基因的克隆与表达

1、基因的克隆与表达基因基因(gene)这个名词是1909年由遗传学家约翰森(W.L.Johannsen,18571927)提出来的.他用基因这一名词来表示遗传的独立单位,相当于孟德尔在豌豆试验中提出的遗传因子.顾名思义,基因不仅是一个遗传物质在上下代之间传递的基本单位,也是一个功能上的独立单位.基因是DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称,是具有遗传效应的DNA(脱氧核糖核酸)分子片段.基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代,还可以使遗传信息得到表达,反映在蛋白质的分子结构上,从而使后代表现出与亲代相似的性状.1.结构基因(structural gene)是指某些能决定某种多肽链(蛋

2、白质)或酶分子结构的基因.结构基因的突变可导致特定蛋白质(或酶)一级结构的改变或影响蛋白质(或酶)量的改变.2. 调控基因(regulator and control gene)是指某些可调节控制结构基因表达的基因.调控基因的突变可以影响一个或多个结构基因的功能,或导致一个或多个蛋白质(或酶)的改变.简言之,基因就是编码一段功能蛋白质的DNA序列及其调控序列.克隆是英文(clon)clone的音译 :指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体.无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合,只由一个生物体产生后代的生殖方式,常见的有孢子生殖,出芽生殖和分裂生殖.由植物的根,茎,叶等经过压条或

3、嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖. 克隆就是一种以DNA重组技术为基础的人工诱导的无性繁殖方式.也称为分子克隆(molecular cloning)或基因克隆.DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作.克隆分,切,接,转,筛分,切,接,转,筛分:目的基因的获得1,PCR(RT-PCR)2,酶切PCR技术PCR:聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction),是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用,通过变性-复性-延伸的循环操作,在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术.一,PCR基本原理:变性-复性-延伸1.变性:通常采用加热变性,即将模板DNA或延伸后的双链

4、DNA加热到940C,使双螺旋DNA解开成为单链.2.复性:通过降低反应温度至500C- 650C ,使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3端粘合,以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH.3.延伸:将反应温度提高到约720C,在耐热DNA聚合酶的催化下,根据模板DNA提供的碱基顺序,合成两条互补链,从而使模板DNA扩增一倍.PCR技术特点1,高度的敏感性.2,高度的特异性.3,操作简便快速.4,样品适用广泛.5,有一定程度的单核苷酸错误掺入.引物要扩增模板DNA,首先要设计两条寡核苷酸引物,所谓引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段,两引物间距离决定扩增片段的长度;两引

5、物的5'端决定扩增产物的两个5'末端位置.由此可见,引物是决定PCR扩增片段长度,位置和结果的关键,引物设计也就更为重要.引物的设计引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的,两引物之间的序列未必清楚,这两段已知序列一般为1821个碱基,可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物. (1)引物长度:18-21bp (2)(G+C)%含量:引物的组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体.两个引物中(G+C)%含量一般以40%60%为佳.(3)引物的结构:无明显的次级结构(4)引物之间:不应发生互补(5)引物3'端配对精确和严格1,dNTP: PCR常用的浓

6、度为50200mol/L,不能低于1015mol/L.四种dNTP的浓度应相同.2, 缓冲液:10 mM Tris.HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2.3,模板DNA:纯度与含量.4,反应参数.PCR的影响因素1. 变性-考虑酶的失活问题.一般为反应开始时用95oC×2- 5 min,在后续循环中设为94oC× 30 s - 1 min;2. 退火-退火温度取决于引物的碱基组成,长度及引物与模板的匹配程度,一般在Tm 20-25oC左右;时间一般为30 s - 2 min;3. 延伸温度一般为72oC;时间取决于待扩增片段的长度.在通常情

7、况下,Taq酶的延伸速率约为2 kb/min,而pfu为1 kb/min .4. 在最后一个循环结束后,需再在72oC下延伸10 min,以产物完整.单,双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品.若起始材料是RNA,须先通过逆转录得到第一条cDNA.为了保证反应的特异性,还应用ng级的克隆DNA,g水平的单拷贝染色体DNA或102-105拷贝的待扩增片段作为起始材料.模板可以是粗品,但不能混有任何蛋白酶,核酸酶,Taq DNA聚合酶抑制剂以及结合在DNA上的蛋白.模板的纯度,含量测定260nm 1 OD 双链DNA 50g /ml单链DNA 40g /mlOD 260nm/ OD280nm 1

8、.8ddH2O 37.60 L10 × Buffer 5 LdNTP mixture(2.5mM) 4 L引物上(20pmol/ L) 1 L引物下(20pmol/ L) 1 L MgCl2(25mM) 4 L模板(102-105 拷贝) 0.5 LDNA Polymerase 0.4 L总体积 50 L95变性处理3min94 30S56 30S72 1min30个循环72延伸7min PCR产物纯化从凝胶上尽量小的切下目的片段,放在一个干净的EP管中,称取凝胶的重量,并加入3倍体积的Buffer S1 (即100mg胶加300 L Buffer S1);盛胶EP管于50水浴10m

