Flt3L及CCL5对primeboost免疫策略中抗原特异性免疫应答的增强及.

1、Flt3L 及 CCL5 对 prime/boost 免疫策略中抗原特异 性免疫应答的增强及抗肿瘤作用Answer a fool according to his folly.作者：刘春燕 , 郑龙, 尤红煜 , 张艳, 王俊霞 , 宋淑霞Throw away the apple because of the core.【摘要】目的：研究 Flt3L 与 CCL5 乍为联合佐剂在 prime/boost 免疫策略中对 HBc 抗原特异性免疫应答的增强及抗肿瘤作用。方法：将两种细胞因子 质粒与携带 HBc 抗原的 DNA 疫苗经肌内注射法共免疫小鼠,免疫 3 次后再用原 核表达的 HBc 颗粒蛋

2、白或 HBc DNAS苗加强，观察对稳定表达 HBcAg 的小 鼠黑色素瘤细胞（B16HBc的生长抑制作用；并分别采用 MTT 法检测荷瘤小鼠 脾淋巴细胞增殖、流式细胞术检测脾 CD8+T 淋巴细胞中 IFNY表达、ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清 IL2、IL4 含量及乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测特 异性 CTL杀伤活性。结果：与对照组相比，佐剂联合 DNA 疫苗免疫经蛋白加 强组（DDP/Adj）显著抑制肿瘤生长；佐剂联合 DNAS苗免疫组（DDD/Adj）及 DDP/Adj 组均可促进特异性淋巴细胞增殖反应（P0.05）,且 DDP/Adj 高于 DDD/Adj 组（P0.05） ;

3、 DDD/Adj 及DDP/Adj 组小鼠脾脏 CD8+T#巴细胞中 IFNY表达、IL2 表达水平及 CTL 杀靶活性均高于对照组（P0.01 或 P0.05）。结论：在prime/boost 免疫策略中,采用 Flt3L 与 CCL5 两种细胞因子联合应用可显著 促进荷瘤小鼠产生抗原特异性免疫应答及抗肿瘤作用 （） 。Knowledge will not be aquired without pain and application.【关键词】DNAS苗；Flt3L/CCL5/佐剂；小鼠；抗原特异性免疫应答；prime/boost 策略Abstract AIM：To investigate

4、 the immune enhancmentand antitumor effect of the recombinant plasmids pFlt3L and pCCL5 in DNA prime/protein boost regimens. METHODS：The mice werecoimmunized with HBcAg DNA vaccine and th e two cytokines DNA constructs byintramuscular injection forof 2 weeks. Then the mice wer e boosted withHBc part

5、icle proteins or DNA vaccines, respectively. The immune efficacy was evaluated by tumor growth curve. To furtherinvestigate the mechanism of inhibiting tum or growth, lymphocytes proliferationresponse and the number of IFNyproducing cells in splenocytes were measured byMTT or flow cytometry, respect

6、ively. The levels of IL2 and IL4 in supernatant of splenolymphocyte cultures were measured by ELISA. The CTLactivity of splenolymphocyte was detected with LDH release assay. RESULTS:Compared with negative con trol, DDP/Adj group significantly inhibit tumor growth; spthree times at an intervallenocyt

7、es proliferation response and the numbers of IFN 丫 produ cing cellsinDDD/Adj group and DDP/Adj group were significantlyhigher(P0.05 or P0.01). The levels ofIL2 in supernatant of splenolymphocyte cultures in DDD/Adj group and DDP/A dj group were alsomarkedly higher than that of negative co ntrol (P0.

