细胞培养技术实用篇

1、第三章第三章 细胞培养基本技术细胞培养基本技术 王王 云云 动脉粥样硬化研究所动脉粥样硬化研究所活细胞：长时间、直接观察、研究活细胞的形活细胞：长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构和生命活动态、结构和生命活动可可控制：控制：选择特定的细胞种类、性质、阶段选择特定的细胞种类、性质、阶段可可控制调节条件：物理、化学、生物等控制调节条件：物理、化学、生物等可可采用各种研究技术、记录方法采用各种研究技术、记录方法样品均一样品均一性：来源于同一组织同一种细胞性：来源于同一组织同一种细胞经济、规模经济、规模人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同缺乏体内缺乏体内

2、的系统作用、失去神经体液的调节和的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响细胞相互间的影响体外体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环境中，必然发生变化。境中，必然发生变化。细胞培养的基本操作技术细胞培养的基本操作技术原代培养原代培养(primary culture)(primary culture)传代培养传代培养(subculture)(subculture)体外培养细胞的体外培养细胞的影响因素影响因素细胞培养细胞培养污染及对策污染及对策培养细胞的培养细胞的生长测定生长测定方法方法细胞细胞冻存和复苏冻存和复苏组织培养组织培养(Tissue Cult

3、ure)(Tissue Culture)： 指的是从体内取指的是从体内取出组织出组织，模拟，模拟体内生理环境，使之生存和生长并体内生理环境，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。维持其结构和功能的方法。器官培养器官培养（Organ CultureOrgan Culture）： 培养的是器官的培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。存、生长和保持一定功能的方法。细胞培养细胞培养(Cell Culture)(Cell Culture)： 培养物是单个细胞培养物是单个细胞和细胞群。和细胞群。原代培养（原代培养（

4、primary cultureprimary culture）：从体内取出细：从体内取出细胞或组织的第一次培养。胞或组织的第一次培养。传代传代（passagepassage）也称再也称再培养。无论培养。无论是否稀释，是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。即称为传代或传代培养。也称再培养。细胞系细胞系（cell linecell line）：原代培养物经首次传代：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系成功后即为细胞系细胞株（细胞株（cell straincell strain）：通过选择法或克隆形成法：通过选

5、择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。志的培养物称细胞株。汇合（汇合（confluentconfluent）：细胞相互连接成片占据所有底：细胞相互连接成片占据所有底物面积。物面积。接触抑制（接触抑制（contact inhibitioncontact inhibition）：细胞汇合相互）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象接触后失去运动的现象 由于由于体外培养体外培养的的细胞没有细胞没有抗感染抗感染能力，能力，因此因此防污染防污染是决定是决定培培养成功养成功的首要条件的首要条件。一切一切操作需要操作需要保证保

6、证无菌无菌和和有条不紊。有条不紊。制定制定好好实验计划和操作实验计划和操作程序程序有关有关数据的计算要事先做好。数据的计算要事先做好。准备准备各种所需器材和各种所需器材和物品，清点物品，清点无误后将其无误后将其放置放置在操作在操作场所场所( (培养室、超净台培养室、超净台) )内，然后开始消毒内，然后开始消毒。避免避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。染机会。地面地面每天每天都要用都要用0.2%0.2%的新洁尔灭拖洗地面的新洁尔灭拖洗地面次次( (拖布拖布要专用要专用) )，紫外线照射消毒，紫外线照射消毒30-50min30-50min超超净工

7、作台台面净工作台台面每次实验前要用每次实验前要用7575酒精擦洗。然酒精擦洗。然后紫外线消毒后紫外线消毒30min30min。消毒消毒时工作台面上时工作台面上用品用品布局合理布局合理，不要，不要过多过多或重叠或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。一些一些操作用具操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用等用75%75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 原则上和外科手术相同原则上和外科手术相同。仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射线

8、照射30min30min的清洁的清洁工作服工作服在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用7575酒精消酒精消毒手毒手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 专用鞋或专用鞋或带鞋套带鞋套在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要要点燃酒精灯点燃酒精灯。按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。处并经过烧灼进行。如

9、实验用品需火焰灭菌，如实验用品需火焰灭菌，冷却冷却后接触培养细胞，后接触培养细胞，以防烧死细胞。以防烧死细胞。 进行培养时，动作要进行培养时，动作要准确敏捷准确敏捷不能不能太快，太快，否则否则空气流动增加污染机会。空气流动增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。用火焰烧灼消毒或取备品更换。 l取材的组织用培养液浸泡，取材的组织用培养液浸泡，44运送，运送，24h24h内尽快培养。内尽快培养。l取材取材时应严格时应严格无菌无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污