9、in,每2-3min摇动一次,至胶彻底融化;溶液加入到吸附柱内,13000rpm离心1min,弃去收集管中的液体;加入0.5mL的Buffer W1洗涤DNA,13000rpm离心15sec;弃去收集管中的液体,再加入0.5mL的W1 Buffer,静置1min,13000rpm离心15sec;弃去收集管中的液体, 13000rpm离心1min;把吸附柱放在一个干净的EP管内,在柱子膜中央加入30 L Buffer T1, 室温放置1min,13000rpm 离心1min.凝胶回收后的目的基因,各取5 L电泳检测,并测定浓度以确定连接体系(此步必做).分,切,接,转,筛切:限制性核酸内切酶酶切

10、目的基因和载体.限制性核酸内切酶的分类限制性内切酶分为3种类型:I,型. I型RE:识别位点复杂,特异性差.通常在识别位点的4007000bp范围内切割DNA.现已报道19种.型RE:切割位点靠近识别序列但较难预测.一般在2527bp范围内切割.现已报道4种.I,型RE酶同时具有限制(剪切)与修饰(甲基化)两种功能和依赖ATP限制,切割DNA链的位置远离识别序列,因此I型和型酶在DNA重组技术中都不常用.型限制性内切酶实际应用价值最大:型酶只具有限制性活性,无甲基化修饰活性;对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点,切割精确;此类酶作用时只需要Mg2+参与.无需ATP.型RE酶:被分子生物学家广

11、泛研究应用,现已发现600多种.型RE:MW=60KD的单链多肽,最适pH:68,NaCl有抑制作用,Mg2+ 激活,巯基有保护作用;热不稳定.作用特点1._有严格的识别,切割的DNA序列,并以内切的方式水解双链DNA分子中的磷酸二酯键,产生的DNA片段5'端为P,3'端为OH.SpeI 5'- A CTAGT- 3' 3'-TGATC A - 5'SwaI 5'- ATTT AAAT- 3' 3'-TAAA TTTA - 5'2. 识别序列一般为46个碱基对,并以切割序列的正中作为轴心,成180°反向重

12、复(inverted repeat).这种结构也称为回文结构(palindrom).MspI 5'-C CGG - 3' 3'-GGC C- 5'SbfI 5'-CCTGCA GG - 3' 3'-GG ACGTCC- 5'3._型酶切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DNA片段的长短,即识别序列短,则DNA链中可能存在的切点多,产生DNA片段短;识别序列长,则DNA链上存在的切点少,产生DNA片段长.4.切割后产生平端或粘性末端.平头末端(blunt end): 即在识别序列的对称轴上进行切割.MscI 5'-TG

13、G CCA - 3' 3'-ACC GGT - 5'HpaI 5'-GTT AAC - 3' 3'-CAA TTG - 5'粘性末端(cohesive end) 即在识别序列的两个对称点切开DNA双链,产生末端带有单链尾巴的切口.ClaI 5'-AT CGAT - 3' 3'-TAGC TA - 5'KpnI 5'-GGTACC - 3' 3'-CCATGG - 5'Hpy188I 5'-TCN GA - 3' 3'-AG NCT- 5'Hga

14、I 5'-GACGC(N)5 - 3' 3'-CTGCG(N)10 - 5'三类特殊性质的型限制性内切酶(1)同裂酶(isoschizomer):又称异源同工酶,即从不同原核生物中分离出来的不同的型酶有相同的识别特点,但切割位点可以相同,也可以不同,例如Sam I(CCCGGG)和Xma I(CCCGGG) (2)同尾酶(isocaudarmer):不同来源的酶其识别和切割序列有一定的相关性,作后能产生相同的粘性末端,例如BamH I(GGATCC).同尾酶产生的DNA片段能通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来,这在分子克隆中有一定的作用.但应当注意有时用两

15、种同尾酶产生的末端,重组后形成的序列再也不能被原来的任何一种同尾酶所识别.例如:同尾酶可用于克隆载体的改造和构建中,用以消除某些限制酶切点,但如果要回收重组克隆中的插入片段时,则要慎重选择适当的同尾酶.Sau3A I BamH IGATC GGATCCCTAG CCTAGGSauI Xho IGTCGAC CTCGAGCAGCTG GAGCTC(3)可变酶:此种酶所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的,并且识别序列往往超过6个碱基对,例如Bstp I识别序列为:GGTNACC,其中N为一可变碱基.RE识别序列呈反转对称结构,可分为四种类型1._回文结构:(Palindrome)2.间断回文

