魔芋硫酸多糖抗病毒

1、LOGO魔芋硫酸多糖抗病毒特性及作用机理魔芋硫酸多糖抗病毒特性及作用机理 结构表征结构表征 对对RNARNA病毒病毒CVBCVB3 3侵染侵染及及PVPV1 1复制的抑制研究复制的抑制研究 硫酸多糖抗病毒研究综述硫酸多糖抗病毒研究综述 魔芋硫酸多糖抗病毒作用魔芋硫酸多糖抗病毒作用特性及机理特性及机理制备及分离纯化制备及分离纯化 对对DNADNA病毒病毒HBVHBV胞内胞内表达的抑制研究表达的抑制研究 抗抗RNARNA病毒病毒IAVIAV的血凝的血凝效价及作用机理研究效价及作用机理研究 v第一部分第一部分 硫酸多糖抗病毒研究综述硫酸多糖抗病毒研究综述v 硫酸化多糖的抗病毒生物活性硫酸化多糖的抗病

2、毒生物活性 v 硫酸化多糖抗病毒构效关系硫酸化多糖抗病毒构效关系 v 硫酸化多糖抗病毒作用机理硫酸化多糖抗病毒作用机理 v 硫酸化多糖抗病毒临床应用硫酸化多糖抗病毒临床应用 1 1、硫酸化多糖抗病毒生物活性硫酸化多糖抗病毒生物活性1.1 1.1 抗单纯疱疹病毒（双链抗单纯疱疹病毒（双链DNADNA病毒）生物活性病毒）生物活性 藻类硫酸多糖、夏枯草多糖：抑制藻类硫酸多糖、夏枯草多糖：抑制病毒在初始阶段对宿主细胞的吸附病毒在初始阶段对宿主细胞的吸附 ；抗；抗凝活性低；无毒副作用。凝活性低；无毒副作用。1.2 1.2 抗艾滋病毒（单链抗艾滋病毒（单链RNARNA病毒）的生物活性病毒）的生物活性 香菇

3、多糖、葡聚糖及壳聚糖硫香菇多糖、葡聚糖及壳聚糖硫酸酯、海藻多糖：抑制病毒的吸附、酸酯、海藻多糖：抑制病毒的吸附、穿入及融合细胞的形成，亦可穿入及融合细胞的形成，亦可抑制抑制穿入后的复制。穿入后的复制。 1.3 1.3 抗其它病毒的生物活性抗其它病毒的生物活性牛膝多糖硫酸酯有很强的抑制乙型肝炎病牛膝多糖硫酸酯有很强的抑制乙型肝炎病毒抗原毒抗原HBsAgHBsAg和和HBeAgHBeAg的活性；的活性；金顶侧耳多糖经硫酸化修饰后，增强抗柯金顶侧耳多糖经硫酸化修饰后，增强抗柯萨奇病毒萨奇病毒B B5 5的活性；的活性；SPSSPS在体外对在体外对HBV-DNAHBV-DNA有较强的抑制效果；有较强的

4、抑制效果；角叉藻聚糖防止细胞单层被角叉藻聚糖防止细胞单层被EMCV(EMCV(脑心肌脑心肌炎病毒炎病毒) )破坏破坏 ，200g/mL200g/mL浓度无细胞毒性。浓度无细胞毒性。 2 2、硫酸化多糖抗病毒构效关系硫酸化多糖抗病毒构效关系2.1 2.1 分子量分子量 活性随分子量不断增大；先增大后减小；活性随分子量不断增大；先增大后减小；先增大后稳定。先增大后稳定。 硫酸多糖在保持生物活性的基础上，尽可硫酸多糖在保持生物活性的基础上，尽可能选择分子量较小的多糖，增强其吸收和利用能选择分子量较小的多糖，增强其吸收和利用率。率。 2.2 2.2 硫酸基硫酸基 1)1)硫酸基取代度硫酸基取代度 每二

5、糖单位硫酸基数量。每二糖单位硫酸基数量。引入硫引入硫酸基产生聚阴离子特性；引起多糖立体酸基产生聚阴离子特性；引起多糖立体结构的变化。结构的变化。一般地，硫酸根含量为每一般地，硫酸根含量为每个糖残基平均含个糖残基平均含1.51.52.02.0。2 2）硫酸基位置）硫酸基位置 C C2 2和和C C3 3位发生硫酸基取代有利于位发生硫酸基取代有利于产生抗病毒活性产生抗病毒活性 ；取代基的位置与活；取代基的位置与活性的关系受到主链结构的影响，使其对性的关系受到主链结构的影响，使其对抗病毒活性影响不大。抗病毒活性影响不大。2.3 2.3 多糖结构多糖结构 硫酸多糖活性与硫酸多糖活性与或或结构无关，结构

