第二章固定化酶与固定化细胞

1、l酶应用中的一些问题：酶应用中的一些问题： 酶的稳定性较差酶的稳定性较差 除少数耐高温和耐酸的酶之外，大多数的酶在高温、除少数耐高温和耐酸的酶之外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活易变性失活 酶的一次性使用酶的一次性使用 酶在反应系统中与底物和产物混在一起，反应结束酶在反应系统中与底物和产物混在一起，反应结束后即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，使生后即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，使生产成本提高，并且难于连续化生产产成本提高，并且难于连续化生产 产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难 酶反应后成为杂

2、质与产物混在一起，给产物的进一酶反应后成为杂质与产物混在一起，给产物的进一步分离纯化带来一定的困难步分离纯化带来一定的困难一、一、 什么是固定化酶什么是固定化酶固定化酶被确定下来是在固定化酶被确定下来是在1971年第一届国际年第一届国际酶工程会议上提出并确定的。固定化酶是设计一种酶工程会议上提出并确定的。固定化酶是设计一种方法，方法，使酶被束缚在特殊的载体上，使它与整体的使酶被束缚在特殊的载体上，使它与整体的流动相分隔开，但能进行底物与效应物等的分子交流动相分隔开，但能进行底物与效应物等的分子交换。换。固定化酶的统一英文名称为固定化酶的统一英文名称为Immobilized Enzyme。可以看

3、成一般化学反应的固体催化剂一样对可以看成一般化学反应的固体催化剂一样对待，既具有酶的催化特性又具有一般化学催化剂的催待，既具有酶的催化特性又具有一般化学催化剂的催化特性化特性所谓固定化酶所谓固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能态存在的酶，能连续化地进行反应，反应后连续化地进行反应，反应后的酶可以回收，能反复使用，可实现自动化的酶可以回收，能反复使用，可实现自动化生产工艺的水不溶性酶，称固定化酶，有时生产工艺的水不溶性酶，称固定化酶，有时也叫水不溶酶。也叫水不溶酶。固定化酶现在的发展是不一定全是固定酶，固定化酶现在的发展是不一定全是固定酶，研究可以用研究可以用细

4、胞或细胞器、菌体进行固定细胞或细胞器、菌体进行固定，统称为固定化催化剂。统称为固定化催化剂。二、固定化酶的优点二、固定化酶的优点溶性酶的缺点溶性酶的缺点：1.酶是蛋白质，稳定性差，热、酸碱、有机溶剂对其有影响；酶是蛋白质，稳定性差，热、酸碱、有机溶剂对其有影响；2.不能回收，无法自动化、连续化生产；不能回收，无法自动化、连续化生产；固定化酶优点固定化酶优点：1.极易将固定化酶与产物、底物分开；极易将固定化酶与产物、底物分开；2.可以在较长时间内进行反复分批反应或装柱连续反应；可以在较长时间内进行反复分批反应或装柱连续反应；3.在大多数情况下能提高酶的稳定性，如提高抗有机溶剂的能力；在大多数情况

5、下能提高酶的稳定性，如提高抗有机溶剂的能力；4.酶反应过程能严格控制，能回收，自动化，连续化；酶反应过程能严格控制，能回收，自动化，连续化； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.更适合于多酶反应；更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量；可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低；酶的使用效率提高，成本降低；l固定化时，酶活力有损失固定化时，酶活力有损失l增加了生产成本，工厂初始投资大增加了生产成本，工厂初始投资大l与完整的菌体相比不适宜多酶反应，特与完整的菌体相比不适宜多酶反应，特别是需要辅助因

6、子的反应别是需要辅助因子的反应l胞内酶必须经过酶的分离手续胞内酶必须经过酶的分离手续l维持酶的催化活性及专一性维持酶的催化活性及专一性l固定化的载体必须有一定的机械强度，固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落，有利于不能因机械搅拌而破碎或脱落，有利于生产自动化、连续化生产自动化、连续化l固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍与底物的接近，以提高产量不妨碍与底物的接近，以提高产量l酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，反复使用酶能回收贮藏，反复使用三、固定化方法：固定化方法固定化方法 非共价结合

7、法非共价结合法 化学结合法化学结合法 包埋法包埋法 物理物理 离子交离子交 吸附法吸附法 换吸附换吸附 现在又有现在又有多孔物质包络法，超过滤法多孔物质包络法，超过滤法等等等等。 实际上，用实际上，用包埋法最多。包埋法最多。交联交联法法共价共价结合结合法法结晶结晶法法分散分散法法网格型网格型包埋包埋微囊法微囊法 各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较 吸附法吸附法固定化方法固定化方法 物理吸附法物理吸附法 离子吸附法离子吸附法 包埋法包埋法 共价键结合法共价键结合法 交联法交联法制备难易制备难易 易易 易易 较难较难 难难 较难较难 结合程度结合程度 弱弱 中等中等 强强 强强

8、强强活力回收活力回收 高高,酶易流失酶易流失 高高 高高 低低 中等中等再生再生 可能可能 可能可能 不能不能 不能不能 不能不能费用费用 低低 低低 低低 高高 中等中等底物专一性底物专一性 不变不变 不变不变 不变不变 可变可变 可变可变l结晶法结晶法 使酶结晶从而实现固定化的方法使酶结晶从而实现固定化的方法. 局限性局限性:在重复循环中酶会损耗在重复循环中酶会损耗l分散法分散法 通过酶分散于水不溶相从而实现固定化的方法通过酶分散于水不溶相从而实现固定化的方法 局限性局限性:活力低活力低l物理吸附法物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性载体的固定化方法酶被物理吸附于不溶性载体的固定化方法 局限性

