第一章实验室及基本操作2014

1、第一章第一章 实验室及基本操作实验室及基本操作第一节第一节 组织培养实验室的建立组织培养实验室的建立第二节第二节 植物组织培养的一般技术植物组织培养的一般技术第一节第一节 组织培养实验室的建立组织培养实验室的建立在进行植物组织培养工作之前，在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件设备条件有个全面的了解，有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的实验室的大小大小取决于工作的取决于工作的目的目的和和规模规模 1. 以以工厂化生产工厂化生产为目的，实验室规模太小，为目

2、的，实验室规模太小， 则会限制生产影响效率。则会限制生产影响效率。 2. 在设计组织培养实验室时，应按在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序组织培养程序来设计，来设计， 避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。 植物组织培养是在严格植物组织培养是在严格无菌的条件无菌的条件下进行的，下进行的， 要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具， 同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。一、一、组织培养实验室布局的总体要求组织培养实验室布局的总体要求 便于便于隔离隔离 便

3、于操作便于操作 便于灭菌便于灭菌 便于观察便于观察二、构成二、构成 化学实验室（洗涤室）化学实验室（洗涤室） 接种室接种室 无菌无菌培养室培养室 灭菌室灭菌室 细胞学观测室（可以不设）细胞学观测室（可以不设）三、主要单元功能介绍三、主要单元功能介绍接种室接种室(外设缓冲间外设缓冲间)无菌接种箱无菌接种箱1. 无菌操作室无菌操作室 材料的材料的消毒消毒、接种接种，继代继代。 内置内置超净工作台超净工作台或或接种箱接种箱。 外设外设缓冲间缓冲间， 放置拖鞋、工作服、工作帽等。放置拖鞋、工作服、工作帽等。2. 培养室培养室满足材料的生长（光、热、水、气）。满足材料的生长（光、热、水、气）。 要求：要

4、求： 保温隔热；保温隔热； 控温、控光；控温、控光； 暗室暗室。 设备：培养架、设备：培养架、 加温设备、降温设备加温设备、降温设备3. 化学实验室化学实验室 器皿器皿的洗涤、干燥、保存；的洗涤、干燥、保存； 药品药品称量、溶解、称量、溶解、培养基培养基的配置；的配置； 植物材料预处理，培养材料的观察分析。植物材料预处理，培养材料的观察分析。 主要设备主要设备 工作台、药品柜、冰箱、烘箱、天平、工作台、药品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸馏水器蒸馏水器。 4. 灭菌室灭菌室 对对培养基培养基进行灭菌。进行灭菌。 5. 细胞学实验室细胞学实验室 培养材料的分析照相，培养材料的分析照相， 设备：显微镜、解

5、剖镜、染色设备。设备：显微镜、解剖镜、染色设备。基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁 架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室准备室缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室四、常用仪器设备四、常用仪器设备（一）仪器（一）仪器 1. 天平天平 1/10、1/100药物天平：大量元素、药物天平：大量元素、 蔗糖、琼脂。蔗糖、琼脂。 1/10000分析天平：维生素、分析天平：维生素、 激素、微量元素、微量附加物。激素、微量元素、微量附加物。 2. 灭菌锅灭菌锅 3. 烘箱（干燥箱）烘箱（干燥箱） 80-100：烘干物品、测定植物组织干物质

6、重。：烘干物品、测定植物组织干物质重。 150-160：干热灭菌（不超过：干热灭菌（不超过175）；）；4. 冰箱冰箱 有机试剂和母液的有机试剂和母液的储藏储藏； 细胞及其他材料的细胞及其他材料的冷藏保存冷藏保存； 植物材料的植物材料的处理处理（低（低 温打破休眠）。温打破休眠）。5. 酸度计酸度计 对培养基对培养基pH值进行调整。值进行调整。 （一般用（一般用pH4-7的精密试纸代替）的精密试纸代替）6. 双筒实体显微镜（解剖镜）双筒实体显微镜（解剖镜） 茎尖茎尖的剥取（分生组织）；的剥取（分生组织）； 对植物材料的对植物材料的隔瓶观测隔瓶观测。7. 蒸馏水器蒸馏水器 减小实验中的偶然因素。

