免疫学实验——改

1、白细胞介素3535对肝癌小鼠T T淋巴细胞的影响第三组研究背景肿瘤已成为人类健康的头号杀手，肿瘤的治疗研究也是生物医学领域一个炙手可热的方向。肿瘤抗原被机体免疫系统所识别，并由此激发特异性免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫。适应性免疫效应细胞包括CD8+CTL、CD4+Th以及固有免疫细胞包括NK细胞、巨噬细胞、NKT细胞等参与了机体的抗肿瘤作用。肿瘤的体液免疫主要是抗肿瘤抗体对肿瘤细胞的破坏效应。除此之外，免疫效应分子还有干扰素、肿瘤坏死因子。研究现状IL-35IL-35IL-35是一种由调节性T细胞(Tr)分泌具有免疫负调作用的新型细胞因子，由p35和EBI3亚基通过二硫键结合形成。作为IL

2、-12家族的一员，IL-35通过抑制IL-17等效应分子发挥免疫调节作用,研究表明,Tr、IL-35和Th17参与了自身免疫性疾病、炎症与肿瘤的免疫调节。【1】研究现状T淋巴细胞CD4表达于60%65%T细胞及部分NKT细胞，巨噬细胞和树突状细胞。CD4+Th细胞不仅在CD8+CTL激活中起重要辅助作用，本身也能产生细胞因子参与抗肿瘤，趋化因子能招募CTL和巨噬细胞等到肿瘤局部发挥效应，IFN可激活巨噬细胞，增加其对肿瘤细胞的吞噬和杀伤作用，TNF诱导肿瘤细胞凋亡。CD4+T细胞也可直接杀伤肿瘤细胞。CD8+T细胞接受抗原提呈细胞的信号和CD4+Th细胞释放的细胞因子共同作用下分化为CTL。C

3、TL是抗肿瘤免疫的主要效应细胞。实验设计本实验将通过观察CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润情况,检测血清IL-12、IL-2和IFN-浓度等指标，探讨IL-35对肝癌小鼠T淋巴细胞的影响。经相关文献的数据得，若仅注射pxx-neo质粒，肿瘤细胞周围很少浸润CD4+和CD8+淋巴细胞，所以本实验通过注射pxx-IL-12来使浸润结果明显。实验设计实验室要求实验步骤观察指标统计分析预期实验结果实验设计实验室要求实验室要求实验仪器实验仪器小鼠IL-12、IL-2和IFN一Y检测试剂盒(购自美国R&D公司)荧光显微镜注射器组织匀浆机恒温水浴箱切片机实验设计实验室要求实验室要求实验对象实验对象32

4、只8一12周龄雄性BALB/c小鼠（购自XX公司）。实验设计实验室要求实验室要求药品试剂药品试剂小鼠肝癌细胞1mg/ml胶原酶抗CD4、CD8抗体及其对照抗体pXX(质粒)-IL-35 1g.pXX(质粒)-IL-12 1g.pxx-neo 1g.10%马血清0.1%DAPI实验设计实验步骤实验步骤建立肿瘤模型建立肿瘤模型小鼠皮下接种体外传代的BNL肝癌细胞待肿瘤长至1cm时将肿瘤取出、碾碎,溶于30mlIV胶原酶(1mg/ml)置37消化30min,平衡盐溶液洗涤以无菌生理盐水稀释后，用血球计数板进行活细胞计数，调整细胞数为1106，制成肿瘤细胞悬液每只小鼠皮下接种1x106皮下传代的BNL

5、细胞。实验设计实验步骤实验步骤小鼠分组小鼠分组实验设计观察肿瘤淋巴细胞浸润情况观察肿瘤淋巴细胞浸润情况终止体内实验时,取皮下肿瘤行冰冻切片,将切片室温下用10%马血清封闭后,分别加入抗CD4、CD8抗体(l:50稀释)室温反应lh,洗涤后加人荧光标。记二抗室温反应lh,0.1%DAPI复染细胞核后,荧光显微镜观察CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润情况,每个标本观察5个高倍视野。实验设计实验步骤实验步骤小鼠分组小鼠分组可行性分析本实验设计方案合理,分组、对照实验兼有。实验动物和实验器材、试剂由实验中心提供，实验时间充裕，经费充裕。实验设计均是基于一定的文献基础，根据前人的实验结果，该实验流程和方法

6、是完全可行的。预期实验结果在注射质粒的数天后，各组小鼠的肿瘤大小有明显的差异，大小为：组1组2组3对照组。肿瘤周围淋巴细胞浸润状况不同，浸润的淋巴细胞的密度：对照组组3组2组1.血清中INF-,IL-12的浓度：对照组组3组2组1.实验讨论研究表明，分泌研究表明，分泌IL-35IL-35的的CD8CD8+ +CTLA4CTLA4+ +肿瘤抗原特异肿瘤抗原特异性性TregTreg，该细胞以，该细胞以IL-35IL-35依赖方式抑制依赖方式抑制CD4CD4+ +T T细胞细胞的增殖效应，进而抑制抗肿瘤的细胞免疫应答。的增殖效应，进而抑制抗肿瘤的细胞免疫应答。【2 2】荷瘤机体免疫机制的失能不是由于

7、缺乏肿瘤抗原，荷瘤机体免疫机制的失能不是由于缺乏肿瘤抗原，可能是由于肿瘤细胞表达可能是由于肿瘤细胞表达IL-35IL-35，抑制，抑制T T淋巴细胞淋巴细胞增殖，而抑制了机体的细胞免疫应答。增殖，而抑制了机体的细胞免疫应答。参考文献1岳朝艳，马妍慧，沈立松.新型免疫抑制因子IL-35研究新进展【J】.国际免疫学杂志，2012,35（1）：18-202陈爽，鞠晓红，郑文彧，赵良中.IL-35与人类疾病关系的研究进展【J】.免疫学杂志，2014,30（7）：645-6493 Xiaojin Sha,Shu Meng,Xinyuan Li,Hang Xi;Interleukin-35 inhibits endothelial cell activation by suppressing MAPK -AP-1 pathway;June 22.20154Wang W