16、结构(interrupted Palindrome)如:BgI:5,-GCCNNNN NGGC-3, 3,-CGGN NNNNCCG-5,3. 简并序列(degenerate sequence)又称"松弛"特异识别,即识别位点中某些核苷酸可以被其他核苷酸替换.4.非回文结构:HgaI 5'-GACGC(N)5 - 3' 3'-CTGCG(N)10 - 5'_ RE使用时的注意事项1._要求较纯的底物DNA.2._Mg2+和Tris-HCI缓冲体系,并且大多数内切酶活性pH范围在7.27.6之间;3. 同时反应体系中不能含有酚,氯仿,乙醚,SD

17、S以及大于10mmol/L的EDTA;4._ 对离子强度的要求分为3个级别,高盐 (100mmol/L NaCl),中盐(50mmol/L NaCl),低盐(010mmol/L NaCl).5. 在酶反应缓冲体系中均添加有二硫苏糖醇或-巯基乙醇,以稳定酶活性防止氧化.6. 在具体试验操作时应在低温或冰浴条件下完成. 目的片段 5 L(1 g)10×buffer(E) 4 L10×BSA 4 LBamHI 1 L(10u) HindIII 1 L(10u)ddH2O 25 L37作用1h,取5 L进行电泳检测,其余的进行凝胶回收后直接用于连接. 分,切,接,转,筛接:目的片段

18、与载体的连接DNA连接酶催化双链DNA中相邻碱基的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键形成的酶,称为DNA连接酶(DNA ligase).DNA连接酶主要有两种:T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶T4噬菌体DNA连接酶T4DNA连接酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现并分离的,分子量68kDa.主要功能及用途_连接双链DNA中一条链上的缺口催化 Km=1.5pmol/L链间存在的互补粘性末端的DNA片段 Km=0.6umol/L.(连接反应通常在1215下进行) DNA分子间的平头末端 Km=50umol/L(平端的连接通常在室温下进行)有报道T4DNA连接酶可以用于RN

19、A连接,但效率低. 5× T4 DNA ligase buffer 4 L外源DNA 0.3pmol载体DNA 0.03pmolT4 DNA Ligase 1 LddH2O up to 20 L 23-26连接1h或16过夜连接产物马上转化可多做几个连接梯度,同时设立对照,如载体的双酶切自连以检测是否酶切完全,载体的单酶切产物连接以检测连接体系和连接酶.外源DNA与载体DNA的摩尔比为3-10,连接效果较好.1:1 3:1 6:1 目的片段:1kb 25ng 75ng 150ng载体质粒:4kb 100ng 100ng 100ng分,切,接,转,筛转:连接产物转入宿主细胞.于1.5m

20、L离心管中加入100 L感受态细胞,取10 L重组质粒缓慢加入并且边加边搅拌,置冰浴30min,42 90Sec,迅速冰浴35min,加入0.5mL LB培养基,振荡培养1h.每个抗性平板中加入200-300 L转化菌,摇动淌匀,自然表面干燥后,37培养12-16h.同时将连接对照组也转化细胞,再设立对照:(1)质粒+感受态细胞;(2)无菌水+感受态细胞.培养完毕后,从实验组中筛选出阳性菌落.从37培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm),转到一个含有100ml LB或LB培养基的1L烧瓶中.于37剧烈振摇培养约3小时(旋转摇床,300转/分).为得到有效转化,活细胞数不

21、应超过108细胞/ml,可每隔20-30分钟测量OD600值来监测培养物的生长情况. 培养物冷却至0;4用Sorvall GS3转头以4000转/分离心10分钟,以回收细胞;倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽;以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀,放置于冰浴上,于4以4000转/分离心10分钟,以回收细胞;倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽;每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2,重悬每份细胞沉淀;可将细胞分装成小份,放于-70冻存.热击法:42 90Sec电击法:1200mv-2400mv 1-5ms分

22、,切,接,转,筛筛:筛选含有正确序列重组质粒的细菌.非转化子(不含质粒)连接产物转化入不含外源基因的重组子受体细胞转化子(含质粒) 不含正确序列基因的重组子含外源基因的重组子含正确序列基因的重组子第1步第2步第3步第1步和第2步为遗传表型筛选,属被动筛选过程,包括抗生素平板筛选,互补筛选,插入表达筛选,噬菌斑筛选.第3步为主动筛选鉴定过程,主要方法有菌落原位杂交鉴定,小剂量制备质粒限制性内切酶分析鉴定,PCR鉴定,DNA序列测定等. 根据遗传表型筛选1.抗生素平板筛选2. 互补筛选3.插入表达筛选4.噬菌斑筛选1.抗生素平板筛选大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因,常见的有抗氨苄青霉素基因(Am

23、pr),抗四环素基因(Tetr),抗卡那霉素基因(Kanr)等.如果外源DNA片段插入载体的位点在抗药性基因之外,不导致抗药性基因的插入失活,仍能编码抗药性基因,这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落.但是除阳性重组子以外, 自身环化的载体,未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组子均能转化细胞而能生长,故本法仅是阳性重组子的初步筛选.互补筛选-半乳糖苷酶 ( -galactosidase)是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶,最常用的 -半乳糖酶基因来自大肠杆菌的Lac操纵子,它们使载体中带有大肠杆菌Lac操纵子的调节序列和编码 -半乳糖苷酶N末端146个氨