8、05). The CTL activities in group of DD S/Adj and DDD/Adj werestronger than that of other groups ( P0.01 or P0.05). While, the CTL killing activity inDDS/ Adj group was over thatof DDD/Adj (P0.01 or P0.05). CONCLUSION:The significantTh1 response and specific CTL against B16HBc tumor cells are elicite

9、d by the combination of Fl t3L and CCL5 in the DNAprime/protein boost strategy.KeywordsDNA vaccines; Flt3L/CCL5/adjuvant;mouse; Agspecific immune response; prime/boost strategy摘 要 目的：研究 Flt3L 与 CCL5 乍为联合佐剂在 prime/boost 免疫策略中对 HBc 抗原特异性免疫应答的增强及抗肿瘤作用。方 法：将两种细胞因子质粒与携带HBc 抗原的 DNAS苗经肌内注射法共免疫小 鼠,免疫 3 次后再用

10、原核表达的 HBc 颗粒蛋白或 HBc DNA 疫苗加强，观察对 稳定表达 HBcAg 的小鼠黑色素瘤细胞(B16HB)的生长抑制作用；并分别采 用 MTT 法检测荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖、流式细胞术检测脾CD8+T 淋巴细胞中 IFNY表达、ELISA 法检测脾淋巴细胞培养上清 IL2、 IL4 含量及乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性 CTL 杀伤活性。结果：与对照组相比,佐剂联合 DNA 疫苗免疫经蛋白加强组(DDP/Adj)显著抑制肿瘤生长；佐剂联合 DNA 疫 苗免疫组(DDD/Adj)及 DDP/Adj 组均可促进特异性淋巴细胞增殖反应(P0.05),且 DDP/Adj 高于 DD

11、D/Adj 组(P0.05) ; DDD/Adj 及 DDP/Adj 组小鼠脾脏CD8+T#巴细胞中 IFNY表达、 IL2 表达水平及 CTL 杀 靶活性均高于对照组 (P0.01 或P0.05)。结论：在 prime/boost 免疫策略中，采用 Flt3L 与 CCL5 两种 细胞因子联合应用可显著促进荷瘤小鼠产生抗原特异性免疫应答及抗肿瘤作 用。关键词DNA 疫苗；Flt3L/CCL5/佐剂；小鼠;抗原特异性免疫 应答；prime/boost 策略质粒 DNA 诱导的免疫应答依赖于树突状细胞（dendritic cells, DC 的存在,抗原注射部位 DC 的数量及功能状态直接 影响

12、免疫应答的强弱1。而在非炎症性的非淋巴组织,DC 数量很少,限 制了 DNA 疫苗的免疫效果。细胞因子 Flt3L 能够刺激 DC 细胞的增殖2, 3 ;趋化因子 CCL5 不仅可募集未激活的 CD4+己忆 T 细胞、 刺激 CD4+T 和 CD8+T勺活化,而且参与不成熟 DCs 细胞的募集、促进 Th1 偏移的Th1 型细胞因子（IL2 , IFN）的产生4, 而 Flt3L 与 CCL5 协同 DNA 疫 苗的研究还未见报道 （ 医药学/ 临床医学论文 ） 。近期的研究结果已证实 , 经 DNA 初次免疫后，再用不同类型的抗原进行加强免疫的prime/boost 免疫策略是一种理想的免疫

13、方法 , 该方法诱导的免疫应答是针对不同抗原形式中相同的 抗原表位5。我们采用经携带 HBc 抗原的 DNA 疫苗初免及原核表达的 HBc 颗 粒蛋白加强免疫的“ PrimeBoost”免疫方案免疫小鼠,同时以真核表达载体 pFlt3l 和 pCCL5f 乍为佐剂，研究细胞因子 Flt3L 与趋化因子 CCL5 联合应用在 prime/boost 免疫策略中对稳定表达HBcAg 的小鼠黑色素瘤细胞（B16HBc 细 胞）攻击的免疫保护作用及对携带 HBc 抗原的 DNA 疫苗诱导的抗原特异性免疫 应答的促进乍用。1材料和方法1.1材料 真核表达载体 pFlt3L 、pCCL5、 pHBc 均由