6、无关，与单糖种类无关，但与糖苷键的构型相与单糖种类无关，但与糖苷键的构型相关。关。 (13) (13)连接的多糖：连接的多糖：6-6-硫酸根硫酸根 (14) (14)连接的多糖：无影响连接的多糖：无影响 结合区构象的柔性结合区构象的柔性 ：链柔性降低，：链柔性降低，抗病毒活性升高抗病毒活性升高 3 3、硫酸化多糖抗病毒机理硫酸化多糖抗病毒机理3.1 3.1 抑制病毒吸附抑制病毒吸附 负电荷与病毒外膜糖蛋白上带正电负电荷与病毒外膜糖蛋白上带正电荷的氨基酸残基相互作用；荷的氨基酸残基相互作用； 结构上与细胞表面糖胺聚糖相类似，结构上与细胞表面糖胺聚糖相类似，以竞争抑制方式阻止病毒与细胞结合；以竞争

7、抑制方式阻止病毒与细胞结合； 细胞表面分子的模拟配体，直接与细胞表面分子的模拟配体，直接与细胞结合，阻碍病毒的吸附。细胞结合，阻碍病毒的吸附。 1 1）硫酸多糖聚阴离子与病毒表面正电荷分子结合硫酸多糖聚阴离子与病毒表面正电荷分子结合 硫酸多糖对硫酸多糖对HIVHIV作用机理与其对作用机理与其对HIV-1HIV-1病毒颗粒病毒颗粒向向CD4 T-CD4 T-细胞膜吸附阻断能力有关。硫酸多糖与病细胞膜吸附阻断能力有关。硫酸多糖与病毒毒gpl20gpl20糖蛋白正电荷区域结合，干扰了病毒颗粒与糖蛋白正电荷区域结合，干扰了病毒颗粒与细胞的吸附过程细胞的吸附过程 +2 2）硫酸多糖聚阴离子与细胞表面正电

8、荷分子结合硫酸多糖聚阴离子与细胞表面正电荷分子结合 硫酸多糖与糖蛋白上的正电荷区域作用，导致硫酸多糖与糖蛋白上的正电荷区域作用，导致区域的屏蔽作用，阻止病毒与细胞表面的负电荷硫区域的屏蔽作用，阻止病毒与细胞表面的负电荷硫酸类肝素的结合，抑制病毒吸附并穿透细胞的过程。酸类肝素的结合，抑制病毒吸附并穿透细胞的过程。 胞内病毒颗粒的放射标签胞内病毒颗粒的放射标签 RT-PCRRT-PCR定量定量 3.2 3.2 抑制病毒穿入、脱壳抑制病毒穿入、脱壳 卡拉胶作用的病卡拉胶作用的病毒颗粒不能从膜包毒颗粒不能从膜包裹的囊泡结构即内裹的囊泡结构即内体释放，从而抑制体释放，从而抑制了病毒穿入细胞后了病毒穿入细

9、胞后脱壳的过程。脱壳的过程。 3.3 3.3 抑制病毒复制、表达抑制病毒复制、表达1 1）RNARNA病毒病毒 硫酸化侧链与硫酸化侧链与RNARNA病毒模板引物病毒模板引物上的酶具有相同的上的酶具有相同的结合位点，产生竞结合位点，产生竞争性抑制作用。争性抑制作用。 抑制重组抑制重组HIV-lHIV-l逆转录酶活性逆转录酶活性 抑制作用于病抑制作用于病毒蛋白质加工过程毒蛋白质加工过程的糖羟化酶的糖羟化酶 广谱的抗糖苷广谱的抗糖苷酶活性酶活性 2 2）DNADNA病毒病毒 研究较少，以研究较少，以乙肝病毒的乙肝病毒的DNADNA复复制抑制作用为主。制抑制作用为主。3.4 3.4 其它抗病毒机理其它

10、抗病毒机理 抑制抑制HIVHIV的合胞体形成的合胞体形成 硫酸化烷基寡糖的烷基部分与硫酸化烷基寡糖的烷基部分与表面活性剂类似，与病毒囊膜脂双表面活性剂类似，与病毒囊膜脂双层作用，破坏其囊膜层作用，破坏其囊膜 调节细胞膜的极性，抑制病毒调节细胞膜的极性，抑制病毒与细胞膜的相互作用与细胞膜的相互作用 增强免疫系统功能增强免疫系统功能 4 4、硫酸化多糖抗病毒临床应用硫酸化多糖抗病毒临床应用4.1 4.1 硫酸多糖药物硫酸多糖药物 抗抗HIVHIV药物药物HoeHoeBay 946(1987Bay 946(1987年联邦德国研制年联邦德国研制) )，化学，化学成分是木聚糖硫酸酯，分子量成分是木聚糖硫