7、减小实验中的偶然因素。8. 空调空调 温度变化差异不大。温度变化差异不大。蒸馏水器蒸馏水器9. 震荡培养机和旋转培养机震荡培养机和旋转培养机 液体培养。液体培养。10. 培养箱培养箱摇床摇床光照培养箱光照培养箱1. 玻璃器皿玻璃器皿 培养器皿培养器皿 原则：无毒透光；原则：无毒透光； 试管：试管：215，2.515，315。 三角瓶三角瓶：50ml，100ml，150ml，200ml。（主要用于继代培养）。（主要用于继代培养） 培养皿：培养皿：原生质体、游离细胞、花药等的培养；原生质体、游离细胞、花药等的培养； 无菌种子的萌发；无菌种子的萌发； 材料的分离；材料的分离； 无菌滤纸的消毒灭菌无菌

8、滤纸的消毒灭菌 封闭物封闭物防止培养基干燥和杜绝污染、无毒透气（防止培养基干燥和杜绝污染、无毒透气（棉塞棉塞、菌膜）、菌膜）（二）必要器皿（二）必要器皿盛装器皿盛装器皿 烧杯、试剂瓶，烧杯、试剂瓶， 药品的药品的溶解溶解和和储存储存。计量器皿计量器皿 量筒：量筒： 10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml。 容量瓶：容量瓶：25ml，50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml。 移液管：移液管：0.1ml，0.2ml，1ml，2ml，5ml，10ml。其他其他 漏斗漏斗 玻棒玻棒 滴瓶滴瓶2. 金属器皿金属器皿 镊子：镊子： 剪刀：剪刀：

9、分离器械：手术刀、芽接刀分离器械：手术刀、芽接刀 大量元素；大量元素；微量元素；微量元素；维生素、氨基酸等（有机附加物）。维生素、氨基酸等（有机附加物）。糖类：糖类：蔗糖蔗糖、葡萄糖等。、葡萄糖等。凝固剂：琼脂等。凝固剂：琼脂等。激素激素生长素类：生长素类：IAA、IBA、NAA、2，4-D。细胞分裂素类：细胞分裂素类：6-BA、KT、ZT赤霉素类：赤霉素类：GA3（三）常备药品（三）常备药品一、培养基及其配制一、培养基及其配制（一）概念（一）概念 培养基：外植体生长的营养物质。培养基：外植体生长的营养物质。 （二）种类（二）种类1. 根据水平根据水平 基本基本培养基培养基 大量元素和微量元素

10、、维生素和氨基酸，还有糖和水。大量元素和微量元素、维生素和氨基酸，还有糖和水。 完全完全培养基培养基 在基本培养基的基础上，附加在基本培养基的基础上，附加植物生长调节剂植物生长调节剂或有机附加物。或有机附加物。 MS + NAA 0.2 + 6-BA 2 + 蔗糖蔗糖 3% + pH 5.8第二节第二节 植物组织培养的一般技术植物组织培养的一般技术单位：单位：mg/LMSmg/L2、根据成分、根据成分 天然培养基：动、植物的天然培养基：动、植物的组织组织或组织的或组织的汁汁配成的培养基。配成的培养基。 化学成分还不清楚或不恒定。化学成分还不清楚或不恒定。 生物性液体（血清）；组织浸液（胚胎浸液

11、）；凝固剂（血浆）等。生物性液体（血清）；组织浸液（胚胎浸液）；凝固剂（血浆）等。 合成培养基合成培养基：成分、浓度已知。：成分、浓度已知。 半合成培养基：天然培养基半合成培养基：天然培养基 +合成培养基。合成培养基。3、根据理化状态、根据理化状态 液体培养基液体培养基 固体培养基：液体培养基固体培养基：液体培养基 + 凝固剂。凝固剂。4、根据功能、根据功能 愈伤组织培养基、花粉培养基、茎尖培养基、愈伤组织培养基、花粉培养基、茎尖培养基、 脱分化培养基、增殖培养基、分化培养基。脱分化培养基、增殖培养基、分化培养基。1）脱分化脱分化培养基培养基 （mg/L）高浓度生长素高浓度生长素 烟草：烟草：