14、本室构建；大肠杆菌 BL21 （DE3 及 pET28aHBc 重组质粒、B16HBc 稳转细胞（稳定表达 HBcAg 的小鼠黑色素瘤细胞）由本室保存；MTTConA 为天根公司产品；LDH 试剂盒购自 Roche 公司；FITC 标记的抗小鼠 IFN 丫单克隆抗 体（mAb购自 eBioscienee 公司,PE 标记的抗小鼠 CD8 抗体购自 Invitrogen 公司；IPTG 为 Sigma产品；BFA 为晶美公司产品；小鼠 IL2、 IL4 检测试剂盒购自中晶公司。雄性 C57BL/6小鼠,46 周 龄, 由河北医科大学动物中心提供。He that runs fastest gets

15、 the ring.1.2方法1.2.1DNAS苗及蛋白的制备及鉴定（1）重组真核表达载体的制备及鉴定：Flt3L 及 CCL5 基因的扩增与纯化：参照 RNA exregent 说明提取 C57BL/6 小鼠骨髓及 Co nA 刺激的外周血单个核细胞的总 RNA,常规反转 录后,用P1、 P2 及 P3 P4 引物扩增 Flt3L 及 CCL5 全长基因。P1:5 cgggatcctcacaggcatgaggggtccc3 (BamH I),P2:5 gctctagagggatgggaggggaggggcacc3 (Xba I);P3:5 cgggatccAtga aggtctccgcggc

16、agcc3 (BamH I);P4:5 gctctagactcatctccaaagagttgatgtac3 (XbaI),PCF 产物经鉴定后胶回收纯化。pFlt3L 及 pCCL5 重组真核表达载体的构建：取经 BamH I 和 Xba I 双酶切 Flt3L 或 CCL5 的 RTPC 产物和相同内切 酶酶切的载体 pcDNA3.1/V5His 质粒 DNA, 16C连接过夜，转化 TOPO1 感受 态细胞，双酶切筛选阳性重组克隆，DNA 测序测定。(2)HBc 颗粒蛋白制 备：将本制备的携带 pET28aHBd组质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3 培养于 2XYT 培养基并培养至 A60

17、0=0.75, 加入终浓度为0.1 mmol/L 的 IPTG 于 37C诱导 6 h,离心收集菌体并超声破碎，然后再次离心得到包涵体。用 0.5 mol/L 尿素洗 1 次, 然后用 2 mol/L 尿素将包涵体溶解 , 在变性条件 下经 Ni2+柱亲和层析纯化 HBc 蛋白，按常规方法进行蛋白复性4。将蛋白 颗粒吸附到 200 目铜网 , 磷钨酸染色后经透射电镜观察。1.2.2小鼠免疫程序及肿瘤接种将 C57BL/6 小鼠随机分为 4组，每组 5 只。第 1 组(control 组)注射 pcDNA3.1/V5His 空质粒，第 2 组(DDD 组)于小鼠股四头肌肌内注射 pHBc DNA

18、 疫苗 100 卩 g/只，第 3 组(DDD/Adj 组)和第 4 组(DDP/Adj 组)注射 pHBc DNA 疫苗时同时注射两种佐 剂 pFlt3L及 pCCL5 各 50 卩 g/只，DDP/Adj 组在本次免疫注射原核表达的 HBc 颗粒蛋白 100 卩 g/只加强免疫。质粒总量为 200 卩 g/只，不足者用pcDNA3.1/V5His 补齐，总体积为 150 卩 L/只。免疫程序为0 、 2 、 4、 6 周。末次免疫后第 4 天, 小鼠右腋窝皮下注射0.1 mLB16HBc 稳转细胞 (1X106),接瘤后第 19 天，按常规方法进行小鼠脾淋巴细胞制备。1.2.3淋巴细胞增殖