11、酸酯，分子量6000D6000D，平均每个单糖残基含，平均每个单糖残基含有有1.81.8个硫酸根。个硫酸根。HoeHoeBay 946Bay 946为一种蛋白激酶为一种蛋白激酶C C抑制剂，抑制剂，主要干扰主要干扰HIVHIV穿透进入穿透进入CDCD4 4细胞。细胞。 4.2 4.2 存在问题存在问题 1 1）分子量：分子质量较大，不能达到治疗组织。）分子量：分子质量较大，不能达到治疗组织。 2 2）抗凝血：）抗凝血：强阴离子性表现抗凝血活性。强阴离子性表现抗凝血活性。 v第二部分第二部分 魔芋硫酸多糖抗病毒作用特性及机理研究魔芋硫酸多糖抗病毒作用特性及机理研究v 制备及分离纯化制备及分离纯化

12、 v 结构表征结构表征 v 对对RNARNA病毒病毒CVBCVB3 3侵染及侵染及PVPV1 1复制的抑制作用研究复制的抑制作用研究 v 对对DNADNA病毒病毒HBVHBV胞内表达的抑制作用研究胞内表达的抑制作用研究 v 抗抗RNARNA病毒病毒IAVIAV的血凝效价及作用机理研究的血凝效价及作用机理研究 低聚低聚KGMKGMKGMKGM醛酸醛酸 KGMKGM醛酸丙酯醛酸丙酯HOG HOG KGMKGM醛酸丙酯硫醛酸丙酯硫酸酯酸酯 HOGSHOGSR R1010酶酶切魔酶酶切魔芋葡甘聚糖芋葡甘聚糖低聚低聚KGMKGM加一定加一定比例的盐酸、比例的盐酸、过氧化氢过氧化氢 低聚低聚KGMKGM醛

13、酸醛酸加入一定量加入一定量的环氧丙烷的环氧丙烷 氯磺酸氯磺酸- -甲酰甲酰胺法硫酸化胺法硫酸化第一章第一章 制备及分离纯化制备及分离纯化一、硫酸化工艺流程一、硫酸化工艺流程肝素肝素 最初从肝脏和心脏提取得到，由于肝脏中的含量最为丰富，最初从肝脏和心脏提取得到，由于肝脏中的含量最为丰富，故得此名。实际上它广泛分布于哺乳动物组织和体液中。猪故得此名。实际上它广泛分布于哺乳动物组织和体液中。猪肠粘膜中含量十分丰富，肺、脾和肌肉中含量亦很高，肾、肠粘膜中含量十分丰富，肺、脾和肌肉中含量亦很高，肾、胸腺和血液中的含量则比较少些。胸腺和血液中的含量则比较少些。 肝素的化学结构比较复杂，它是由肝素的化学结构

14、比较复杂，它是由 D D- -葡糖胺和葡糖胺和L L- -艾杜糖醛酸艾杜糖醛酸或或D D- -葡糖醛酸构成的二糖单位的多聚物。葡糖醛酸构成的二糖单位的多聚物。 肝素的生物学作用是抗凝血和加速血浆中三酰甘油的清除。肝素的生物学作用是抗凝血和加速血浆中三酰甘油的清除。目前输血时，广泛以肝素为抗凝剂，临床上也常用于防止血目前输血时，广泛以肝素为抗凝剂，临床上也常用于防止血栓形成。栓形成。v 1 1、717717阴离子树脂离子交换层析图阴离子树脂离子交换层析图二、二、HOGSHOGS纯化方法纯化方法v 2 2、 HOGS HOGS糖酯和硫酸基含量测定糖酯和硫酸基含量测定 葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线