9、局限性:与载体作用力弱与载体作用力弱,酶易脱落酶易脱落l离子结合法离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的方法酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的方法 局限性局限性:载体和酶的结合力弱载体和酶的结合力弱,易受缓冲溶液种类或易受缓冲溶液种类或pH的影响的影响.离离子强度高时酶易脱落子强度高时酶易脱落l常用的吸附剂：活性碳、氧化铝、硅藻土、常用的吸附剂：活性碳、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等；多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等；l吸附剂的选择：根据酶的特点、载体来源和吸附剂的选择：根据酶的特点、载体来源和价格、固定化技术的难度、固定化酶的

10、使用价格、固定化技术的难度、固定化酶的使用要求等；要求等；l特点：操作简便、条件温和、不会引起酶变特点：操作简便、条件温和、不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用，但结性失活，载体廉价易得，可反复使用，但结合力较弱，酶与载体结合不牢固易脱落。合力较弱，酶与载体结合不牢固易脱落。 物理吸附(氢键、疏水键氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载体上等作用力将酶固定于不溶性载体上)无机无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等） 吸附量小、有些酶发生吸附变性吸附量小、有些酶发生吸附变性有机有机吸附剂（纤维素、胶原等）吸附剂（纤维素、胶原等） 吸附量略大吸附量略

11、大(50mg/g载体载体),不产生变性失活，不产生变性失活，比较受重视。比较受重视。有些微生物分泌胶水一样的粘多糖，使微生物与固体物质有些微生物分泌胶水一样的粘多糖，使微生物与固体物质固定化。固定化。离子结合法： 在合适条件下（在合适条件下（pH、离子强度），酶的侧链离子强度），酶的侧链与载体发生离子交换的作用而达到的固定化，与载体发生离子交换的作用而达到的固定化，CM -纤维素纤维素、DEAE-纤维素，纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶,等吸附量等吸附量 50-150mg/g优点：操作方便，条件温和，可再生后反复使用操作方便，条件温和，可再生后反复使用缺点： 吸附力弱，不适宜的吸附力弱

12、，不适宜的pH,高盐浓度，高底物浓高盐浓度，高底物浓度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。可以改善的方法： 1.选择最佳条件操作（如温度、选择最佳条件操作（如温度、pH） 2.选吸附量大的载体，控制酶和载体量选吸附量大的载体，控制酶和载体量 3.采用高酶量吸附采用高酶量吸附 4.开发新载体开发新载体 5.对酶进行修饰后再进行交换吸附对酶进行修饰后再进行交换吸附如烃基如烃基-琼脂糖衍生物吸附在酸性琼脂糖衍生物吸附在酸性pH的酶的酶(脲脲酶酶)用亲和吸附剂用亲和吸附剂 ConA-葡聚糖能专一吸附糖蛋白葡聚糖能专一吸附糖蛋白 对酶进行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶对酶进

13、行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶+丙丙烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联再加再加DEAE-纤维素结合纤维素结合 结果结果：结合力增大：结合力增大(吸附量也大吸附量也大),也相当稳定，使也相当稳定，使 用寿命长，有时可以连续使用用寿命长，有时可以连续使用3个星期个星期吸附方法：吸附方法：1.静态吸附，自然吸附、解吸、再吸附的固定化方法。静态吸附，自然吸附、解吸、再吸附的固定化方法。效率低，时间比较长，而且不完全。效率低，时间比较长，而且不完全。2.电沉积，在载体附近加电极，酶移向载体表面的固电沉积，在载体附近加电极，酶移向载体表面的固定化方法。需要酶

14、在电场中不破坏，保持原来酶性定化方法。需要酶在电场中不破坏，保持原来酶性能。能。3.动力法固定化，酶与载体混合后搅拌等条件下进行动力法固定化，酶与载体混合后搅拌等条件下进行固定化，注意速度，不破坏酶和载体。固定化，注意速度，不破坏酶和载体。4.反应器固定化，载体装入反应器，再循环加入酶溶反应器固定化，载体装入反应器，再循环加入酶溶液达到固定化。但是吸附少，不适合的条件（液达到固定化。但是吸附少，不适合的条件（pH、盐等）容易解吸。注意操作条件。盐等）容易解吸。注意操作条件。最主要，更加有效的还是开发新的吸附剂。最主要，更加有效的还是开发新的吸附剂。l共价结合法共价结合法 酶与载体以共价键结合固

15、定的方法酶与载体以共价键结合固定的方法 局限性局限性:反应条件苛刻反应条件苛刻,操作复杂操作复杂,酶活回收率酶活回收率低低,酶的性质会发生改变酶的性质会发生改变l交联法交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法制成网状结构的固定化酶的方法 局限性局限性:反应条件激烈反应条件激烈,酶活回收率低酶活回收率低l通过共价键将酶与载体结合的固定化方法通过共价键将酶与载体结合的固定化方法l载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物素、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇

16、共聚物l共价键结合的条件：共价键结合的条件： 酶分子中的基团：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪酶分子中的基团：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基唑基 在载体上引入活泼基团使载体活化在载体上引入活泼基团使载体活化 活泼基团与酶分子上的某一基团反应形成共价键活泼基团与酶分子上的某一基团反应形成共价键 载体活化方法：重氮法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法载体活化方法：重氮法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法共价偶联：通过载体的功能基团与酶侧链基团上通过载体的功能基团与酶侧链基团上非必需基团非必需基团共价结合共价结合，制备成固体酶的方法。，制备成固体酶的方法。优点：应用最广，固定化结合牢、稳定而酶不丢优点：应

17、用最广，固定化结合牢、稳定而酶不丢失，可以连续使用。失，可以连续使用。载体要求：亲水载体优于疏水载体（酶蛋白结合量，固亲水载体优于疏水载体（酶蛋白结合量，固定化后酶活性，稳定性方面都比较好），定化后酶活性，稳定性方面都比较好），而且亲水基存在可以减少疏水基的有害影响。而且亲水基存在可以减少疏水基的有害影响。载体特点载体特点：1.结构松结构松 2.表面积大表面积大3.机械强度大机械强度大4.带有在温和条件下可与酶侧链基团共价偶联带有在温和条件下可与酶侧链基团共价偶联的功能基团的功能基团5.没有或很少有非专一性吸附没有或很少有非专一性吸附一般与亲和层析所需载体的要求、标准一致如如:天然纤维素或衍生

18、物天然纤维素或衍生物 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好亲和性好,机械性能差机械性能差 琼脂糖琼脂糖合成的：合成的： 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 多聚氨基酸多聚氨基酸 机械性能好，但有疏水结机械性能好，但有疏水结构构 聚苯乙烯，尼龙聚苯乙烯，尼龙 载体活化的方法：载体活化的方法：1)溴化氰溴化氰-亚氨碳酸基反应亚氨碳酸基反应 带带羟基的载体纤维素、葡聚糖、琼脂糖等是最的载体纤维素、葡聚糖、琼脂糖等是最常用的载体。在碱性条件下，载体的常用的载体。在碱性条件下，载体的OH基和溴化基和溴化氰反应，生成活泼的亚氨碳酸基，在弱碱中直接和氰反应，生成活泼的亚氨碳酸基，在弱碱中直接和酶的氨基进行共价偶联。酶的氨基进行

19、共价偶联。 最后一种是主要产物。氨基甲酸衍生物氨基甲酸衍生物亚氨碳酸酯亚氨碳酸酯衍生物衍生物2)重氮化重氮化芳香氨基载体方法特点：载体先用载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，再在处理成重氮盐衍生物，再在温和条件下和酶分子上相应基团直接偶联。温和条件下和酶分子上相应基团直接偶联。芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入蛋白质芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入蛋白质分子中分子中Tyr等集中的疏水区并偶联化而导致失效。等集中的疏水区并偶联化而导致失效。a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向性更大。当载体为电中性或疏水性时，这种倾向性更大。b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区的特性就当载体用亲水极性物质时，这种

20、疏水区的特性就大大减小了。大大减小了。 如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶固定化胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶固定化，偶联到重氮化的电中性载体如对氨基苄基纤维素时，产生固定化酶无活性无活性。偶联到重氮化的苯胺-多孔玻璃时，得到固化酶都具很高酶活性很高酶活性。l3） 异硫氰酸反应异硫氰酸反应含芳香氨基的载体先用含芳香氨基的载体先用硫芥子（或者光气）（或者光气）处理成处理成异硫氰酸盐的衍生物，这种产物在温和条，这种产物在温和条件件下，优先与酶分子的氨基反应，在中性下，优先与酶分子的氨基反应，在中性pH下优先下优先与与-氨基反应，可达到选择性偶联的目的。氨基反应，可达到选择性偶联的目的。含含羟基羟基的载体在碱性条件下

21、，和三氯三嗪等的载体在碱性条件下，和三氯三嗪等反应，引入卤素基后直接与酶的氨基、酚羟基或反应，引入卤素基后直接与酶的氨基、酚羟基或者巯基等偶联。者巯基等偶联。优点优点：制备后制备后 1）产物带正电荷有利于中性或碱性酶偶联）产物带正电荷有利于中性或碱性酶偶联 2）可与所有亲核基反应）可与所有亲核基反应 3）很少选择性）很少选择性 5）叠氮反应）叠氮反应 适用于适用于羟基，羧基，羧甲基羟基，羧基，羧甲基等载体例如羧甲等载体例如羧甲基纤维素或葡聚糖、聚氨基酸等。基纤维素或葡聚糖、聚氨基酸等。羧甲基纤维素为例：羧甲基纤维素为例： 羧甲基纤维素在酸性条件下用甲醇脂化羧甲基纤维素在酸性条件下用甲醇脂化 再