24、基酶的序列.用异丙基- -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导这个氨基末端片段的合成,合成的片段能与宿主编码的 -半乳糖苷酶缺陷型进行基因内互补,恢复该酶的活性,这一过程称 -互补.因此当载体带有LacZ调节序列和编码半乳糖苷酸N末端146个氨基酸的序列,而宿主中该部分序列缺陷,其他部分完整时,虽然宿主编码的或质粒编码的片段本身都没有活性,但它们互相协助则可在大肠杆菌内形成一个具有酶活性的蛋白质.故在诱导物IPTG存在下,细菌在含色素底物5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷(X-gal)培养基的平板上可形成蓝色菌落.当在质粒多克隆位点中插入外源DNA时,可使 -半乳糖苷酶的氨基末端失活,

25、从而不能进行互补,因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落.插入表达筛选有些载体设计时,在筛选标志基因前面连接一段负调控序列,当插入失活该负调控序列时,其下游的筛选标志基因才能表达,如pTR262质粒其Tetr基因上游存在CI基因的负调控序列,CI基因可以抑制Tetr基因的表达,当外源DNA片段插入CI基因的Hind或Bgl I位点时,Tetr基因阻碍解除而表达,阳性重组子为Tetr表型,而质粒本身为Tetr表型,故转化细菌在Tetr平板中,只有含外源DNA插入片段的阳性重阻子的转化菌才能生长成菌落.噬菌斑筛选对于以噬菌体载体系统,外源DNA插入噬菌体载体后,重组DNA分子大小必须在野生型DNA长度

26、的78%105%范围内,才能在体外包装成具有感染活力的噬菌体颗粒,感染细菌后,形成清晰的噬菌斑.没有外源DNA片段插入的载体不能包装成噬菌体颗粒,不能感染细胞并形成噬菌斑,从而达到初步筛选的作用. 应用限制性内切酶酶切分析筛选对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落,应小量培养后,再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入片段,对于可能存在双向插入的重组子还要内切酶消化鉴定插入方向,然后凝胶电泳检测插入片段和载体的大小. Marker DNA 空载体单酶切重组质粒单酶切重组质粒双酶切以重组质粒为模板的PCR(目的片段) 菌落原位杂交技术迄先将转化菌直接铺在硝酸

27、纤维素薄膜或琼脂平板上,再转移至另一硝酸纤维素薄膜上,用核素标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交,然后挑选阳性克隆菌落.本方法能进行大规模操作,一次可筛选5×1055×106个菌落或噬菌斑,对于从基因文库中挑选目的重组子,是一项首选的方法.核酸探针筛选为了进一步确定DNA插入片段的正确性,在内切酶消化重组子凝胶电泳分离后,通过Southern印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上,再用放射性核素或非放射性标记的相应外源DNA片段作为探针,进行分子杂交,鉴定重组于中的插入片段是否是所需的靶基因片段. PCR筛选PCR技术具有高度的灵敏度和特异性,能在极短的时间内将目的基因扩增至

28、数百万倍,通过电泳,可直接观察到产物的存在._一些载体的外源DNA插入位点两侧,存在恒定的序列,通过与插入片段两侧的SP6及T7启动子互补的引物,对小量抽提的质粒DNA进行PCR分析,不但可迅速扩增插入片段,而且可以直接进行DNA序列分析.对于原核或真核系统表达型重组子,其插入片段的序列正确性是非常关键的,故有必要对重组子进行序列测定.也可利用已知的外源DNA的核酸序列,设计特异的引物直接用PCR进行扩增,并检测产物. 检测阳性的重组质粒送出测序;序列比对.Sequence 0 1 ATGATTAAATTAAAATTTGGTGTTTTTTTTACAGTTTTACTATCTTCAGCATATGC

29、ACATGG 62Sequence 1 1 ATGATTAAATTAAAATTTGGTGTTTTTTTTACAGTTTTACTATCTTCAGCATATGCACATGG 62_Sequence 0 63 AACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAAATACATACGCTAA 124Sequence 1 63 AACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAAATACATACGCTAA 124_Sequence 0 125 ATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTG

30、GAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACT 186Sequence 1 125 ATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACT 186_Sequence 0 187 TTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAA 248Sequence 1 187 TTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAA 248_Sequence 0 249 AAAAGCGATT

31、GAAAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG 310Sequence 1 249 AAAAGCGATTGACAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG 310_Sequence 0 311 AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAAT 372Sequence 1 311 AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAAT 372