12、MS + 水解蛋白水解蛋白 500 + 2,4-D 1-2。 水稻：水稻：MS + 2,4-D 1。多量生长素多量生长素 + 少量细胞分裂素少量细胞分裂素 烟叶：烟叶：MS + 水解蛋白水解蛋白 500 + 2,4-D 2 + KT 0.25 哈密瓜：哈密瓜：Miller + NAA 2 + KT 0.5多量多量细胞分裂素细胞分裂素 + 少量生长素少量生长素 天竺葵：天竺葵：MS + NAA 0.2 + 6-BA 22）继代培养基）继代培养基 在脱分化培养基上降低生长素的量、在脱分化培养基上降低生长素的量、 或用或用原脱分化培养基原脱分化培养基。3）生根培养基）生根培养基 只用只用基本基本培养

13、基；培养基； 加加生长素生长素： 菠萝：菠萝：MS + IAA 0.3 加加细胞分裂素细胞分裂素： 哈密瓜：哈密瓜：Miller + KT0.5 半量法半量法（三）培养基成分（三）培养基成分功能功能 组成各种化合物，参与机体的建成，成为组成各种化合物，参与机体的建成，成为结构物质结构物质。 构成一些构成一些生理活性物质生理活性物质，参与活跃的新陈代谢。，参与活跃的新陈代谢。 元素之间互相元素之间互相协调协调， 以维持离子浓度的平衡、胶体稳定、电化学平衡等作用。以维持离子浓度的平衡、胶体稳定、电化学平衡等作用。注：不同器官的发生，注：不同器官的发生，需要营养需要营养元素的浓度元素的浓度不同不同。

14、1. 无机盐无机盐大量元素：碳、氢大量元素：碳、氢、氧氧、氮、磷、钾、氮、磷、钾、钙钙、镁、硫、镁、硫、硅硅（-） 。 3+7种，种， 干重干重0.01-10%微量元素微量元素：铁铁、硼、锰、锌、铜、钼、氯、硼、锰、锌、铜、钼、氯、镍镍（-） 、钠钠（-） 。 9种，种， 干重干重0.00001-0.01% I（+） 、 Co（+）。必需元素必需元素的生理作用，的生理作用， 略。略。2. 有机物有机物1）维生素：）维生素：B1（盐酸硫胺素）、（盐酸硫胺素）、B3（烟酸）、（烟酸）、B6（盐酸吡哆醇）。（盐酸吡哆醇）。维生素主要是以各种维生素主要是以各种辅酶辅酶的形式参加的形式参加酶的形成酶的形

15、成， 以及以及蛋白质蛋白质、脂肪脂肪的的代谢代谢等重要生命活动。等重要生命活动。 对对生长生长和和分化分化有促进作用。有促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成能合成所必需的维生素，所必需的维生素，但在数量上还明显但在数量上还明显不足不足，通常需加入通常需加入1至数种维生素，以便获良好的生长至数种维生素，以便获良好的生长.。2）氨基酸）氨基酸 氨基酸是蛋白质的氨基酸是蛋白质的组成组成成分，成分， 也是一种也是一种有机氮源有机氮源，可直接被细胞吸收利用，可直接被细胞吸收利用 。 常用的有常用的有甘氨酸甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷

16、氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸 以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）以及酰胺类物质（如天门冬酰胺） 和和多种氨基酸的混合物多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。 用酶法等加工牛乳的用酶法等加工牛乳的水解产物水解产物，由于营养丰富，极易引起污染。，由于营养丰富，极易引起污染。 如在培养中无特别需要，以如在培养中无特别需要，以不用为宜不用为宜。3）肌醇）肌醇 肌醇具有帮助肌醇具有帮助活性物质（活性物质（VB1）发挥作用的效果，能使培养物快速生长，发挥作用的效果，能使培养物快速生长，对对胚状体胚状体和和芽芽的形成有良好的促进作用。的形成有良好的促进作用。4）天然