15、硫酸基标准曲线硫酸基标准曲线 v 1 1、葡聚糖凝胶层析鉴定、葡聚糖凝胶层析鉴定三、三、HOGSHOGS纯度鉴定纯度鉴定葡聚糖凝胶层析洗脱曲线葡聚糖凝胶层析洗脱曲线v 2 2、醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳鉴定鉴定 醋酸纤维素薄膜上面显示单一蓝色的条醋酸纤维素薄膜上面显示单一蓝色的条带，表明所得的糖的组分比较均一。带，表明所得的糖的组分比较均一。 v 3 3、高效液相色谱鉴定高效液相色谱鉴定 1.1. 魔芋葡甘低聚糖丙酯魔芋葡甘低聚糖丙酯 2. 2. 魔芋葡甘低聚糖丙酯硫酸酯魔芋葡甘低聚糖丙酯硫酸酯 3. 3. 反应副产物反应副产物 HOGSHOGS纯品（纯品（a a）和粗品（）和粗品（

16、b b）高效液相色谱图）高效液相色谱图 v HOGSHOGS及相关物质的含量及相关物质的含量 第二章第二章 结构表征结构表征 本章结构表征的重点在于本章结构表征的重点在于HOGSHOGS的分子量分布、表面的分子量分布、表面S S元素的定量和存在方式、硫酸基的取代位置。元素的定量和存在方式、硫酸基的取代位置。 一、一、HOGSHOGS单糖组成单糖组成15 20 25 20 25 time (min) 面积归一化面积归一化法计算两单糖的法计算两单糖的组成摩尔比为组成摩尔比为Man:GluMan:Glu=1.8:1=1.8:1 二、二、HOGSHOGS分子量分布分子量分布HOGSHOGS凝胶渗透色谱

17、图凝胶渗透色谱图 凝胶渗透色谱图呈正态分布，凝胶渗透色谱图呈正态分布，多分散系数多分散系数Mw/Mw/MnMn=1.01=1.01，相对分，相对分子质量峰值子质量峰值MpMp为为1608D1608D，重均相对，重均相对分子质量分子质量MwMw为为1595D1595D，数均相对分，数均相对分子质量子质量MnMn为为1572D1572D。相对分子质量。相对分子质量分布宽度指数分布宽度指数nn为为3.623.6210 10 ，HOGSHOGS纯品为相对分子质量分布较纯品为相对分子质量分布较窄的硫酸化多糖。窄的硫酸化多糖。 三、三、HOGSHOGS红外光谱分析红外光谱分析 KGMKGM（a a）、）、

18、HOGHOG（b b）和）和HOGSHOGS（c c）红外光谱图）红外光谱图 HOGSHOGS在在1148cm 1148cm 处的强吸收峰，表明有处的强吸收峰，表明有-OSO3-OSO3-的的S=OS=O伸缩振动，在伸缩振动，在834.1cm834.1cm 处的强吸收峰，显示处的强吸收峰，显示有有C-O-SC-O-S键的伸缩振动，表明已形成硫酸酯。键的伸缩振动，表明已形成硫酸酯。 KGMKGM、HOGHOG和和HOGSHOGS的红外光谱吸收峰归属的红外光谱吸收峰归属 -1-1-1-四、四、HOGSHOGS激光拉曼光谱分析激光拉曼光谱分析 HOGHOG激光拉曼光谱图激光拉曼光谱图 HOGSHOG

19、S激光拉曼光谱图激光拉曼光谱图CmCm-1-580580 处出现一新峰，表明有部分醚键以处出现一新峰，表明有部分醚键以R-O-CH2-O-R-O-CH2-O-R R形式存在。形式存在。HOGSHOGS在在13641364，12521252，580580 处处-SO2-SO2-O O特征吸收峰略有加强，特征吸收峰略有加强，826826 处出现的一个新峰为处出现的一个新峰为S=OS=O伸缩振动，充分表明已连接硫酸基团。伸缩振动，充分表明已连接硫酸基团。 HOGHOG和和HOGSHOGS的激光拉曼光谱吸收峰归属的激光拉曼光谱吸收峰归属 -1-1-1-1-1-1-1-1-1-五、五、HOGSHOGS的

20、的X X射线射线光电子能谱光电子能谱分析分析 0500010000150002000025000300000200400600800Binding Energy/eVRelativelyIntensity/(c/s）O1sC1s02 0 0 04 0 0 06 0 0 08 0 0 01 0 0 0 01 2 0 0 01 4 0 0 01 6 0 0 01 8 0 0 02 0 0 0 002 0 04 0 06 0 08 0 0B i n d i n g E n e r g y / e VRelativelyIntensity/（c/s）O 1 sC1sS2sS2pHOGHOG的的XPSX