32、_Sequence 0 373 TAA 375Sequence 1 373 TAA 375 Sequence 0 1 MIKLKFGVFFTVLLSSAYAHGTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIIT 62Sequence 1 1 MIKLKFGVFFTVLLSSAYAHGTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIIT 62_Sequence 0 63 FKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN 124Sequence 1 63 FKN

33、GATFQVEVPGSQHIDSQKKAIDRMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN 124_克隆基因的表达克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理,克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究.有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上,以至在工业上都是很有应用价值的,可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得. 体外表达:无细胞表达系统原核表达系统:大肠杆菌表达系统体内表达: 酵母表达系统真核表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统动物/植物表达系统(转基因动物/植物) 大肠杆菌表达系统特点:产量高,生长速度快,操作容易,

34、成本低. 缺点:翻译后加工修饰体系不完善:无糖基化,酰基化等. 一般表达获得的蛋白常常以变性状态存在,不具有生物学活性. 目前较常用的表达载体是具有可诱导的T7启动子的表达载体,大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高,表达量可占细菌总蛋白的25%以上.T7-RNA聚合酶的活性高于大肠杆菌RNA聚合酶,它只识别自己的启动序列,不能启动大肠杆菌DNA的转录,对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性,因而可在利福平存在的条件下,使目的基因得到大量扩增.还有受温度变化诱导的具有噬菌体PL启动子调控的载体等. 大肠杆菌表达系统常见的商业化表达系统有:1,pET system and pETBlue

35、 system(Novagen公司),是原核蛋白表达中应用最多的系统.具有可溶性蛋白生产,二硫键形成,蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌.目前共有包括40多种载体,15种不同宿主菌和配套齐全的用于有效检测和纯化目标蛋白的相关产品. 2,pBAD表达系统(Invitrogen公司),可控制蛋白质的生产水平低于其成为不溶性蛋白的域值.通过与硫氧还蛋白的融合来增加溶解度3,QIAexpress Expression System(Qiagen公司 ).外源基因在原核细胞中的表达形式按表达蛋白的部位分:分泌表达;外周质及膜上表达 ;胞内表达.外源基因在原核细胞中的表达形式在原核细胞中表达外源基因时,

36、可产生融合型,非融合型.原则上应能够使外源基因表达效率高,蛋白质产量高,不易被细菌分解,而且产物易被提取,纯化.融合基因的表达外源基因在大肠杆菌中表达的一种简便方法是使其表达为融合蛋白,也就是说要表达的外源基因连接在一段原核基因的下游,蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码,C端由外源DNA的完整序列编码,这样的蛋白质由1条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白质结合在一起,故称为融合蛋白.融合蛋白的特点转录和翻译起始从正常的大肠杆菌序列开始,故通常可以产生高水平的融合蛋白;融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定;产生的融合蛋白较大,容易从蛋白质凝胶电泳中区别出夹,而且融合蛋白带

37、可以从凝胶上切下,经冷冻于燥,磨成粉末后即可作为抗原;有些融合蛋白带有信号肽,可以分泌到细胞外.这有助于蛋白质的分离和纯化.融合方式6×His Tag融合半乳糖苷酶融合trpE融合蛋白谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合硫氧还蛋白(Trx)融合麦芽糖结合蛋白(MBP)融合碱性磷酸酶(phoA)启动子和信号序列融合表达的蛋白,在分离纯化过程中往往需要去除表达时额外引入的融合片段.因此需要用不同方法将其裂解,通常有:1,化学裂解法:特异识别特定的氨基酸残基或一组氨基酸残基.但化学裂解法裂解位点的特异性低,有时可能对目标蛋白产生不必要修饰. 2,酶解法:反应条件温和,具有高度的特异性.常用的酶

38、有Xa因子,凝血酶,肠激酶,凝乳酶,胶原酶等.但酶解法成本高 ,反应时间长,更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目标蛋白中,造成新的污染,提高纯化的复杂性. 3,IMPACT系统(intein mediated purification with an affinity chitin-binding Tag) 该系统是由枯草杆菌来源的几丁质结合域(5kD,chitin binding domain,用于亲和纯化)和酵母蛋白质剪接元件 intein组成一个双效的融合标签. intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解,释放出与之相连的目的蛋白.因此融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目的蛋

39、白与fusion tag的精确切割.但含有较多二硫键的蛋白不适合这一系统. 分泌型表达为减少所需蛋白质在宿主体内被蛋白酶降解.或者使蛋白质能够在体外正确折叠和便于提纯,经常需要将被表达的蛋白质分泌到细胞外,因此要用分泌型载体.分泌型载体的优点一些在胞内被蛋白酶降解的蛋白质在细胞周质中很稳定;一些在胞内无活性的蛋白质在分泌后便具有活性,分泌可能使蛋白质能够正确折叠;产生的蛋白质没有氨基末端甲硫氨酸,因为切割位点在信号肽与编码序列之间,甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性.蛋白质能够在大肠杆菌中进行分泌,至少要具备3个要素:有一段信号肽;在成熟蛋白质内有适当的与分泌相关的氨基酸序列;细胞内有相应的转运机