17、有机附加物）天然有机附加物大多含大多含氨基酸氨基酸、激素激素、酶酶等一些复杂化合物。等一些复杂化合物。它对细胞和组织的它对细胞和组织的增殖增殖与与分化分化有明显的促进作用，有明显的促进作用，但对但对器官器官的分化作用不明显。的分化作用不明显。它的它的成分成分大多不清楚，与其成熟度及产地关系也很大，大多不清楚，与其成熟度及产地关系也很大，所以一般应尽量所以一般应尽量避免使用避免使用。 椰乳：是使用最多、效果最好的一种天然复合物。椰乳：是使用最多、效果最好的一种天然复合物。 它在它在愈伤组织愈伤组织和和细胞培养细胞培养中有促进作用。中有促进作用。 在马铃薯茎尖在马铃薯茎尖分生组织分生组织和草莓和草

18、莓微茎尖微茎尖培养中起明显的促进作用。培养中起明显的促进作用。香蕉：用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色，对香蕉：用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色，对pH值的值的缓冲缓冲作用大。作用大。 主要在主要在兰花兰花的组织培养中应用。的组织培养中应用。马铃薯：去掉皮和芽后，加水煮，再经过过滤，取其滤液使用。马铃薯：去掉皮和芽后，加水煮，再经过过滤，取其滤液使用。 对对pH值值缓冲缓冲作用也大。作用也大。酵母提取液：主要成分为酵母提取液：主要成分为氨基酸氨基酸和和维生素类维生素类。其他，麦芽提取液、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。其他，麦芽提取液、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉

19、米的胚乳等。 遇热较稳定，大多在遇热较稳定，大多在培养困难时使用培养困难时使用，有时有效。，有时有效。 3. 碳源碳源为细胞提供合成新化合物的为细胞提供合成新化合物的碳碳骨架，骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与为细胞的呼吸代谢提供底物与能源能源，还可以维持一定的还可以维持一定的渗透压渗透压。最常用的碳源是最常用的碳源是蔗糖蔗糖。葡萄糖和果糖也是较好的碳源，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。浓度：浓度：2%-4%，最常用，最常用 3% 。在大规模生产时，可用食用的在大规模生产时，可用食用的白糖白糖代替。代

20、替。4. 植物生长调节剂植物生长调节剂1）生长素类）生长素类 诱导细胞诱导细胞脱分化脱分化，促进愈伤组织的形成；，促进愈伤组织的形成； 促进细胞促进细胞伸长伸长生长和细胞分裂；生长和细胞分裂； 促进促进生根生根。吲哚乙酸：激素，有利于根形成，吲哚乙酸：激素，有利于根形成， 但是它容易被氧化和光解，组织培养中通常使用但是它容易被氧化和光解，组织培养中通常使用合成的生长素合成的生长素。吲哚丁酸吲哚丁酸：诱导许多植物：诱导许多植物生根生根。萘乙酸萘乙酸：最适宜诱导：最适宜诱导愈伤组织愈伤组织或诱导某些外植体或诱导某些外植体生根生根。二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）：引起）：引起脱分化脱分化。

21、 能够引起能够引起染色体变异染色体变异，因此使用时必须格外小心。，因此使用时必须格外小心。作用效力作用效力吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAA）吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBA）萘乙酸萘乙酸（NAA）二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）2）细胞分裂素类）细胞分裂素类 促进细胞分化；促进细胞分化； 有利于细胞分裂和愈伤组织的形成；有利于细胞分裂和愈伤组织的形成； 促进细胞促进细胞分裂分裂与扩大，可使茎增粗，而抑制茎的伸长；与扩大，可使茎增粗，而抑制茎的伸长； 诱导诱导芽的分化芽的分化，促进侧芽发生。，促进侧芽发生。激动素：最主要的用途是诱导激动素：最主要的用途是诱导芽的形成芽的形成。 玉米素：是一种天然激素