21、PS谱图谱图 纯化前纯化前HOGSHOGS的的XPSXPS谱图谱图 HOGSHOGS纯品的纯品的XPSXPS谱图谱图 HOGHOG的的C C元素相对含量为元素相对含量为70.41%70.41%，O O元素相对含量为元素相对含量为29.59%29.59%；HOGSHOGS的的C C元素相对含量为元素相对含量为49.75%49.75%，O O元素相对含量为元素相对含量为42.31%42.31%，S S元素相对含量为元素相对含量为7.94%7.94%。纯化前。纯化前HOGSHOGS的的S S元素相对含量为元素相对含量为41.21%41.21%；HOGSHOGS纯品的纯品的 S S元素相元素相对含量为

22、对含量为58.79%58.79%。数据和图谱分析表明，纯化后。数据和图谱分析表明，纯化后HOGHOG上引入的上引入的S S元素含元素含量提高了约量提高了约40%40%。 0200400600800100012001400160165170175180Binding Energy/eVcounts per second 综合综合C C、O O、S S三元素的谱图，并对三元素的谱图，并对S2PS2P进行曲线拟合，进行曲线拟合，根据结合能数据分析，对于根据结合能数据分析，对于S S原子仅可能以原子仅可能以-OSO-OSO3 3-/SO-/SO3 3H H形形式存在，进一步说明式存在，进一步说明HOG

23、HOG被修饰为硫酸酯。被修饰为硫酸酯。 碳元素的碳元素的XPS谱图谱图 氧元素的氧元素的XPS谱图谱图 硫元素的硫元素的XPS谱图谱图 六、氢核磁共振波谱六、氢核磁共振波谱( H-NMR)( H-NMR)分析分析1 1HOGHOG的的 H-NMRH-NMR谱图谱图 HOGSHOGS的的 H-NMRH-NMR谱图谱图 1 11 第三章第三章 HOGSHOGS对对RNARNA病毒病毒CVBCVB3 3侵染及侵染及PVPV1 1复制的抑制作用复制的抑制作用 柯萨奇病毒柯萨奇病毒B B（CVBCVB） 小核糖核酸病毒科的人类小核糖核酸病毒科的人类肠道病毒，引起病毒性心肌炎肠道病毒，引起病毒性心肌炎主要

24、的病原体。主要的病原体。脊髓灰质炎病毒（脊髓灰质炎病毒（PVPV） 小核糖核酸类病毒，脊小核糖核酸类病毒，脊髓灰质炎的致病因子。髓灰质炎的致病因子。 一、一、HOGSHOGS的的HelaHela、VeroVero细胞毒性细胞毒性 正常细胞正常细胞 病变细胞病变细胞 不同浓度不同浓度HOGSHOGS对对HelaHela细胞细胞CPECPE的影响的影响 注：注：“-”-”表示细胞存活率表示细胞存活率1/41/4以下、以下、“+”+”表示细胞存活表示细胞存活率率1/41/41/21/2、“+”+”表示细胞存活率表示细胞存活率1/21/23/43/4、“+”+”表示细胞存活率表示细胞存活率3/43/4

25、以上。以上。 72h72h后的吸光度值及细胞相对增殖率后的吸光度值及细胞相对增殖率 对于对于HelaHela细胞，细胞，HOGSHOGS的半数中毒浓度的半数中毒浓度TCTC5050为为0.6670.6670.006mg/mL0.006mg/mL 不同浓度不同浓度HOGSHOGS对对VeroVero细胞细胞CPECPE的影响的影响 细胞的吸光度值细胞的吸光度值 细胞相对增殖率及毒性分级细胞相对增殖率及毒性分级 对于对于VeroVero细胞，细胞，HOGSHOGS的半数中毒浓度的半数中毒浓度TC50TC50为为1.541.540.003mg/mL 0.003mg/mL 二、二、HOGSHOGS中和

26、中和CBVCBV3 3、PVPV1 1病毒滴度的测定病毒滴度的测定 CVBCVB3 3与与HOGSHOGS中和前后病毒滴度的测定中和前后病毒滴度的测定 PVPV1 1与与HOGSHOGS中和前后病毒滴度的测定中和前后病毒滴度的测定 HOGS HOGS的平均灭活的平均灭活CVBCVB3 3的对数值为的对数值为1.0625,1.0625,平均灭活平均灭活率达到率达到82.2%; HOGS82.2%; HOGS的平均灭活的平均灭活PVPV1 1的对数值为的对数值为3.0625,3.0625,平均灭活率达到平均灭活率达到99.95%99.95%。 三、三、HOGSHOGS抗抗CBVCBV3 3作用特性