10、染组织可用青链去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。霉素和制霉菌素漂洗。l原代培养原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富营养丰富的的培养液。培养液。l一般来讲一般来讲, ,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养胚胎组织较成熟个体的组织容易培养; ;分化低分化低的较分化高的组织容易生长的较分化高的组织容易生长; ;肿瘤组织较正常组织容易肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用培养。取材时应尽量选用易培养易培养的组织进行培养。的组织进行培养。l为了为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体

11、外培养与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。本，对供体来源、部位及一般情况做记录。机械机械法法：适于较：适于较柔软柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、的组织，如脑、脾、淋巴结、胸腺等。剪切组织为胸腺等。剪切组织为1mm1mm3 3碎块后，置于组织匀浆碎块后，置于组织匀浆器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。化学化学法法：胰蛋白酶、胶原酶、：胰蛋白酶、胶原酶、EDTAEDTA法法细胞悬液细胞悬液的分离方法：低速离心法、密度梯度离的分离方法：低速离心法、密度梯度离心法心

12、法低速离心低速离心法法： 血液和体液等细胞悬液血液和体液等细胞悬液500-500-1000rpm1000rpm离心离心5-10min5-10min。离心速度过大、时间过。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。长，会造成细胞损伤和死亡。密度梯度离心密度梯度离心法法： 用离心法将细胞分到不同用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的细胞。常用介质有于分离密度不等的细胞。常用介质有FicollFicoll 400400，PercollPercoll，泛影葡胺等。，泛影葡胺等。对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。对细胞间

13、的蛋白质水解，使细胞离散。消化效果与消化效果与PHPH值、温度、酶浓度和组织块大小与值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关。硬度有关。适于消化细胞间质较少的适于消化细胞间质较少的软组织，软组织，能有效地分离能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效但若与胶原子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效但若与胶原酶合用能增加其对组织的分离作用酶合用能增加其对组织的分离作用 。钙镁离子和血清抑制其活性钙镁离子和血清抑制其活性。常用剂量为常用剂

14、量为0.25%0.25%，PH8PH8，温度，温度3737水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影响不大。响不大。产品有产品有 等型，分别适用于分离肝细胞、等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞及纤维组织。胰岛、脂肪细胞及纤维组织。钙镁离子和血清不影响活性钙镁离子和血清不影响活性，PH6.5-7PH6.5-7常用剂量为常用剂量为200U/ml200U/mlEDTAEDTA能与细胞上的能与细胞上的钙、镁离子钙、镁离子结合形成整合结合形成整合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。胞或使

15、贴壁细胞从瓶壁上脱离。缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，可与呈片状，有团块，常不单独使用，可与胰蛋白胰蛋白酶混合使用酶混合使用(1 (1：1 1或或2 2：1) 1)，既利于细胞脱壁又，既利于细胞脱壁又利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。EDTAEDTA工作液的浓度为工作液的浓度为0.020.02，用用不含钙、镁不含钙、镁PBSPBS配制。配制。从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养，即将动物机体的各种组织从机体中取出，养，即将

16、动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTAEDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。和繁殖的过程。组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实验的内生长特性，是药物测试、细胞分化等实验的很好对象很好对象；原代细胞培养原代细胞培养也是建立各种细胞系

17、（也是建立各种细胞系（cell line)cell line)或或细胞株（细胞株（cell straincell strain）必须经过的阶段。）必须经过的阶段。原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复杂，即使是经过处理后的细胞，也仍具有杂，即使是经过处理后的细胞，也仍具有异质异质性（性（heterogeneous),heterogeneous),主要表现在细胞形态和大小主要表现在细胞形态和大小不一不一悬浮细胞培养悬浮细胞培养法法器官培养法器官培养法组织组织块培养块培养法法细胞培养细胞培养法法对于悬浮生长的细胞如白血病细胞、淋巴细对于悬浮生长的细胞如白血