22、，玉米素：是一种天然激素，价格昂贵价格昂贵，其作用稍差于苄氨基嘌呤。，其作用稍差于苄氨基嘌呤。6-苄氨基腺嘌呤苄氨基腺嘌呤（6-BA）：具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，）：具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点， 是组织培养是组织培养最常用最常用细胞分裂素类。细胞分裂素类。 主要作用是促进主要作用是促进芽的形成芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。，也可以诱导愈伤组织发生。作用效力作用效力玉米素玉米素ZT6-苄氨基腺嘌呤苄氨基腺嘌呤6-BA激动素激动素KT腺嘌呤腺嘌呤3）赤霉素）赤霉素 赤霉素有赤霉素有127种，种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同，生理活性及作用的种类、部位、效应等

23、各有不同，培养基中添加的是培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的主要用于促进幼苗茎的伸长伸长生长，生长， 促进促进胚状体胚状体发育成小植株。发育成小植株。5. 培养材料的支持物培养材料的支持物 琼脂琼脂固体培养时琼脂是最好的固化剂。固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂的用量在琼脂的用量在0.8-1.0%之间之间 。凝固能力凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，除与原料、厂家的加工方式有关外， 还与高压灭菌时的温度、时间和还与高压灭菌时的温度、时间和pH值值等因素有关。等因素有关。其它：玻璃纤维、滤纸桥、海绵、卡拉胶等。其它：玻璃纤维、滤纸桥、海绵、卡拉胶等。6、其他成分、其他成分抗生素物

24、质：有青霉素、链霉素、庆大霉素等抗生素物质：有青霉素、链霉素、庆大霉素等, 可防止菌类可防止菌类污染污染，减少培养中材料的损失。，减少培养中材料的损失。抗氧化剂：易抗氧化剂：易褐化褐化的材料。的材料。活性炭：活性炭： 茎尖茎尖初代初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物褐化物； 新梢新梢增殖增殖阶段，活性炭可明显促进阶段，活性炭可明显促进新梢新梢的形成和伸长；的形成和伸长； 活性炭在活性炭在生根生根时有明显的促进作用。时有明显的促进作用。 7、pH值值喜光、耐旱、耐盐碱：喜光、耐旱、耐盐碱： pH值中性；值中性；喜湿、耐阴、喜酸

25、：喜湿、耐阴、喜酸： pH值值偏酸偏酸。 培养基灭菌后，培养基灭菌后， pH值一般下降。值一般下降。（四）培养基的选择（四）培养基的选择1. 几种基本培养基的特点几种基本培养基的特点1）富集元素富集元素平衡培养基平衡培养基 - MS培养基（典型代表）培养基（典型代表） 无机盐无机盐浓度高，元素间的比例较适合；浓度高，元素间的比例较适合； 缓冲缓冲性能好，某些元素略有损失不会影响离子平衡；性能好，某些元素略有损失不会影响离子平衡； 营养丰富营养丰富，不需再加入水解蛋白等有机成分；，不需再加入水解蛋白等有机成分； 微量元素微量元素种类较全，浓度较高；种类较全，浓度较高； 适合多种植物，适合多种植物

26、，用途广泛用途广泛。 与与MS相类似的培养基，相类似的培养基， LS、BL、BM、ER培养基等。培养基等。2）硝酸钾硝酸钾含量较高的培养基含量较高的培养基 硝酸钾硝酸钾的含量高，的含量高， 铵态氮铵态氮的含量低，的含量低， 含有较高的含有较高的盐酸硫胺素盐酸硫胺素（VB1）。）。如，如，B5（水稻成熟胚愈伤组织（水稻成熟胚愈伤组织分化分化时用其时用其微量元素微量元素部分）部分）、 N6（禾谷类植物的花药和花粉培养禾谷类植物的花药和花粉培养 ）、 SH培养基。培养基。3）中等中等无机盐含量的培养基无机盐含量的培养基 大量元素无机盐约为大量元素无机盐约为MS的的一半一半； 微量元索微量元索种类减少