27、研究作用特性研究 HOGSHOGS抑制抑制CVBCVB3 3吸附细胞效果吸附细胞效果 HOGSHOGS对对CVBCVB3 3直接抑制作用效果直接抑制作用效果 HOGSHOGS对对CVBCVB3 3病毒吸附细胞的初始过程基本没有抑制作用；病毒吸附细胞的初始过程基本没有抑制作用；对对CVBCVB3 3具有一定的直接抑制作用，抑制效果不明显。具有一定的直接抑制作用，抑制效果不明显。 HOGSHOGS抑制抑制CVB3CVB3胞内复制效果胞内复制效果 HOGSHOGS阻断病毒侵染作用（阻断病毒侵染作用（4h4h） HOGSHOGS阻断病毒侵染作用（阻断病毒侵染作用（24h24h） HOGS HOGS抗抗

28、CVBCVB3 3的主要作用特性不是抑制病毒在胞内的复制；的主要作用特性不是抑制病毒在胞内的复制；对对CVBCVB3 3侵染细胞起到一定的阻断作用，即保护了宿主细胞不受侵染细胞起到一定的阻断作用，即保护了宿主细胞不受病毒的感染，且随着病毒的感染，且随着HOGSHOGS浓度的增加，保护作用增强，但随时浓度的增加，保护作用增强，但随时间的延长其阻断间的延长其阻断CVBCVB3 3的效果并未有明显增强。的效果并未有明显增强。 阻断病毒侵染细胞作用下阻断病毒侵染细胞作用下 直接抑制病毒作用方式下直接抑制病毒作用方式下 对对CVBCVB3 3的抑制率的抑制率 对对CVBCVB3 3的抑制率的抑制率 半数

29、抑制浓度及抑制指数结果显示，半数抑制浓度及抑制指数结果显示，HOGSHOGS阻断阻断CVBCVB3 3侵染侵染细胞即保护细胞的作用下，细胞即保护细胞的作用下，HOGSHOGS抗抗CVBCVB3 3活性为有效低毒且活性为有效低毒且TITI较高，说明其抑制效果更好。较高，说明其抑制效果更好。 四、四、HOGSHOGS抗抗PVPV1 1作用特性研究作用特性研究 HOGSHOGS抑制抑制PVPV1 1吸附细胞效果吸附细胞效果 HOGSHOGS对对PVPV1 1直接抑制作用效果直接抑制作用效果 HOGS HOGS对对PVPV1 1具有一定的直接灭活作用，但效果不明显，具有一定的直接灭活作用，但效果不明显

30、，呈剂量依赖性呈剂量依赖性; ;对对PVPV1 1吸附细胞的初始过程基本没有抑制作用。吸附细胞的初始过程基本没有抑制作用。 HOGSHOGS抑制抑制PVPV1 1胞内复制效果胞内复制效果 HOGSHOGS对细胞保护作用效果对细胞保护作用效果 HOGS HOGS抑制抑制PVPV1 1的主要作用特性是在的主要作用特性是在PVPV1 1进入细胞后，影响进入细胞后，影响PVPV1 1在细胞内的增殖在细胞内的增殖; HOGS; HOGS在较高浓度下，对细胞感染在较高浓度下，对细胞感染PVPV1 1也能也能起到一定的保护作用。起到一定的保护作用。 HOGSHOGS抗抗PVPV1 1最小有效浓度最小有效浓度

31、 CPECPE观察观察,PV,PV1 1作用作用VeroVero细胞细胞2h2h后，再加入后，再加入HOGSHOGS一组的细一组的细胞存活率明显高于另一组，说明胞存活率明显高于另一组，说明HOGSHOGS抗抗PVPV1 1的主要作用特性的主要作用特性是通过抑制病毒在胞内的增殖。随着是通过抑制病毒在胞内的增殖。随着HOGSHOGS浓度增加，抑制浓度增加，抑制作用也增强，最小有效浓度为作用也增强，最小有效浓度为0.0095mg/mL0.0095mg/mL。 柯萨奇病毒柯萨奇病毒B B（CVBCVB3 3） HOGS HOGS体外抗体外抗CVBCVB3 3病毒的主要病毒的主要作用特性是保护细胞，即阻

32、断作用特性是保护细胞，即阻断病毒对细胞的侵染。病毒对细胞的侵染。 HelaHela细胞表面有细胞表面有CARCAR表达表达HOGSHOGS可能封闭细胞表面的可能封闭细胞表面的CVBCVB3 3受体受体 脊髓灰质炎病毒（脊髓灰质炎病毒（PVPV1 1） HOGS HOGS体外抗体外抗PVPV1 1的主要作用特的主要作用特性是抑制性是抑制PVPV1 1病毒在胞内的增殖。病毒在胞内的增殖。 后续研究采用后续研究采用RT-PCRRT-PCR法检测法检测PVPV1 1的的RNARNA含量，进一步证实含量，进一步证实HOGSHOGS抑制病毒胞内复制的作用特性。抑制病毒胞内复制的作用特性。 五、小结五、小结

