盖项目线性探针检测异烟肼评价异烟肼异烟肼线性线性探针探针传统药敏传统药敏总计总计一致率一致率灵敏度灵敏度特异性特异性PPVNPV耐药耐药敏感敏感合计合计耐药耐药1493017993.2%71.0%97.4%83.2% 94.8%敏感敏感6111081169合计合计21011381348WHO POLICY STATEMENT 27 JU

13、NE 2008通过系统评估和META分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本INH：敏感性90%， 特异性99%中盖项目线性探针检测MDR评价MDR线性线性探针探针传统传统合计合计一致率一致率灵敏度灵敏度特异性特异性PPVNPVMDR非非-MDR合计合计MDR792810795.0%66.4%97.7%73.8% 96.8%非非-MDR4012011241合计合计11912291348WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008通过系统评估和META分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本MDR-TB检测准确性：99%。WHO POLICY STATEME

14、NT 27 JUNE 2008 county level. 线性探针分析不能替代目前传统的培养和药敏试验，涂阴标本和XDR-TB的证实都需要进行传统的培养。29基因芯片 基因芯片指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3）Genechip(基因芯片)30检测过程杂交反应杂交清洗清洗干燥扫描检测数据分析检测分析PCR扩增DNA 提取样品制备二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3）Gen

15、echip(基因芯片)31芯片结果图例二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3）Genechip(基因芯片)323333二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3）Genechip(基因芯片) 结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书获国家医疗器械证书和欧盟CE认证样品制备仪 杂交仪n 通 量：两个一线抗结核药n 速 度： 6 小时（比传统药敏试验法快 50-100 倍）n 灵敏度：103 CFU/反应n 特异性：对照设计严谨；自动判读基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。软件判读激光共焦扫描仪Internation

16、al Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）是一种半定量巢式实时PCR的检测方法，能检测杆菌和利福平耐药性。扩增出ropB基因含有81bp的核心区序列，探针能够区分野生型基因序列与突变型基因序列。集样本准备、扩增和实时检测于一体。盒子中含有冻干的试剂，缓冲液和洗涤液。使用6色激光检测装置对靶核酸进行实时检测。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4）GeneXpert( 多色巢式定量PCR)检测技术34 标 本 类 型 ： 临 床 痰 标 本 ， 或 浓 缩 处 理 后 的 标 本 （ 涂 阳

17、或 涂 阴 培 阳 ） ， 不 能 用 于 用 于 治 疗 随 访 的 病 人 。 对 涂 阴 培 阳 病 人 具 有 非 常 高 的 敏 感 性 和 特 异 性 可 同 时 检 测 患 者 是 否 结 核 以 及 是 否 对 利 福 平 耐 药 两 小 时 内 即 可 得 到 检 测 结 果 ， 所 用 仪 器 设 备 简 单 不 需 要 生 物 安 全 柜 ， 满 足 涂 片 试 验 条 件 的 实 验 室二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4）GeneXpert( 多色巢式定量PCR)检测技术35 利 福 平 耐 药 阴 性 预 测 值 ： 在 结 核 病 利 福 平 耐 药 流

18、 行 低 或 高 的 地 区 ， N P V 大 于 9 9 % . 即 阴 性 结 果 能 排 除 R I P 耐 药 利 福 平 耐 药 阳 性 预 测 值 ： R I P 耐 药 流 行 1 5 % ， P P V 9 0 % R I P 耐 药 流 行 5 % 1 0 % ， P P V ： 7 1 % 8 4 % R I P 耐 药 流 行 5 % ， P P V ： 7 0 % ， 在 这 种 情 况 下 ， R I P 耐 药 的 结 果 需 要 传 统 的 D S T 证 实 。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4）GeneXpert( 多色巢式定量PCR)检测技术3

19、6基于核酸扩增的一步法利福平耐药检测Xpert TM MTB/Rif技术平台 利福平的耐药性分析 喹诺酮类药物耐药性 HIV 病毒载量分析自动化得标本处理和检测，可以在2小时内出结果二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4）GeneXpert( 多色巢式定量PCR)检测技术3838 结核分枝杆菌菌株水平鉴定最早采用生化分析、血清学技术和噬菌体分型等技术进行分析，但由于这些方法的局限性而未得到广泛应用。 基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等感染性疾病进行检测的一个强有力的手段，可以进行结核菌传播的研究，结核病实验室交叉污染的研究，判断结核再感染或复发以及国际间传播的研究。二、二

20、、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5）分子分型技术3939 简单介绍以下三种分型技术：（1）插入序列 6110 限制性片段长度多态性分析：IS6110（2）直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：间隔寡核苷酸分 型( spacer oligonucleotide typing ,Spoligotyping)（3）分枝杆菌分散重复单元-可变数目串联重复序列： (mycobacterial interspersed repetitive units-variable number tandem repeats, MIRU-VNTR)二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3、分子生物学（5）分子分