22、再用水合肼处理成酰肼用水合肼处理成酰肼 最后在亚硝酸作用下变成最后在亚硝酸作用下变成叠叠N衍生物衍生物在低温和在低温和pH7.58.5之间与酶的氨之间与酶的氨基直接偶联，也可以和羟基、酚羟基、巯基反应。基直接偶联，也可以和羟基、酚羟基、巯基反应。 6）酰氯酰化反应：）酰氯酰化反应：含含羧基羧基载体（如羧酸树脂）通过氯化亚砜处载体（如羧酸树脂）通过氯化亚砜处理成活泼的酰氯衍生物，再与酶偶联。理成活泼的酰氯衍生物，再与酶偶联。 -COOH+SOCl2- -COCL+ NH2-E -CONH-E 羧基载体羧基载体 氯化亚砜氯化亚砜 酰氯衍生物酰氯衍生物 7） 酸酐反应酸酐反应乙烯等和顺丁烯二酸酐的共

23、聚物，通过其活乙烯等和顺丁烯二酸酐的共聚物，通过其活泼泼酸酐基酸酐基直接与酶氨基偶联。生成的固定化酶一直接与酶氨基偶联。生成的固定化酶一般般有比较高的活力。有比较高的活力。 8） 缩合反应缩合反应利用利用羰二亚胺羰二亚胺的活化作用，使的活化作用，使氨基、羧基氨基、羧基直直接偶联，缩合为肽键的反应。载体成为活泼的酰接偶联，缩合为肽键的反应。载体成为活泼的酰基基异胍衍生物。异胍衍生物。当羧基载体与环二已基二亚胺（当羧基载体与环二已基二亚胺（DCCI）存在时，存在时，用用N- 羟基琥珀酰亚胺活化，在温和条件下羟基琥珀酰亚胺活化，在温和条件下,和酶的和酶的氨基反应氨基反应,缩合反应控制缩合反应控制pH

24、6,反应限于氨基。反应限于氨基。 9)巯基巯基-二硫基交换反应二硫基交换反应 巯基或二硫基巯基或二硫基载体通过载体通过巯基巯基-二硫基交换反应二硫基交换反应和和酶分子上的酶分子上的非必需巯基非必需巯基偶联，当功能基团为巯基，偶联，当功能基团为巯基，先用先用2，2吡啶二硫化物处理，变成二硫基，吡啶二硫化物处理，变成二硫基，生成的中间产物在酸性条件下与酶的巯基发生交生成的中间产物在酸性条件下与酶的巯基发生交换达到偶联。化合物在酸性条件下发生交换。在换达到偶联。化合物在酸性条件下发生交换。在大量巯基化合物存在条件下逆转为载体和巯基酶。大量巯基化合物存在条件下逆转为载体和巯基酶。 10)金属偶联反应金

25、属偶联反应 一些过渡态金属能使纤维素、尼龙、滤纸、酵一些过渡态金属能使纤维素、尼龙、滤纸、酵母细胞等直接转化成固定化的载体。母细胞等直接转化成固定化的载体。 方法：将上面这些材料浸入金属溶液中，过滤、：将上面这些材料浸入金属溶液中，过滤、洗涤后加酶而成。常用金属有钛、锡、锌、铁等洗涤后加酶而成。常用金属有钛、锡、锌、铁等氯化物，其机制目前还不清楚。氯化物，其机制目前还不清楚。 NH2-E-OH+金属氯化物金属氯化物- -O-M-Cl - + -O-M-NH 酶酶 (锡、锌锡、锌)MCl2利用双功能或者多功能试剂使酶与酶或微生利用双功能或者多功能试剂使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方

26、法。物与微生物细胞之间交联的固定化方法。通常用戊二醛，还有异氰酸酯等。通常用戊二醛，还有异氰酸酯等。OHC-(CH2)3- -CHO+E-CH=N-EN=CH-(CH2)3-CH=N-E-+CH- N N CH CH戊二醛属于同型，还有异型：甲苯戊二醛属于同型，还有异型：甲苯-2-异氰异氰-4-异硫氰交联可以在分子内，也可以在酶分子之间，异硫氰交联可以在分子内，也可以在酶分子之间，这是与酶量有关的一个问题这是与酶量有关的一个问题。酶浓度低时，交联发生在分子内 酶浓度高时，交联发生在分子间 固定化后，酶与载体成为不溶态的颗粒 缺点： 固定化后，往往颗粒小，机械性能差。固定化后，往往颗粒小，机械性

27、能差。克服的方法：克服的方法：1）酶先吸附在载体上，或者包埋在胶内，微囊）酶先吸附在载体上，或者包埋在胶内，微囊 内，再交联或者固定成酶膜，或者酶网颗粒。内，再交联或者固定成酶膜，或者酶网颗粒。2）酶先在硫酸胺或者丙酮中沉淀，再交联。）酶先在硫酸胺或者丙酮中沉淀，再交联。实验方法上的要点：实验方法上的要点： 1)交联条件激烈，需要保护性措施。 2)交联剂的链长和功能基团的选择问题。 只要选择适当，有利于建立某些分子内交联，亚只要选择适当，有利于建立某些分子内交联，亚基固定和四级结构维持，增加酶的稳定性。但链过长，基固定和四级结构维持，增加酶的稳定性。但链过长，疏水性上升，疏水性升高，对固定化酶

28、有害。疏水性上升，疏水性升高，对固定化酶有害。 偶联反应中的保护措施。 化学反应一般比较剧烈，为了减少酶的损失，可以采化学反应一般比较剧烈，为了减少酶的损失，可以采取如下措施：取如下措施： 1.采用适宜的固定化材料和方法。如重氮化注意采用适宜的固定化材料和方法。如重氮化注意 载体的亲水性和疏水性。载体的亲水性和疏水性。 2.严格控制反应条件，提高反应专一性。如与严格控制反应条件，提高反应专一性。如与-氨基反应，保护其他氨基。氨基反应，保护其他氨基。 3.用抑制剂或者底物保护酶活性中心和必需基团用抑制剂或者底物保护酶活性中心和必需基团 避免影响酶的活性构型和相应基团避免影响酶的活性构型和相应基团