18、病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无须消化，可采用低速离心分离细胞无须消化，可采用低速离心分离, ,直接培直接培养。养。指组织、器官原基，以至整个器官或其指组织、器官原基，以至整个器官或其一部分在体外的维持或生长，它们可以一部分在体外的维持或生长，它们可以分化与保持原来的结构与功能。分化与保持原来的结构与功能。1) 1) 动物动物处死处死：将出生：将出生2 23d3d乳鼠乳鼠， 用用脱颈方法处死。用酒精脱颈方法处死。用酒精棉球棉球 擦拭擦拭解剖部位解剖部位。2) 2) 取材取材及剪切及剪切：在无菌条件下：在无菌条件下将将 组织组织

19、取出，置于无菌培养皿中取出，置于无菌培养皿中， 剪剪去多余的组织（脂肪等去多余的组织（脂肪等），）， 用用PBSPBS液洗涤液洗涤1-21-2次；放入另一次；放入另一 培养皿培养皿中，将组织剪成中，将组织剪成1mm1mm3 3大大 小小的块。的块。3) 3) 消化消化及分散组织块及分散组织块：将上述清洗过的组织放将上述清洗过的组织放入无菌试管内，加入入无菌试管内，加入5 56 6倍量的倍量的0.250.25胰蛋白酶胰蛋白酶液（液（pH7.4 pH7.4 7.67.6），置），置3737水浴中消化水浴中消化20 20 40min40min，每隔，每隔10min10min摇动一次，直到组织块变得摇

20、动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试管，加入管，加入5ml5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。纱布过滤至另一烧杯中。 4)计数与稀释计数与稀释: :从过滤的细胞悬液中取出适量滴于从过滤的细胞悬液中取出适量滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数；计数血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含3 3 5 51051

21、05个细胞为宜。个细胞为宜。5) 5)分装与培养分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶养瓶 or or 培养皿中，盖好，做好标记，置于培养皿中，盖好，做好标记，置于37 37 CO2CO2培养箱中培养。培养箱中培养。6) 6)观察观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。代培养。取材取材的组织最好尽快培养的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡于，若不能及时培养，可将组织浸泡于培养液内放置于冰浴或培养液内放置于冰浴

22、或4 40 0C C冰箱。若组织块很大，应先将其切成冰箱。若组织块很大，应先将其切成1cm21cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过以下的小块再低温保存，但时间不能超过2424小时，因放置时间小时，因放置时间长或组织块太大都易造成细胞的死亡；长或组织块太大都易造成细胞的死亡；取材取材时严格无菌操作时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液用预先消毒好的器皿和带有少量培养液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等学试剂及有害药物如碘、汞等。3 3. . 取材时取材时要细心去除组织中的

23、血液、结缔组织、脂肪及坏要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏死组织等。死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少量培养液中少量培养液中；组织块培养组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故也被称为组织培养故也被称为组织培养(tissue culture)(tissue culture)。 (1 (1) ) 取材取材、修剪、组织剪或切成、修剪、组织剪或切成1mm1mm3 3左右的小左右的小 块。块。(2)(2)将将

24、剪切剪切好的组织小块用眼科镊送入培好的组织小块用眼科镊送入培 养养 瓶瓶内。内。25ml25ml培养瓶培养瓶( (底面积约为底面积约为17.5cm17.5cm2 2）以）以2020一一3030小块为宜。小块为宜。(3 (3) ) 放置放置24h24h待组织小块贴附后将培养瓶慢慢待组织小块贴附后将培养瓶慢慢翻转平放、静止培养翻转平放、静止培养组织块接种后组织块接种后l-3l-3天天，游出，游出细胞数很少细胞数很少, ,组织块组织块的粘贴不牢固。的粘贴不牢固。观察、移动观察、移动过程中要注意过程中要注意动作动作轻巧轻巧。尽量不要引起液体的振荡而产生对组织尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力

25、使其漂起。块的冲击力使其漂起。在原代培养的在原代培养的1-2d1-2d内要持别内要持别注意观察注意观察，是否有，是否有细菌、霉菌的污染。一旦发现，要及时清除，细菌、霉菌的污染。一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其它细胞带来污染。以防给培养箱内的其它细胞带来污染。原代培养原代培养3-5d3-5d需需换液换液一次，去除漂浮的组织块一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞和残留的血细胞，以免影响，以免影响原代细胞的原代细胞的生长。生长。 1. 细胞种类：小鼠胚细胞种类：小鼠胚胎胎成纤维细胞成纤维细胞 2. 培养的天数：培养的天数：4d； 3. 放大倍数：放大倍数：倒置显微倒置显微镜镜 ； 4. 培养