19、试验 常规无菌分离脾细胞 , 并调整细胞 密度5X109/L,按每孔 100 卩 L 加入 96 孔细胞培养板中，分别于试验孔中 加入原核表达的终浓度为 20g/L 的 HBc 颗粒蛋白，同时设未加蛋白的阴性对 照，每组设 3 个复孔。MTT 法检测淋巴细胞增殖，用刺激指数(SI)表示细 胞增殖活性，SI=A 实验孔/A 对照孔。You never know what you can do till you.1.2.4流式细胞术检测细胞因子 INF 丫常规分离免疫小鼠脾淋巴细胞，调整细胞密度为1X1010/L, 加至 24 孔板，500 卩 L/孔，分别加入 HBc 颗粒蛋白(终浓度 10 m

20、g/L)和 10 卩 g/L IL2, 每组 3 复孔，设不 加 HBc 颗粒蛋白的为对照组。培养 72 h ,加入BFA 10mg/L, 孵育 2 h , 收集细胞, 常规流式细胞术检测表达量 6。I know no such thing as genius, it is nothing but labour and diligence.1.2.5ELISA 法检测细胞因子 IL2, IL4 常规分离脾淋巴 细胞，调整细胞密度为 1X1010/L, 加至 24 孔板，1 mL/孔,分别加入HBc 颗粒蛋白（10 mg/L）,每组 3 复孔,设不加 HBc 颗粒蛋白的为对照组。 培养 72 h

21、后,ELISA 检测细胞因子表达,按试剂盒说明操作。根据标准品 所测 A 值，绘制浓度、A 值相关标准曲线。测 A492 值并参照浓度曲线, 测定表达量。1.2.6乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测特异性 CTL 活性 调整脾淋巴细胞密度至 1x1010/L, 加入 6 孔板，用 50 mg/L 的丝裂酶素 C 灭活后 的 B16HBC细胞与免疫小鼠脾细胞共孵育，同时加入 2 万 U/L 的重组小鼠 IL2 及 10 mg/L 的 ConA,于第 3 天和第 5 天分别换液，并补充新鲜 IL2。于第 7 天收集细胞作为效应细胞，用B16HBC 稳转细胞作为靶细胞，效应细胞：靶 细胞为 50： 1。

22、同时设靶细胞自发释放孔和靶细胞最大释放孔。CTL 活性按以下公式计算：CTL 杀伤率=（实验组释放量-自发释放量）/ （最大释放量-自发释 放量）x100%。1.2.7统计学分析采用 SPSS10.0 统计软件进行方差分析和 t检验。2结果2.1DNAS苗及蛋白的制备及鉴定提取 C57BL/6 小鼠骨髓及Co nA 刺激的外周血单个核细胞的总 RNA,经 RTPCR 勺方法成功地克隆得到 708 bp 的Flt3L 及 271 bp 的 CCL5 基因 ,与预计编码基因大小一致（图 1A） ; 将该产物分别克隆到载体 pcDNA3.1/V5His, 经酶切鉴定, 电泳结果 可见在大约 5 50

23、0 bp 和 708 bp 处及 5500 bp 和 271 bp 处分别出现 2 条带，与预期结果相同；测序结果显示与 GenBank 提供的氨基酸序列完全一 致（图 1B）。SDSPAG 分析结果表明，携带原核表达载体pET28aHBC 的大肠杆 菌经 IPTG 诱导后高水平表达 HBc 蛋白（图 1C）。因该蛋白带有 His 标签，经 Ni2+亲和层析柱纯化后蛋白纯度达 95%以上。经 Western blot 结果显示，纯 化后的 HBc 蛋白 Mr 在 21000 出现条带（图 1D）,经进一步复性形成了在电镜下可见的大小均匀的蛋白颗粒（图 1E）。2.2佐剂联合 DNA 疫苗初免经