29、酶的偶联量: 单位载体上偶联单位载体上偶联酶的总量酶的总量与与“相对酶活力相对酶活力”之间的之间的平衡。平衡。相对酶活力：指固定化酶和蛋白量与相等的原酶的活力比。指固定化酶和蛋白量与相等的原酶的活力比。 由于固定化时，受到由于固定化时，受到载体、方法、条件、酶反应系统的影响，的影响，即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。 1.只有达到一定的偶联量，酶活性达到最高。 2.超过一定的偶联量，酶过多集中于载体的局部，造成空间位阻效应，部分酶无法表现活性。随酶偶联量上升酶活性反而下降。寻找二者平衡点关系，才能使固定化酶活性达到最高。l网格型网格型l微囊型微

30、囊型 将聚合物单体和酶溶液混合后，再用聚合促将聚合物单体和酶溶液混合后，再用聚合促进剂进剂(包括交联剂包括交联剂)的作用而聚合，酶就包埋在载体的作用而聚合，酶就包埋在载体中达到固定化。中达到固定化。酶本身不参与反应，所以较安全酶本身不参与反应，所以较安全。但在聚合过程中有自由基产生及聚合时放出热，酶但在聚合过程中有自由基产生及聚合时放出热，酶与试剂间可能发生化学反应，这些因素可能会使酶与试剂间可能发生化学反应，这些因素可能会使酶失效，或者降低酶活性失效，或者降低酶活性。操作时注意条件的控制操作时注意条件的控制。l凝胶包埋法凝胶包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成将酶或含酶菌体

31、包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。 载体：琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、载体：琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂 天然凝胶包埋时条件温和、操作简便，对酶活性影响天然凝胶包埋时条件温和、操作简便，对酶活性影响小，但强度较差小，但强度较差 合成凝胶强度高，对温度、合成凝胶强度高，对温度、pH值变化的耐受性强，但值变化的耐受性强，但需要在一定的条件下进行聚合反应才能把酶包埋起来需要在一定的条件下进行聚合反应才能把酶包埋起来l半透膜包埋法半透膜包埋法 将酶或含酶

32、菌体包埋由在各种高分子聚合物制成的小将酶或含酶菌体包埋由在各种高分子聚合物制成的小球内球内 半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜 适用于小分子酶：脲酶、天门冬酰胺酶适用于小分子酶：脲酶、天门冬酰胺酶 、尿酸酶、过、尿酸酶、过氧化氢酶等氧化氢酶等1）格型包埋格型包埋 常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。先把酶与丙烯酰胺单体分散于疏水介质先把酶与丙烯酰胺单体分散于疏水介质,再进行聚合。再进行聚合。优点优点: 1.包埋容量包埋容量10-100毫克蛋白毫克蛋白/克单体。克单体。 2.改变单体与交联剂比例改变单体与交联剂比例,控制凝胶孔径的分布控制凝胶孔径的分

33、布, 改善酶的持留与底物和产物扩散转移状况。改善酶的持留与底物和产物扩散转移状况。 3.改变单体性质改变单体性质,可调整固定化酶的亲水和亲脂可调整固定化酶的亲水和亲脂 特性。特性。 缺点缺点:1.孔径过大孔径过大,有酶的丢失现象有酶的丢失现象,这时可以提高单这时可以提高单 体浓度体浓度 达到部分解决。达到部分解决。 2.单体单体15%,丙烯酰胺自身会导致酶失活。丙烯酰胺自身会导致酶失活。 可采用包埋和共价偶联结合。可采用包埋和共价偶联结合。 3.有自由基产生，聚合时会放热。有自由基产生，聚合时会放热。例子：例子： 如葡萄糖如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包埋于丙烯酰胺和磷酸脱氢酶包埋于丙烯酰胺和丙烯酸

34、中，然后再用羰二亚胺活化载体上的丙烯酸中，然后再用羰二亚胺活化载体上的羧基而共价偶联固定。羧基而共价偶联固定。2)微囊型包埋微囊型包埋常用的微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、醋常用的微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、醋酸纤维素等。酸纤维素等。主要是用几十到几百微米、厚度有主要是用几十到几百微米、厚度有250的的半透膜将酶包埋固定化。半透膜容许小分子半透膜将酶包埋固定化。半透膜容许小分子底物和产物自由出入囊的内外，囊的表面积底物和产物自由出入囊的内外，囊的表面积相对体积的比值大，底物和产物的交换进行相对体积的比值大，底物和产物的交换进行迅速迅速 例子：尼龙膜界面聚合包埋例子：尼龙膜界面聚合包埋(酶酶+己