27、种类减少而而含量增高含量增高； 维生素维生素种类种类比比 MS多多。 如，如，H、Nitsch、Miller培养基。培养基。4）低低无机盐培养基无机盐培养基 无机盐含量很低，一般为无机盐含量很低，一般为MS的的1/4； 有机成分含量也有机成分含量也很低很低； 多用作多用作生根培养基生根培养基。 如，如，White 、WS、HE、HB培养基。培养基。2. 培养基选择培养基选择 1）背景调查）背景调查对该供试对该供试植物植物分类地位、生理特性、繁殖、栽培条件及品种类型等分类地位、生理特性、繁殖、栽培条件及品种类型等有充分的了解。有充分的了解。应详细查阅应详细查阅前人前人对该植物的对该植物的研究研究

28、工作，工作，总结分析前人工作的成功和不足之处，总结分析前人工作的成功和不足之处，从而在此基础上确定从而在此基础上确定基本培养基基本培养基类型。类型。2）选择原则选择原则同一物种同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基类型基本相同；的不同亚种、品种间的基本培养基类型基本相同；同一植物同一植物的不同组织、器官的基本培养基类型基本相同；的不同组织、器官的基本培养基类型基本相同；营养成分需求与营养成分需求与田间田间栽培有相似性；栽培有相似性；无机盐浓度无机盐浓度是基本培养基类型的重要因素，是基本培养基类型的重要因素， 应该作为培养基选择的重要参数；应该作为培养基选择的重要参数；有机成分主要是有机成分主要

29、是种类种类的变化，每种成分含量的变化不大；的变化，每种成分含量的变化不大；在确定基本培养基类型后，研究最适的在确定基本培养基类型后，研究最适的蔗糖浓度蔗糖浓度。3）激素的选择原则）激素的选择原则生长素生长素 主要功能是促进细胞分裂、诱导主要功能是促进细胞分裂、诱导愈伤组织愈伤组织和和生根生根等，等， 各种生长素的强度按以下排列而减弱：各种生长素的强度按以下排列而减弱： 2,4-D、NAA、IBA和和IAA。 与与细胞分裂素细胞分裂素互作促进茎的增殖。互作促进茎的增殖。细胞分裂素细胞分裂素 主要促进主要促进细胞分裂细胞分裂，改变顶端优势，促进，改变顶端优势，促进芽的分化芽的分化等。等。 常用几种

30、细胞分裂素的强度按以下排列减弱；常用几种细胞分裂素的强度按以下排列减弱； ZT、6-BA、KT和腺嘌呤。和腺嘌呤。激素选择原则激素选择原则细胞分裂素与生长素的细胞分裂素与生长素的比例比例是激素使用的关键；是激素使用的关键；细胞分裂素与生长素的细胞分裂素与生长素的种类种类对不同对不同植物植物的敏感性不同；的敏感性不同；同一植物的同一植物的不同组织不同组织在愈伤组织诱导和芽分化过程中对在愈伤组织诱导和芽分化过程中对激素激素的要求不同。的要求不同。4 4）总结）总结基本培养基基本培养基 生长调节物质生长调节物质 糖糖 营养元素营养元素 天然附加物天然附加物 凝固剂凝固剂4）常用试验方法）常用试验方法

31、单因子试验单因子试验 培养基中其他成分都不变，只变动一个因子。培养基中其他成分都不变，只变动一个因子。 就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。多因子试验多因子试验 对培养基中两个或两个以上因素进行研究。对培养基中两个或两个以上因素进行研究。 试验可采用试验可采用完全完全试验方案、试验方案、正交正交设计方案。设计方案。培养基培养基配方配方试验试验（五）培养基的配制（五）培养基的配制1. 对药品和水的要求对药品和水的要求 选择选择等级较高等级较高的药品的药品; 同一试验要用同一试验要用同一批次同一批次的药品的药品; 原则上用原则上用纯水纯水。药品纯