24、蛋白加强显著抑制肿瘤生长以荷瘤鼠为模型 , 末次免疫后第 4 天,小鼠右腋窝皮下注射 0.1 mL B16HBc稳转细胞 (1X106), 接瘤后第 19 天，测量肿瘤体积(mm3 =宽 2X长12。结果显示,control 组及 DDDS 肿瘤体积呈进行性生长,DDD/Adj 组和 DDP/Adj 组肿瘤生长缓慢 , 其中 DDP/Adj 组肿瘤生长最慢 , 体积最小( P0.05)。2.3佐剂联合 DNA 疫苗初免经蛋白加强免疫促进抗原特异性淋巴细胞增殖免疫小鼠脾淋巴细胞在体外经终浓度为10 mg/L 的 HBc 颗粒蛋白刺激后,除 DDDfi的增殖活性(1.014 0.035 )外,其余

25、各组均明显高于对照 组(1.2230.068、1.3980.027 vs 1.0030.012,P0.05) ; 且DDP/Adj 组增殖活性明显高于DDD/Adj (1.3980.027 vs 1.2230.068,P0.05)。2.4佐剂联合 DNA 疫苗经蛋白加强免疫诱导产生 Th1 型细胞因子免疫小鼠脾细胞经 HBc 颗粒蛋白再次体外刺激后，诱生细胞因子检测结果见表 1,与空质粒组比,DDD/Adj 组及 DDP/Adj 组脾 CD8+T 淋巴细胞中 IFNY表达显著增高(P0.01);为了进一步研究 Th1 型偏移情况,我们用ELISA 方法检测了各组脾淋巴细胞培养上清中 IL2、

26、IL4 水平。与空质粒组和 DDDS相比,DDD/Adj 及 DDP/Adj 组 IL2 水平显著增高(P0.05), 且 DDP/Adj 组 IL2 水平高于其他各组( P0.05)。 表 1脾 CD8+T#巴细胞 IFNY表达及脾淋巴细胞培养上清中 IL2, IL4 水平2.5佐剂联合 DNA 疫苗初免经蛋白加强免疫明显提高了CTL 活性本结果显示,DDD/Adj 组及 DDP/Adj 组杀伤效果显著高于对照组及 DDD组(P0.05 或 P0.01), 而对照组与 DDDfi杀靶活性无统计学意义。DDP/Adj 组杀伤效果显著高于 DDD/Adj 组(P0.05,图 3)。论文教育信息网

27、 http:/3讨论使用细胞因子和趋化因子作为佐剂增加或募集抗原注射部位的DC 细胞, 是促进抗原摄取和免疫应答有效的方法 7。已有研究者将细胞因子或 趋化因子基因与其他一些免疫调节分子基因联用作为佐剂 , 如 GMCSF 联合 Flt3L 或 IL12, 或 Flt3L联合 MIPa协同核酸疫苗进行免疫,可有效地募 集 DC 细胞到达抗原注射部位,获得较好的免疫效果7。研究证实 Flt3L 和 CCL5 即是十分有效的免疫调节因子,同时又具有抗肿瘤作用8, 9。本实 验中,我们成功构建了真核表达质粒 pFlt3L 和 pCCL5,并制备了表达 HBc 抗 原的真核表达质粒 pHBc 和 HB

28、c 颗粒蛋白,观察了以细胞因子 Flt3L 与趋化因 子 CCL5 乍为佐剂联合应用在 prime/boost 免疫策略中能否促进 HBc 抗原特异性 免疫应答及抗肿瘤免疫保护作用。小鼠抑瘤实验结果显示,Flt3L 和 CCL5 联合 DNA 疫苗初免经蛋白加 强免疫在体内显著抑制表达 HBc 的 B16 肿瘤生长，肿瘤细胞接种的第 19 天，DDP/Adj 组小鼠肿瘤体积约为 888.5 mm3,为对照组肿瘤体积的 1/5, DDP/Adj 组肿瘤体积也明显小于 DDD及 DDD/Adj 组（P0.01 或P0.05）。上述结果说明，Flt3L 和 CCL5 细胞因子联合应用在 prime/