40、制.信号肽长度一般为1530个氨基酸残基.真核生物和原核生物的信号肽在结构上都有以下特征:信号肽一般都不长,在氨基末端有一段带正电荷的氨基酸序列,往往是精氨酸或赖氨酸残基,其数目为13个;有一个高度疏水的核心区,含亮氨酸或异亮氨酸残基,位置可以从带正电荷的氨基酸延伸到含切割位点的区域;含有能被信号肽酶水解的切割位点,这个位点常常在丙氨酸之后,有的是在甘氨酸或丝氨酸之后.分泌型载体也有缺点,例如目的蛋白质的产量往往很低,以及信号肽不能被切除或切在错误位置上等.非融合蛋白的表达指在细菌内表达的蛋白质以真核蛋白质mRNA的AUG为起始,在其氨基端不含任何细菌多肽序列.优点:表达产物的生物学功能接近于

41、生物体内天然蛋白质.缺点:容易被细菌蛋白酶破坏.包含体(包涵体) 表达的蛋白质经常是不溶的,会在细菌内与细菌杂蛋白,核酸等成分形成不溶性聚合体即包含体(inclusion body),尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时,就很容易形成包涵体.生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成速度太快,多肽链相互缠绕,影响了多肽链的正确折叠,导致疏水基团外露等.包含体的形成有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解,并且非常有利于分离表达产物.但包含体形成后,表达蛋白不具有生物活性,因此必须溶解包含体并对表达蛋白进行复性.包含体的制备可通过常规方法如超声波,匀浆等使菌体破碎后,离心就可得到.密度梯度离心后则可得

42、到高纯度的包含体.包含体通常不溶于水,加入强蛋白质变性剂后方可溶解.根据包含体中蛋白质种类的不同,通常用68mol/L盐酸胍或910mol/L尿素溶解包含体.采用pH 2.04.5的酸性溶液也可使包含体溶解.形成包含体的表达蛋白恢复其活性的过程称为包含体蛋白质复性,其基本原理是随着变性剂浓度的降低,表达蛋白恢复其天然构型.常用的复性方法有逐步稀释法或透析法等.酵母表达系统1,基因背景了解清楚,上游操作简单,生长迅速,非常适于大规模发酵.2,具有一定的加工及修饰能力:如二硫键的正确形成,前体蛋白的水解加工.表达产物与天然蛋白相同或类似.3,可将异源蛋白基因与N-末端前导肽等信号肽融合,指导新生肽

43、的分泌,在分泌中可对表达的蛋白进行糖基化修饰,但其修饰糖链与高等真核细胞并不相同. 4,可移去起始甲硫氨酸,避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题. 缺点:产糖量过多因而损坏蛋白质的生物活性,安全性等;糖基化修饰与高等真核细胞并不相同. 载体:均为大肠杆菌和酵母菌的"穿梭"质粒.有附加体型载体和整合体型载体两种.常用启动子:GAL1,AOX1,AUG1,TEF1 等.酵母表达系统载体有:1,整合型载体: 导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染色体基因组DNA整合,稳定性高,但基因拷贝数低. 2,附加体型载体:在酵母宿主中拷贝数量大,但在传代过程中易丢失,影响重组菌的稳定性和表达量

44、. 常见宿主有:酿酒酵母,裂殖酵母,克鲁维酵母,巴氏毕赤酵母等. 酿酒酵母表达系统多为附加型载体,巴氏毕赤酵母,多形汉逊酵母表达系统为整合型载体.克鲁维酵母表达系统则兼而有之.酿酒酵母表达系统缺乏强有力的启动子,分泌效率差,表达质粒易于丢失.目前,毕赤酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统.它以甲醇作为唯一的碳源.产量较高.翻译后的加工更接近哺乳动物 .如日本绿十字公司利用该系统可以达到公斤级水平的人血清白蛋白的生产.商品化酵母表达系统有毕赤酵母(Pichia)系统 (invitrogen)和Saccharomyces酿酒酵母表达系统(invitrogen).毕赤酵母系统重组蛋白表达量可高达1

45、2 g /L,表达量最高.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是以杆状病毒为载体,昆虫细胞为宿主的表达系统. 1,表达效率高.重组蛋白的表达水平最高可达到细胞总蛋白的50%.2,属于真核表达系统.有糖基化作用,脂肪酸酰基化作用,氨基末端乙酰化作用以及磷酸化,有利于表达产物形成天然的高级结构,保持原有的生物活性与功能.3,杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖.4,杆状病毒属于昆虫病毒.具有高度特异的宿主范围,对脊椎动物和植物均无致病性.病毒重组因失去多角体保护,在自然界的生存能力很弱,因此比较安全.5,应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因可表达毒性蛋白. 6,杆状病毒表达载体通用性广