35、二胺水溶液）己二胺水溶液）+庚二酰氯有机溶剂（氯仿）庚二酰氯有机溶剂（氯仿） 混合混合 乳化，二种单体乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯己二胺和庚二酰氯)在水相、有在水相、有机相交界处聚合机相交界处聚合 形成包埋酶的尼龙膜珠粒形成包埋酶的尼龙膜珠粒 Tween 20破乳化破乳化,得到微囊包埋酶得到微囊包埋酶界面凝聚法：界面凝聚法：硝酸纤维素硝酸纤维素:高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极度高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极度下降而凝固、聚合形成皮膜将酶固定化。下降而凝固、聚合形成皮膜将酶固定化。酶水溶液酶水溶液 + 硝酸纤维素硝酸纤维素 乳化分散乳化分散,加苯甲酸丁酯加苯甲酸丁酯,使纤维素在酶

36、周围凝聚，使纤维素在酶周围凝聚， Tween 20乳化后得到火棉胶微囊。乳化后得到火棉胶微囊。 如蔗糖酶可以达到如蔗糖酶可以达到1500mg/g聚合物聚合物优点：优点：1）纤维表面积和重量比值高）纤维表面积和重量比值高 2) 凝聚后酶稳定性好凝聚后酶稳定性好 3) 包埋量大包埋量大3)脂质体包埋如：胆碱如：胆碱-Ser + 卵磷脂卵磷脂胆固醇胆固醇 一定比例混合一定比例混合 直接喷入酶溶液或在瓶的壁形成膜直接喷入酶溶液或在瓶的壁形成膜,再加入酶溶液再加入酶溶液 二相迅速混合时自己形成脂质体表面。二相迅速混合时自己形成脂质体表面。 优点：优点：1.具有一定强度具有一定强度2.可以专一性地将酶带到

37、体内特定部位，再释放酶可以专一性地将酶带到体内特定部位，再释放酶3.脂质体可和某些如抗体结合赋予定向运转的功能脂质体可和某些如抗体结合赋予定向运转的功能多孔物质包络法：多孔物质包络法：利用棉布、尼龙布、金属死网、海绵、塑料利用棉布、尼龙布、金属死网、海绵、塑料等固定化放线菌、真菌组成盘状生物反应器，进等固定化放线菌、真菌组成盘状生物反应器，进行连续生产有机酸、糖化酶、四环素。行连续生产有机酸、糖化酶、四环素。这些材料有足够大，但又不十分大的空隙，能够这些材料有足够大，但又不十分大的空隙，能够使细胞进入空隙，通常为细胞直径的见倍大。使细胞进入空隙，通常为细胞直径的见倍大。超过滤法：超过滤法：利用

38、超过滤膜将细胞固定化。底物和产物可利用超过滤膜将细胞固定化。底物和产物可以自由进出超过滤膜，而摸内的细胞却出不来。以自由进出超过滤膜，而摸内的细胞却出不来。制备成膜反应器和生物传感器。但是需要防止细制备成膜反应器和生物传感器。但是需要防止细胞生长导致浓度过高而使超过滤膜破裂。胞生长导致浓度过高而使超过滤膜破裂。固定化细胞的制备应该具有固定化细胞的制备应该具有以下特点以下特点：1.需要控制固定化细胞的空隙度和大小。需要控制固定化细胞的空隙度和大小。2.选择的固定化材料容易和便宜。选择的固定化材料容易和便宜。3.方法简单容易，操作温和，少损伤细胞。方法简单容易，操作温和，少损伤细胞。4.有一定的网

39、状结构，在操作温度和有一定的网状结构，在操作温度和pH下不破坏。下不破坏。5.有良好的机械稳定性和化学稳定性，对细胞不反应。有良好的机械稳定性和化学稳定性，对细胞不反应。6.底物、产物可以自由扩散，由于底物和产物的抑制作用，底物、产物可以自由扩散，由于底物和产物的抑制作用， 应该让其更快扩散的能力。应该让其更快扩散的能力。7.固定化材料应该是惰性的固定化材料应该是惰性的8.单位体积内尽可能固定化更多细胞，如果是固定活性细单位体积内尽可能固定化更多细胞，如果是固定活性细 胞，更是如此。如果考虑大生产的固定化细胞的硬度，就需胞，更是如此。如果考虑大生产的固定化细胞的硬度，就需要综合考虑。要综合考虑

40、。在大生产中，尤其需要考虑在大生产中，尤其需要考虑1、5、6点点定向固定化问题定向固定化问题: 由于非定向固定化使得酶活性部分或者全部由于非定向固定化使得酶活性部分或者全部失失去活性。这是由于底物与酶的取向不适合。去活性。这是由于底物与酶的取向不适合。如何进行定向固定化？如何进行定向固定化？1. 1. 共价固定法共价固定法酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离活性位点的特定稀选择性地利用酶分子表面远离活性位点的特定稀有有基团基团( (如疏基如疏基) )进行反应，使该基团与载体上另一进行反应，使该基团与载体上另一基基团共价交联来固定

41、酶蛋白，使其活性中心朝向溶团共价交联来固定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液液方向，以达到控制其空间取向的目的。方向，以达到控制其空间取向的目的。CollioudCollioud用一个异双功能试剂进行研究。用一个异双功能试剂进行研究。该试剂通过三种方式与巯基光诱导交联该试剂通过三种方式与巯基光诱导交联: :1.1.直接由马来酰亚胺与巯基反应，并向目的直接由马来酰亚胺与巯基反应，并向目的分子引入一个碳烯分子引入一个碳烯; ;2.2.与琉基通过光化学反应交联与琉基通过光化学反应交联; ;3.3.热化学修饰后与巯基反应，并向目的分子热化学修饰后与巯基反应，并向目的分子引人一个碳烯。引人一个碳烯。他们利用这