21、型技术4040插入序列 6110 限制性片段长度多态性分析： IS6110是一个只存在于结核分枝杆菌复合群基因组中的插入序列，长度为1355bp，具有高度的保守性，属于IS3家族。不同结核菌株IS6110的数目和位置不同。在IS6110序列中，限制性内切酶PvuII的酶切位点只有一个，经酶切后产生大小两个不同的片段，再与只针对酶切位点右侧的245bp探针杂交，则杂交后产生的条带数即为菌株IS6110拷贝数。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5）分子分型技术4141插入序列 6110 限制性片段长度多态性分析：IS6110这种方法存在一定的缺陷：对于基因组中IS6110低拷贝6或缺陷的

22、分辨能力有限；需要大量的基因组DNA，操作步骤繁琐且工作量大；各实验室所采用的IS6110-RFLP分型方法的标准不统一，不同实验室的IS6110-RFLP分型结果难于进行比对。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5）分子分型技术4242直接重复片段及寡核苷酸多态性分型： 基于直接重复区（RD区）的多态性。DR区只出现于结核分枝杆菌复合群中。由若干个保守的长为36bp的直接重复序列组成，并被非重复序列即间隔区分开。每隔间隔区序列长为34-41bp。通常间隔区的顺序在所有菌株都是相同的，但可能发生某一间隔区的插入或缺失，因此利用Spoligotyping就可以对结核分支杆菌进行株水平的鉴

23、定。 可以区分结核分枝杆菌复合群和M.bovis以及M.bovis BCG二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5）分子分型技术4343直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：Spoligotyping该方法对菌株的分辨能力明显弱于IS6110一RFLP方法，特别是不能有效分辨北京家族菌株，而在我国目前流行的结核菌株中，大约50%属于北京家族；同时与其他方法相比有高估菌株间流行病学联系的倾向。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3、分子生物学4444可变数目串联重复序列：MIRU-VNTR 该技术是近年发展起来的以PCR为基础的分型技术。MIRU为40-100bp的DNA元件，通常以串联

24、重复形式散步于结核分枝杆菌复合群基因中。H37Rv基因组中含41个MIRU区，其中有12个区具有多态性，其拷贝数在不同菌株之间12个区拷贝数在不同菌株之间存在差异。MIRU技术利用不同菌株之间这12个区拷贝数的差异达到鉴定菌株的目的。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3、分子生物学4545可变数目串联重复序列：MIRU-VNTR 该方法操作简单 ,分辨率高 ,结果容易分析 ,具有很高的可重复性 ,在实验室内和实验室间具有非常好的可比性 ,并能提供数字化的分型信息 ,适宜于进行大量样本和网络化分析。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3、分子生物学（5）分子分型技术4646 DNA

25、测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况。已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐药基因的检测。 缺陷：专业设备，专业技术，限制其广泛应用。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法4、其他（1）DNA测序法4747在应用某项新技术时，需要考虑的一般性问题：是否有足够的经过培训的人员有效的实验室质量管理体制能否得到备用设备和耗材技术支持的可获得程度工作环境的条件 等等 二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法未来实验室的诊断模式 需要需要8-108-10周时间周时间 需要需要4 4天时间天时间患者标本患者标本分子方法分子方法传统方法传统方法菌种鉴定菌种鉴

26、定药敏试验药敏试验涂片涂片培养培养菌种鉴定和药敏试验菌种鉴定和药敏试验结核病实验室未来检测模式可疑结核病患者的标本涂片阳性或二者均阳性二者均阴性培养阳性基因分型复发再感染或流行规律研究快速药敏试验利福平耐药利福平敏感耐药风险评估临床治疗方案耐药风险评估临床治疗方案快速菌种鉴定涂片未来实验室的诊断模式 以病人为中心的实验室诊断技术平台固体培养 监测 应急处置 网络建设主要筛查耐药 诊断治疗 主动发现 被动的病人发现 诊断治疗地市县区HIV/TB双重感染MDRTB/TB-MM省级萋尼 荧光涂片检查推荐耐药可疑者iLEDLAMP等手动分子诊断HIV/TB双重感染分子诊断MDRTB/TB-MM固体培养

27、分子诊断LPA等应急处置TB疫情监测传统方法/新诊断技术确定治疗方案51The End 1、细菌学方法（抗酸染色双目显微镜、固体或液体培养）5252一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法培养on plates or in broth identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony显微镜检查脱色复染染色unstained or stained with e.g. Gram stain 53 潜伏结核感染者的筛查 结核菌素PPD试验5454二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法1 1、细菌学检查 发光二极管（LEDLED）荧光显微镜光源寿命