32、度等级药品纯度等级1、工作基准试剂（无简写标记，用汉语注明，绿色标签）：、工作基准试剂（无简写标记，用汉语注明，绿色标签）： 作为作为基准物质基准物质，标定标准溶液。，标定标准溶液。 2、优级纯（、优级纯（GR，绿色标签）：用于精确分析和研究工作，有的可作为，绿色标签）：用于精确分析和研究工作，有的可作为基准物质基准物质。 3、分析纯（、分析纯（AR，红色标签）：用于工业分析及化学实验，红色标签）：用于工业分析及化学实验，用得最多用得最多的等级。的等级。 4、化学纯（、化学纯（CP，蓝色标签）：用于，蓝色标签）：用于化学实验化学实验和合成制备。和合成制备。 5、实验试剂（、实验试剂（LR ，黄

33、色标签）：用于，黄色标签）：用于一般化学实验一般化学实验和合成制备。和合成制备。 2. 母液配制母液配制1）优点）优点 减少减少工作量工作量; 减少多次称量造成的减少多次称量造成的误差误差; 便于微量元素的便于微量元素的称量称量; 保证每一个材料的培养基有保证每一个材料的培养基有相同的成分相同的成分。2）母液种类）母液种类 大量元素：大量元素：1050倍；倍； 微量元素：微量元素：100200倍；倍； Fe盐：盐： 100200倍（棕色瓶）；倍（棕色瓶）； 有机物：有机物： 20100倍；倍； 植物生长调节剂母液植物生长调节剂母液 （1mg/ml）。）。3）母液配制注意事项）母液配制注意事项植

34、物生长调节剂的溶解植物生长调节剂的溶解 生长素类：碱溶；生长素类：碱溶； 95%乙醇乙醇溶、溶、蒸馏水蒸馏水定容。定容。 细胞分裂素类：细胞分裂素类：酸溶酸溶、蒸馏水蒸馏水定容。定容。 赤霉酸：热水溶，以赤霉酸：热水溶，以95%乙醇配成原液。乙醇配成原液。Fe盐制备：将两物质分别溶解在盐制备：将两物质分别溶解在450ml水中，水中， 然后混合，然后混合， 定容。定容。配制好的母液分别贴上标签配制好的母液分别贴上标签MS MS 大量元素大量元素10 X 10 X 查仁明查仁明 04.04.0404.04.04贮存：温度贮存：温度2-4度，度， 一般无机物一般无机物3-6个月，个月， 有机物有机物

35、3个月。个月。3、培养基配制、培养基配制 蒸馏水蒸馏水母液母液生长调节剂生长调节剂琼脂粉琼脂粉蔗糖蔗糖 融化融化调节调节pHpH分装分装灭菌灭菌冷却冷却二、无菌技术二、无菌技术有菌的范畴有菌的范畴凡是凡是暴露暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的至少它的表面表面都是有菌的，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。都是有菌的，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。无菌的范畴无菌的范畴经经高温灼烧高温灼烧或一定时间或一定时间蒸煮蒸煮过后的物体，过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体，高层大气

36、、岩石内部、高层大气、岩石内部、强酸强碱，化学元素灭菌剂等的表面和内部等等都是无菌的。强酸强碱，化学元素灭菌剂等的表面和内部等等都是无菌的。 污染污染 指在组织培养过程中由于真菌、细菌或病毒的侵染，指在组织培养过程中由于真菌、细菌或病毒的侵染，而使培养基和培养材料而使培养基和培养材料滋生杂菌滋生杂菌，导致培养失败的现象。导致培养失败的现象。直接侵入培养物中，直接侵入培养物中，杀死杀死培养物；培养物；向培养基分泌有毒物质，向培养基分泌有毒物质，毒死毒死培养物；培养物；竞争培养基养分使营养耗尽，培养物竞争培养基养分使营养耗尽，培养物饥饿饥饿而死。而死。污染所引起的危害污染所引起的危害污染引起的危害

37、有的是极明显的，污染引起的危害有的是极明显的，如如早期早期培养的失败，增殖效率的降低，生长减慢，培养的失败，增殖效率的降低，生长减慢，玻璃苗玻璃苗增加，生长的不均匀等；增加，生长的不均匀等；而有的影响可在而有的影响可在以后以后的过程显现，如移栽困难和苗的死亡，田间的不良表现。的过程显现，如移栽困难和苗的死亡，田间的不良表现。污染也会引起培养物的污染也会引起培养物的遗传变异遗传变异。有些有些病原菌病原菌的存在（如国际上已发现的某些商业生产的试管苗的存在（如国际上已发现的某些商业生产的试管苗带有带有胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐欧文氏菌），可以引起多种作物的），可以引起多种作物的病害病害；试管苗（在