42、种双功能试剂成功地实现了他们利用这种双功能试剂成功地实现了氨基酸、合成肽和抗体氨基酸、合成肽和抗体FabFab片段的定向固定。片段的定向固定。共价固定需要蛋白质分子表面有特异的基团共价固定需要蛋白质分子表面有特异的基团供反应，该基团必须远离活性中心供反应，该基团必须远离活性中心。然而特异基。然而特异基由低频氨基酸提供，在多数蛋白质分子表面难以由低频氨基酸提供，在多数蛋白质分子表面难以做做到，即使有，位置也不一定合适。到，即使有，位置也不一定合适。2 2 氨基酸置换法氨基酸置换法 利用基因定点突变技术利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面上合在蛋白质分子表面上合适位置置换一个氨基酸分子，通过该氨基

43、酸残基适位置置换一个氨基酸分子，通过该氨基酸残基特特殊的侧链基团控制固定方向。殊的侧链基团控制固定方向。半胱氨酸半胱氨酸为低频氨为低频氨基基酸，在蛋白质分子中的出现频率约为酸，在蛋白质分子中的出现频率约为2%2%，其巯基，其巯基可可以与载体的碘乙酰基团发生烷基化反应。半胱氨以与载体的碘乙酰基团发生烷基化反应。半胱氨酸酸还能与金属表面牢固结合，在二氢叶酸还原酶还能与金属表面牢固结合，在二氢叶酸还原酶C C未未端引人后，在金属表面固定的酶量野生型酶高端引人后，在金属表面固定的酶量野生型酶高4 4倍。倍。HuangHuang等通过定点突变在枯草蛋白酶分子表面等通过定点突变在枯草蛋白酶分子表面远离活性

44、中心的位置引入半胱氨酸残基。远离活性中心的位置引入半胱氨酸残基。经蛋白质空间折叠后暴露出经蛋白质空间折叠后暴露出CySCyS，然后利用然后利用CysCys残基上的疏基固定枯草蛋白酶分子，取得了较残基上的疏基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效果，固定效率和固定后催化活性有很好的固定效果，固定效率和固定后催化活性有很大大提高。特异性固定提高。特异性固定Kcat/KmMKcat/KmM的比值是随机固定的的比值是随机固定的3.43.4倍。非特异性吸附小于倍。非特异性吸附小于1%1%，固定化酶，固定化酶，4 4条件下条件下2525天保持原活性天保持原活性61%61%，室温下室温下2525天保持原活性

45、天保持原活性28%28%，而室温下非固定化酶而室温下非固定化酶2525天仅保持活性天仅保持活性12%12%。定点突变用于定向固定化要求对蛋白质的核定点突变用于定向固定化要求对蛋白质的核酸序列及空间结构有充分了解，蛋白质分子表面酸序列及空间结构有充分了解，蛋白质分子表面不不含所要含所要引入的氨基酸残基，而且引入的氨基酸不引入的氨基酸残基，而且引入的氨基酸不能能影响蛋白质分子的正常空间折叠及构象改变。影响蛋白质分子的正常空间折叠及构象改变。3 3 抗体偶联法抗体偶联法大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子有很多可供偶联的官能团与偶联方法。抗

46、体分子有很多可供偶联的官能团可可通过赖氨酸的通过赖氨酸的- -氨基或末端氨基、天冬氨酸的氨基或末端氨基、天冬氨酸的- -氨基、谷氨酸的氨基、谷氨酸的- -氨基或末端羧基进行一般性氨基或末端羧基进行一般性的的偶联。抗体的二硫键还原后形成的半分子亦可提偶联。抗体的二硫键还原后形成的半分子亦可提供供远离抗原结合位点的巯基作为偶联位点。远离抗原结合位点的巯基作为偶联位点。抗体分子抗体分子FcFc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上的氨基通过缩合反应可与载体上的氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛醛基若与载体上的酰肼通过腙键结合实现基若与载体上的酰肼通过腙键结合实现抗体

47、分子的定向固定，与，与随机固定相比，固定后抗体稳定性随机固定相比，固定后抗体稳定性提提高的同时免疫吸附活性也提高了高的同时免疫吸附活性也提高了3 3倍。倍。基因工程单链抗体是在基因水平上融合了抗基因工程单链抗体是在基因水平上融合了抗体轻链的可变区而形成的具有抗原结合活性的最体轻链的可变区而形成的具有抗原结合活性的最小小长度肽链。理论上用抗体库技术可筛选到任意物长度肽链。理论上用抗体库技术可筛选到任意物质质的抗体，而且可在大肠杆菌等生物体中表达，来的抗体，而且可在大肠杆菌等生物体中表达，来源源广泛，被称为广泛，被称为“第三代抗体第三代抗体”。基因工程单键抗。基因工程单键抗体的体的固定化可用碘乙酰