46、.可表达来自病毒,细菌,真菌,植物和动物几乎所有的蛋白,并且能表达带有内含子的外源基因. 7,重组杆状病毒除在体外昆虫培养细胞表达外源基因外,还能感染昆虫活体,在体内高效表达外源蛋白.宿主细胞生长慢, 培养基昂贵, 含有免疫宿主蛋白, 杆状病毒感染会导致宿主死亡,因此每一轮蛋白合成均需重新感染,昆虫细胞内的糖基化方式与脊椎动物细胞内的糖基化方式有一定的差异,其糖蛋白的糖链结构多为简单的不分支结构. 启动子采用多角体蛋白启动子.宿主细胞通常来源于双翅目昆虫,包括果蝇,蚊子.来源于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9细胞系是最常用的宿主细胞.商品化系统:BaculoDir

47、ect 杆状病毒表达系统(invitrogen),典型的杆状病毒表达系统是利用大肠杆菌中位点特异的转座或昆虫细胞中的同源重组来产生重组杆状病毒. DES -Drosophila expression system 结合了昆虫细胞高表达水平和哺乳动物细胞的稳定表达的优点. 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统,是目前应用最广泛的动物细胞表达系统.其优点和缺点都极其显著.产物的抗原性,免疫原性和功能与天然蛋白质最接近,糖基化等后加工最精确.一般会产生正确加工的,有活性的蛋白.但该表达系统的表达水平较低,培养基昂贵,生长缓慢,含有过敏物质等缺点在实际应用过程中较难避免

48、.哺乳动物细胞表达系统通常用来生产用常规方法无法获得的真核细胞蛋白.如EPO,TNF受体,基因工程单抗等.CHO(中国仓鼠卵巢)是目前重组糖蛋白生产的首选体系. 载体:1,病毒性载体系统,包括逆转录病毒载体及其它DNA病毒载体.优点:能够高效导入外源基因.缺点:包装时对其基因组的长度有严格的限制,插入外源基因一般较短.2,质粒性载体系统.优点:适用于多种细胞;安全.缺点:导入外源基因的效率不如逆转录病毒. 商品化系统:ViraPower 慢病毒表达系统,是第一次实现在不分裂的哺乳动物细胞中进行稳定的高水平基因表达.Adeno-X 表达系统-最有效的腺病毒系统之一.BD Adeno-X Expr

49、ession System (Clontech)可以在2周内获得高效价的腺病毒,其效率远高于其他腺病毒系统.BD Adeno-X Tet-On & Adeno-X Tet-Off Expression Systems (Clontech) 可表达毒性蛋白质.BD RevTet-On & RevTet-Off Gene Expression Systems (Clontech) 表达效率高. 体外表达系统(无细胞表达系统)体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统,是一种相对胞内表达系统而言的开放型表达系统. 优点:内源型mRNA干扰很小,操作程序简单,获得重组蛋白周期很短.主要用于蛋

50、白质快速分析鉴定;基因转录和翻译调控机理研究;分子间的相互作用的研究. 缺点:昂贵;操作要求高;表达量不够高. 1,兔网织红细胞系统,由新西兰大白兔制备.2,麦胚提取物系统,可稳定地表达一些在兔网织红细胞中翻译受到抑制的DNA. 3,原核体外翻译系统(S30原核体外翻译系统), E.coli S30提取物由OmpT内切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制备,所以在S30系统中表达基因可以增加产物的稳定性.目前多家公司有商业化产品,常见的有:RTS E.Coli 系统;RTS100 wheat germ CECF系统 (Roche)TNT 快速偶联转录/翻译系统 (Promega);Go

51、ld TNT T7 Express 96系统 (Promega),该系统有SP6和T7两种类型,适合在96孔板上进行大规模高通量筛选分析; TNT T7 Quick for PCR DNA (promega),PCR DNA 的TNT T7快速系统从PCR反应液中直接取样,无需纯化DNA,直接用于偶联的转录/翻译反应; TNT 偶联小麦胚芽抽提系统 (promega).动物/植物表达系统(转基因动物/植物) 转基因动物指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞,使外源基因与动物本身的基因组整合,并随细胞的分裂而增殖,从而将外源基因稳定的遗传给下一代的工程化动物.1981年,第一次成功地

52、将外源基因导入动物胚胎,创立了转基因的动物技术1982年获得转基因小鼠,目前已有转基因兔,绵羊,猪,鱼,昆虫,牛,鸡,山羊,大鼠等转基因动物. 优点:1,高效性.2,表达产物具有与高等动物表达相一致的免疫原性和生物活性,表达产物可糖基化,酰胺化,磷酸化.3,来源广,可进行大量田间栽培,成本低. 抗虫棉,彩色棉,抗虫玉米,大豆等,都已进入产业化和商品化阶段.表达产物包括疫苗,抗体及其片断,细胞因子,酶及其它药用蛋白和生物活性肽等. 重组蛋白质表达的基本程序包括:1,目标基因克隆入表达载体,获得表达质粒.2,表达质粒导入宿主细胞.3,目标基因在宿主中的表达.4,目标蛋白的分离,纯化. 重组表达系统