33、第四章第四章 HOGSHOGS对对DNADNA病毒病毒HBVHBV胞内表达的抑制作用胞内表达的抑制作用 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒(HBV)(HBV) 嗜肝双链嗜肝双链DNADNA病毒，但通过病毒，但通过一种一种RNARNA的中间产物进行复的中间产物进行复制。制。 一、一、HOGSHOGS的的HepGHepG2 2-2.2.15-2.2.15细胞毒性细胞毒性 1 1、3 3、5d5d后细胞的吸光度值后细胞的吸光度值 相对增殖率及细胞毒性分级相对增殖率及细胞毒性分级 HOGSHOGS最大无毒浓度为最大无毒浓度为1.0mg/mL1.0mg/mL，TCTC5050为为1.481.480.005mg/m

34、L0.005mg/mL 二、二、HOGSHOGS对对HBVHBV病毒病毒HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg表达的影响表达的影响 HBsAgHBsAg的吸光度的吸光度 HOGSHOGS对对HBsAgHBsAg表达的抑制率表达的抑制率 HOGSHOGS对对HBsAgHBsAg的抑制作用的抑制作用 HOGS HOGS的抑制的抑制HBsAgHBsAg表达的作用表现出显著的量表达的作用表现出显著的量效与时效关系。效与时效关系。HOGSHOGS对对HBsAgHBsAg的抑制效果要优于对的抑制效果要优于对照药物照药物IFN-2bIFN-2b，其半数有效浓度，其半数有效浓度ICIC5050为为0.26

35、75mg/mL0.2675mg/mL，抑制指数，抑制指数TITI为为5.525.52。 HBeAgHBeAg的吸光度的吸光度 HOGSHOGS对对HBeAgHBeAg表达的抑制率表达的抑制率 HOGSHOGS对对HBeAgHBeAg的抑制作用的抑制作用 各浓度各浓度HOGSHOGS对对2.2.152.2.15细胞培养上清液中细胞培养上清液中HBeAgHBeAg的抑制作用不明显。与的抑制作用不明显。与IFN-2bIFN-2b相比，相比，HOGSHOGS对对HBeAgHBeAg的抑制效果小于前者。的抑制效果小于前者。 三、三、HOGSHOGS对对HBV-DNAHBV-DNA复制的影响复制的影响 H

36、BV-DNAHBV-DNA标准品的标准品的RnRn- -循环数关系曲线循环数关系曲线 HBV-DNAHBV-DNA标准曲线标准曲线 曲线斜率为曲线斜率为-2.563-2.563，PCRPCR扩增效率为扩增效率为106.7106.7 ，PCRPCR反应对模反应对模板的扩增完全，可反映起始模板板的扩增完全，可反映起始模板RNARNA的浓度；扩增相关系数为的浓度；扩增相关系数为0.9990.999，各个浓度组的相关性好，可对病毒进行可靠的定量检测。，各个浓度组的相关性好，可对病毒进行可靠的定量检测。 胞内和胞外胞内和胞外HBV-DNAHBV-DNA的拷贝数的拷贝数 HOGS HOGS抑制胞内抑制胞内

37、DNADNA复制的效果优于对病毒颗粒复制的效果优于对病毒颗粒释放到细胞外过程的抑制效果。释放到细胞外过程的抑制效果。 HOGSHOGS对对HBV-DNAHBV-DNA的抑制率的抑制率 HOGSHOGS对对HBV-DNAHBV-DNA的抑制作用的抑制作用 HOGS HOGS对对HBV-DNAHBV-DNA复制和释放均具有一定抑制作复制和释放均具有一定抑制作用，且对胞内用，且对胞内DNADNA复制的抑制效果更显著。复制的抑制效果更显著。 四、小结四、小结乙肝病毒（乙肝病毒（HBV） HOGS HOGS对细胞培养上清中分对细胞培养上清中分泌的泌的HBVHBV抗原有较强的抑制作用，抗原有较强的抑制作用