38、未进行专门的病原体脱除和鉴定时）试管苗（在未进行专门的病原体脱除和鉴定时）也常是很多致病的病毒、类病毒、类菌原体的携带者，也常是很多致病的病毒、类病毒、类菌原体的携带者，育目发展可能引起育目发展可能引起病毒大规模的扩散病毒大规模的扩散。（一）污染源及其表现特征（一）污染源及其表现特征1. 外植体外植体 表面带菌：接种后表面带菌：接种后很快很快长出微生物菌落长出微生物菌落; 内生带菌：接种后内生带菌：接种后一定时间一定时间才表现出来。才表现出来。 特征：靠近外植体特征：靠近外植体培养基表面培养基表面出现微生物菌落。出现微生物菌落。 2. 培养基培养基 在培养基在培养基表层表层和和深层深层同时出现

39、点状分布的菌落。同时出现点状分布的菌落。3. 培养器皿培养器皿 在培养基与容器在培养基与容器接触处接触处 或或器壁上器壁上出现菌落。出现菌落。4. 工作人员工作人员 在培养基在培养基表面表面 或操作器械或操作器械接触处接触处出现菌落。出现菌落。5. 空气空气 原因：超净工作台故障；原因：超净工作台故障； 瓶塞过松瓶塞过松 特征：在培养基特征：在培养基表面靠近表面靠近培养容器壁处出现菌落。培养容器壁处出现菌落。（二）常用的灭菌方法（二）常用的灭菌方法灭菌灭菌用物理或化学的方法，用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物

40、质即把所有生命的物质全部杀死全部杀死。消毒消毒杀死、消除或充分抑制杀死、消除或充分抑制部分微生物部分微生物，使之不再发生危害作用。使之不再发生危害作用。1. 加热灭菌加热灭菌1）湿热灭菌）湿热灭菌设备：高压灭菌锅设备：高压灭菌锅原理：通过蒸汽接触材料表面原理：通过蒸汽接触材料表面 冷凝时释放热能冷凝时释放热能达到杀死微生物的目的。达到杀死微生物的目的。工作条件：工作条件：1-1.2kg/2，20-30 min。 121 ，15 min。 注意事项注意事项 灭菌前排尽冷空气；灭菌前排尽冷空气； 灭菌后压力切勿降低太快。灭菌后压力切勿降低太快。2 2）干热灭菌）干热灭菌灼烧灼烧 蘸蘸95%酒精燃烧

41、器具。酒精燃烧器具。烘烧烘烧 设备：设备： 烘箱烘箱 工作条件：工作条件：140，4h 或或160-170，2-3h注意事项：注意事项： 要妥为要妥为包扎包扎，以免灭菌后取用时重新污染；，以免灭菌后取用时重新污染； 温度一般温度一般勿超过勿超过175 2. 化学灭菌化学灭菌 1）液体灭菌：酒精、升汞、双氧水、次氯酸钠等，适用于）液体灭菌：酒精、升汞、双氧水、次氯酸钠等，适用于外植体外植体表面灭菌。表面灭菌。 2）气体灭菌：甲醛、乙二醇。）气体灭菌：甲醛、乙二醇。 向向甲醛甲醛内加入内加入高锰酸钾高锰酸钾，促进甲醛的快速，促进甲醛的快速挥发挥发而起到灭菌的作用。而起到灭菌的作用。 用于用于培养室和接种室培养室和接种室的灭菌，每立方米用甲醛的灭菌，每立方米用甲醛2毫升，高锰酸钾毫升，高锰酸钾1克，克， 3. 紫外辐射灭菌紫外辐射灭菌 原理：细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生原理：细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构结构变化，变化， 引起细菌的引起细菌的染色体染色体变异，造成死亡。变异，造成死亡。 用途：紫外线的穿透能力