53、一般包含表达载体和表达宿主.表达载体包含基因/外源DNA序列,表达载体,强启动子,核糖体结合位点(SD序列),终止子,选择标记,复制子等构件. 外源基因在原核细胞中的表达克隆菌:BL21,JM109表达菌:BL21(DE3),JM109 (DE3)1.重组质粒转化:重组质粒各1 l,加入到100 l感受态大肠杆菌中,设空质粒为阳性对照和感受态大肠杆菌为阴性对照.37,培养16h.2.细菌扩增:用无菌接种环从平板上挑取5个克隆,分别接种到3ml含50 g/ml氨苄青霉素的LB培养基中,并设阴性对照,300r/min振摇3hrs以上.3.诱导表达:当振摇至OD值=0.4.每管菌液各取出1ml加入I

54、PTG至终浓度为1mmol/L,另吸出1ml不加IPTG作对照.37,300r/min,培养4h.4,12000r/min离心1min,弃上清.每管加1ml PBS,混匀,同法离心.弃上清,每管加入50 l PBS,50 l 2×loading buffer,重悬沉淀,100煮沸5min,置-20备用.基因表达产物的检测Northern杂交检测细胞中是否含有特定的mRNA,测定特定mRNA在总RNA中的比例,由此获得目的mRNA的转录情况.斑点杂交用特异性探针检查mRNA,并估计表达过程中mRNA的转录强度.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析诱导前后细胞中目的蛋白质的表达水平.如表达水平很

55、低,可用同位素作为放射性标记,如35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸进行代谢标记,然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影,或在Western杂交中用特异性单克隆抗体或多克隆抗体分析目的蛋白质存在与否及其含量.免疫学方法利用特异性抗体与目的蛋白质进行反应,经免疫沉淀,ELISA等免疫学方法,检测表达蛋白质.例如,免疫沉淀法可用于检测并定量分析多种蛋白质混合物中的靶抗原.这种方法很敏感,可检测出lOOpg的放射性标记蛋白质.当与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并用时,即可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况放射性标记靶蛋白的免疫沉淀以及其后的分析包括下列几个步骤:靶蛋白的放射性标记;裂

56、解细胞;特异性免疫复合物的形成;免疫复合物的收集及纯化;放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析.SDS-PAGESodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE : 鉴定蛋白质的相对分子量磷酸钠缓冲液(PBS):1mol/L Na2HpO4 68.4ml 1mol/L NaH2PO4 31.6ml.2. 2 ×loading buffer :0.1M Tris-HCl pH6.8,4% SDS,20% Glycerol,0.2 M DTT,0.2% Bromophenol Blue.3. Tris-甘氨酸缓冲

57、液:25mmol/L Tris, 250mmol/L甘氨酸,0.1%SDS.4.聚丙烯酰胺(Acrylamide;,N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(Bisacrylamide);十二烷基硫酸钠;N,N,N',N'-四甲基乙烯酰胺(TEMED;过硫酸胺;考马斯亮蓝R250 .1.洗净玻璃板,按说明书安装电泳装置.2.配胶:8%分离胶组分为:ddH2O 2.3ml,30% Acrylamide 1.3ml,1.5mol/L Tris (pH 8.8)1.3ml,10% SDS 0.05ml,10% 过硫酸氨 0.05ml,TEMED 0.004ml.混合后,注入已安装玻璃板的间

58、隙中,上覆纯水隔离空气.5%积层胶5ml组份为:ddH2O 3.4ml,30% Acrylamide 0.83ml,1.0mol/L Tris (pH6.8) 0.63ml,10% SDS 0.05ml,10%APS 0.05ml,TEMED 0.005ml.混合后,加入已凝聚的分离胶上,插入电泳梳子. 3.凝胶电泳:分别将各样品10 l加入凝胶梳孔中,留取一孔加入蛋白Marker10 l,空孔加入10 l 1 ×loading buffer置于垂直电泳槽内,向上下槽分别加入电泳缓冲液,56V稳压电泳至溴酚蓝指示剂泳动至积层胶与分离胶结合处(约20min左右),调整电压至105V,电泳至指示剂泳动至分离胶下端边缘(约50min左右)停止电泳.4.染色:将5倍体积染色液考马斯亮蓝R250加入染色缸中,摇床轻摇1h,至凝胶全部着色.5.脱色:反复更换脱色液至本底透明,成像仪摄片.原理:抗原抗体反应.酶联抗体,底物显色.Western Blot: 检测蛋白质的免疫反应性质谱检测;两端氨基酸测序;生物学活性测定. 表达载体(expression vector)要使克隆基因在宿主细胞中表达,就要将它放入带有基因表达所需要的各种元件的载体中,这种载