38、，且均表现出对分泌且均表现出对分泌HBsAgHBsAg的抑制的抑制率高于对率高于对HBeAgHBeAg的抑制率。具体的抑制率。具体机理有待进一步研究。机理有待进一步研究。 HOGS HOGS对对HBV-DNAHBV-DNA在胞内的在胞内的复制和释放到胞外均具有一定复制和释放到胞外均具有一定抑制作用，且对胞内抑制作用，且对胞内DNADNA复制的复制的抑制效果更显著。提示它对抑制效果更显著。提示它对HBVHBV前基因组前基因组3.5kbRNA3.5kbRNA的逆转录有的逆转录有一定抑制作用。一定抑制作用。 第五章第五章 HOGSHOGS抗抗RNARNA病毒病毒IAVIAV的血凝效价及作用机理研究的

39、血凝效价及作用机理研究 甲型流感病毒甲型流感病毒(IAV)(IAV) 正粘病毒科单股负链正粘病毒科单股负链RNARNA病毒，转录和复制均在被感病毒，转录和复制均在被感染细胞的核内完成。染细胞的核内完成。 蛋白质血凝素蛋白质血凝素（haemagglutininhaemagglutinin，HAHA） 神经氨酸酶神经氨酸酶（neuraminidaseneuraminidase，NA)NA) 一、一、HOGSHOGS的的MDCKMDCK细胞毒性细胞毒性 MDCKMDCK细胞病变结果细胞病变结果 0.5mg/mL 0.5mg/mL以下浓度时，细胞病变率在以下浓度时，细胞病变率在50%50%以下，以下，

40、HOGSHOGS对细胞基本无毒性，其最大无毒浓度为对细胞基本无毒性，其最大无毒浓度为0.5mg/mL0.5mg/mL。 72h72h的吸光度值及细胞相对增殖率的吸光度值及细胞相对增殖率 HOGS HOGS在浓度为在浓度为0.5mg/mL0.5mg/mL以下时均无明显细胞毒性以下时均无明显细胞毒性作用，毒性等级为作用，毒性等级为1 12 2级；级；TCTC5050为为0.7680.7680.004mg/mL0.004mg/mL。 二、病毒滴度测定二、病毒滴度测定 72h72h病毒滴度的测定病毒滴度的测定 IAV IAV原液的稀释度为原液的稀释度为10 10 以上时，细胞病变率在以上时，细胞病变率

41、在50%50%以上，稀释度为以上，稀释度为10 10 以下时，病变率下降到以下时，病变率下降到50%50%以下，以下，Reed-Reed-MuenchMuench法计算其平均法计算其平均TCIDTCID5050对数值为对数值为4.684.68。 -4-4-5-三、三、HOGSHOGS体外分组抑制病毒血凝效价体外分组抑制病毒血凝效价 HOGSHOGS抑制抑制IAVIAV复制的作用复制的作用 HOGS HOGS与对照药物病毒唑抑制作用接近，能明显减与对照药物病毒唑抑制作用接近，能明显减轻病毒感染细胞后，在胞内增殖的过程。轻病毒感染细胞后，在胞内增殖的过程。HOGSHOGS对细胞保护作用对细胞保护作

42、用 HOGS HOGS对细胞感染流感病毒所起的保护作用不强，对细胞感染流感病毒所起的保护作用不强，不是通过与感染细胞表面的病毒受体作用来抑制病毒不是通过与感染细胞表面的病毒受体作用来抑制病毒侵染细胞的过程。侵染细胞的过程。 HOGS HOGS 直接抑制直接抑制IAV IAV 纯化的纯化的HOGSHOGS能显著降低病毒血凝效价，说明能显著降低病毒血凝效价，说明HOGSHOGS可能通过直接抑制病毒包膜蛋白的方式来减轻病毒可能通过直接抑制病毒包膜蛋白的方式来减轻病毒 对对细胞的感染。细胞的感染。 HOGSHOGS抑制抑制IAVIAV吸附细胞吸附细胞 HOGSHOGS组抑制组抑制IAVIAV血凝效价作用不明显，与病毒组比较，血凝效价作用不明显，与病毒组比较，血凝效价仅从血凝效价仅从512512下降到下降到192192，说明，说明HOGSHOGS抑制抑制IAVIAV的作用特的作用特性不是抑制病毒早期吸附细胞的过程。性不是抑制病毒早期吸附细胞的过程。 四、四、HOGSHOGS抗抗IAVIAV最小有效浓度最小有效浓度 HOGSHOGS对对MDCKMDCK细胞病变抑制作用最小有效浓度细胞病变抑制作用最小有效浓度 细胞先感染病毒，再加细胞先感染病毒，再加HOGSHOGS一组，