48、化等方法进行。固定化可用碘乙酰化等方法进行。蛋白蛋白A A是一类能与免疫球蛋白抗原结合位点之是一类能与免疫球蛋白抗原结合位点之外的区城结合的蛋白质分子。是金黄色葡萄球菌外的区城结合的蛋白质分子。是金黄色葡萄球菌的的一种胞壁成分，由单一肽链组成，分子中有四个一种胞壁成分，由单一肽链组成，分子中有四个高高亲和力结合免疫球蛋白分子片段的位点，己有重亲和力结合免疫球蛋白分子片段的位点，己有重组组产品问世，它有相对较高的热稳定性，在变性剂产品问世，它有相对较高的热稳定性，在变性剂存存在时，仍能保持天然构象。在时，仍能保持天然构象。 蛋白蛋白G G也是一种胞壁蛋白可结合大多数哺乳也是一种胞壁蛋白可结合大多

49、数哺乳动物动物IgGIgG的的FcFc片段。蛋白片段。蛋白A A和蛋白和蛋白G G都可以与很多都可以与很多动物的免疫球蛋目的动物的免疫球蛋目的FcFc片段高亲和力结合，将片段高亲和力结合，将蛋蛋白白A A和蛋白和蛋白G G分子中分子中FcFc结合域的基因融合结合域的基因融合, ,产生的产生的融合蛋白称为蛋白融合蛋白称为蛋白A/GA/G。其抗体结合的广泛性强于它的任何一个母体其抗体结合的广泛性强于它的任何一个母体分子，蛋白分子，蛋白A/GA/G以分泌型表达于枯草杆菌中，以分泌型表达于枯草杆菌中，含含422422个氨基酸，其中个氨基酸，其中4343个赖氨酸，等电点个赖氨酸，等电点4.2,4.2,p

50、H5pH5一一8 8，蛋白，蛋白A/GA/G的免疫球蛋白结合活性与的免疫球蛋白结合活性与pHpH无关。无关。 蛋白蛋白A/GA/G将蛋白将蛋白A A和蛋白和蛋白G G的优点集于一身，的优点集于一身，若将蛋白若将蛋白A/GA/G固定后，通过其与抗体分子抗原结合固定后，通过其与抗体分子抗原结合区以外的区城结合，可实现免疫球蛋白分子区以外的区城结合，可实现免疫球蛋白分子( (抗体抗体酶或抗原结合片段酶或抗原结合片段) )的定向固定。的定向固定。4 4 生物素一亲和素亲合法生物素一亲和素亲合法生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(0.0001%)(80%活性。活性。

51、 l 表表1不同固定化方法的比较不同固定化方法的比较l carriers Recovery of enzyme activity%l Agar(琼脂琼脂) 54.0l polyacrvlamlde l5.24l Gelatin (凝胶凝胶) 40.77l carrageenan(卡拉胶卡拉胶) 69.13l Glutaraldehyde (戊二醛戊二醛) 0l pEIGlutaraldehyde l6.20l pEICarrageenan 25.40表表2卡拉胶浓度对固定化细胞酶活力的影响卡拉胶浓度对固定化细胞酶活力的影响concentration of recovery of The gel

52、 strength Activityu carrageenan enzyme activity （g/cm2） 1.3 3502.5 64.1 483 1.7 3745.7 68.5 551 2.0 4039.7 73.9 669 2.4 3841.9 70.3 722 2.7 3157.4 57.8 945 3.0 2838.4 51.9 1134 3.3 2738.3 50.1 1231 表表3 细胞浓度与固定化细胞酶活力关系细胞浓度与固定化细胞酶活力关系Concentration Recovery of enzyme Activity/u cells activity/ 3.2 3208

53、.2 64.7 6.5 3522.8 71.1 13.4 4849.2 97.8 20.2 5612.2 113.2 游离酶游离酶4956.2 l生物化学及分子生物学基础研究生物化学及分子生物学基础研究l亲和分离系统亲和分离系统l药物控释载体药物控释载体l生物传感器生物传感器l其他其他l酶的结构与功能研究酶的结构与功能研究 阐明酶反应机理阐明酶反应机理 酶亚基性质的研究酶亚基性质的研究 揭示酶原激活机理揭示酶原激活机理 研究蛋白质研究蛋白质-核酸分子结构核酸分子结构l生物活性蛋白的定向固定作为揭示蛋白内部反应和功生物活性蛋白的定向固定作为揭示蛋白内部反应和功能的工具能的工具 利用合适的抗体进行

54、蛋白质的定向固定化利用合适的抗体进行蛋白质的定向固定化 利用糖蛋白中的糖组分实现定向固定利用糖蛋白中的糖组分实现定向固定 利用硼酸盐亲和凝胶定向固定利用硼酸盐亲和凝胶定向固定 使用金属络合物定向固定使用金属络合物定向固定 生物素生物素-亲和素系统亲和素系统 利用定点诱变实现蛋白定位吸附利用定点诱变实现蛋白定位吸附l 从亲和分离的目的和模式考虑可分从亲和分离的目的和模式考虑可分3种类型种类型: 将某种作为配基的生物分子偶联于固相载体上将某种作为配基的生物分子偶联于固相载体上制成亲和吸附剂制成亲和吸附剂,用作色谱的填料来分离与之特用作色谱的填料来分离与之特异结合的配体异结合的配体,然后将配体洗脱下来并回收然后将配体洗脱下来并回收,统称统称为亲和色谱法为亲和色谱法,如固定化抗体用于相应抗原的分如固定化抗体用于相应抗原的分离离 将配基偶联于载体上用于