29、DNAprotein/boost免疫策略中可以显著提高机体的抗肿瘤乍用。T 细胞增殖试验结果显示，细胞因子联合疫苗经蛋白加强免疫（DDP/Adj 组）后，小鼠脾淋巴细胞体外经抗原再次刺激，其增殖活性明显 高于单独核酸疫苗免疫组 , 且该细胞增殖活性是抗原特异性的。 Flt3L 和 CCL5 联用还可以诱导Th1 型细胞分化,与单独 DNAS苗组比,DDP/Adj 及 DDD/Adj 组均能诱导出针对 B16HBc肿瘤细胞的特异性杀伤 , 杀伤率分别为 38.7%和 30.4%, 均高于对照组 （P0.01 或P0.05）, 且 DDP/Adj 组也显著高于 DDD/Adj 组（P0.05）。进

30、一步分析荷瘤小鼠脾脏 T 淋巴细胞 IFN 丫、 IL2 的 产生及 CTL 活性，结果与 T 淋巴细胞增殖结果一致，而Flt3L 与 CCL5 对 IL4 的产生并无明显影响。该结果表明 Flt3L 和 CCL5 不仅显著促进抗原特异性免疫 应答,而且可诱导 T 淋巴细胞向 Th1 偏移。综合本实验结果和文献报道,Flt3L 与 CCL5 增强 DNAS苗抗肿瘤及 抗原特异性免疫应答的可能机制为：CCL5 促进不成熟 DC 浸润,Flt3L 诱导 DC 增殖，其结果使抗原注射部位的 DC 数量增加。不仅如此，细胞因子 CCL5 还明显促进 DC 到引流淋巴结的迁移和 CD86 MHC II

31、的表达，对 DC 的成熟 具有促进作用4。DDD/Adj 组、DDP/Adj 组产生的高水平内源性IFNY,可能与 Flt3L/CCL5 对 DC 的募集及活化有关。而 IFN 丫又可通过提高 CTL 活性对荷瘤宿主进行免疫调节，产生了较明显的抑瘤效果。另外，以往 的实验已证实，荷瘤宿主产生的内源性 IFNY可通过对肿瘤细胞进行免疫编辑 而提高宿主的抗肿瘤免疫10 ;IFNY还可通过影响肿瘤细胞凋亡相关基因 Fas及 RAIL的表达,对肿瘤细胞的增殖进行调控11。总之，该研究证实应用 Flt3L 和 CCL5 两种佐剂提高了 DNA 疫苗初免 的潜能，比单独 DNA 疫苗更有效的诱导出抗原特异

32、性的免疫应答，经蛋白加 强免疫后 , 诱导出免疫记忆 , 较未应用细胞因子初免组产生更强的抗 B16HBc 细胞的攻击。本研究结果在prime/boost 免疫策略中联合细胞因子进行初免的 方法将为今后疫苗的发展提供新的形式和理论基础。【参考文献】1 Sumida SM, McKay PF, Truitt DM, et al. Recruitmentand expansion of dendritic cells in vivo potentiate the im munogenicity of plasmid DNAvaccinesJ . J Clin Invest, 2004,114(9)

33、：1334-1342. 10 Dunn GP, Koebel CM, Schreiber RD. Interferons, immunit y and cancerimmunoediting J . Tumor Immunol, 2006, 6(11): 836-848.11Meng RD, ElDeiryWS. p53independent upregulationof KI2 王良华 , 熊 文, 邹红岩 . 影响的研究 J. 现代检验医学杂志Flt3 配体对培养的树突状细胞免疫表型 ,2004, 19(4): 7-8. 3 Brasel K, murinedendritic w cultures J .De Smedt T,cells fromBlood, 2000,Smith JL, et al. Generation offlt3ligandsupplemented bone marro 96(9):3029-3039.Ma K,Xu W, Shao XN,etal.Coimmunization withES plasmid polarized Th1 immunevirusenvelope via recru