26、基种类：培养基种类：1640+10%X小牛血清小牛血清； 5. 5. 细胞细胞状态与特征简述状态与特征简述:细胞呈长梭形，贴壁生长细胞呈长梭形，贴壁生长 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。就必须进行传代（再培养）。不论是否稀释，不论是否稀释，将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养瓶即称为传代或传代培养(passage)(passage)。根据细胞生长的特点，传代方法有根据细

27、胞生长的特点，传代方法有2 2种。种。悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代离心法离心法传代：离心（传代：离心（1000rpm1000rpm）去上清，沉淀物加去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。新培养液后再混匀传代。直接直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除养液去除l l2 22 23 3，然后用吸管直接吹打形成细，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代胞悬液再传代。贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。在传代时，需要用胰蛋采用酶消化法传代。在传代时，需要用胰蛋白酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用白酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，

28、或用EDTAEDTA溶液与胰蛋白酶按溶液与胰蛋白酶按1 1：1 1或或2 2：1 1比例混合比例混合后联合使用。常用的消化液有后联合使用。常用的消化液有0.250.25的胰蛋白的胰蛋白酶液。酶液。 Optimal confluency for moving cells to a new dish is 70-80%too low, cells will be in lag phase and wont proliferateToo high and cells may undergo unfavorable changes and will be difficult to remove fro

29、m plate操作全过程注意无菌操作操作全过程注意无菌操作胰酶消化时间要适度胰酶消化时间要适度吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡游离期游离期贴壁贴壁期期潜伏期潜伏期对数生长期对数生长期停止停止期（平台期）期（平台期）细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期期细胞质回缩，胞质呈圆球形细胞质回缩，胞质呈圆球形1010分钟分钟-4 -4小时小时细胞附着于底物上，游离期结束。细胞附着于底物上，游离期结束。底物：胶原、玻璃、塑料等底物：胶原、玻璃、塑料等细胞株平均在细胞株平均在1010分钟分钟-4 -4小时贴壁小时贴壁血清血清中

30、有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白。胶原等糖蛋白。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）基团）潜伏期潜伏期：细胞有生长活动，而无细胞分裂，细：细胞有生长活动，而无细胞分裂，细胞株潜伏期一般为胞株潜伏期一般为6-246-24小时。小时。对数生长期对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。力最佳，最适合进行实验研究。停止停止期期：细胞长满瓶壁，虽有活力但不再分裂，：细胞长满瓶壁，虽有活力但不再分裂，机制为接触抑制、密度依赖性。机制为接触抑制

31、、密度依赖性。组织和细胞供体年龄组织和细胞供体年龄培养条件培养条件细胞的粘附细胞的粘附培养技术方法培养技术方法促生长因子促生长因子幼年个体比老年者易于培养，所有动物的胚胎幼年个体比老年者易于培养，所有动物的胚胎组织都是最好的培养对象。组织都是最好的培养对象。来自来自同一个体的组织，分化低的比分化高的容同一个体的组织，分化低的比分化高的容易培养。易培养。不同的细胞对不同的细胞对培养基培养基需求不同，当前尚无一种培需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。应了解所养基是万能的，应选择相应的培养基。应了解所培养细胞的生物学性状和特殊需求成分。培养细胞的生物学性状和特殊需求成分。细胞在

32、体外进行培养，失去了机体的调节和控制。细胞在体外进行培养，失去了机体的调节和控制。因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、气体环境、温度、渗透压、气体环境、PHPH值值等均能影响细胞等均能影响细胞的生长的生长。细胞类型细胞类型 ( (附着最强附着最强) )巨噬细胞一成纤维细胞巨噬细胞一成纤维细胞上皮上皮细胞细胞血细胞血细胞( (最弱最弱) ) 生物因素生物因素 血清、培养液中的促附着因子血清、培养液中的促附着因子 机械，物理等其他因素机械，物理等其他因素

33、离心：促进附着离心：促进附着流动：培养液流动可阻止细胞附着流动：培养液流动可阻止细胞附着低温：可抑制附着低温：可抑制附着现已证明，很多激素如胰岛素、氢化可的松等具有促现已证明，很多激素如胰岛素、氢化可的松等具有促进细胞生长作用。胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨进细胞生长作用。胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，用量为基酸，用量为1 110U/ml10U/ml。氢化可的松可促进表皮细胞。氢化可的松可促进表皮细胞和乳腺上皮细胞生长，并能提高胶质细胞和成纤维细和乳腺上皮细胞生长，并能提高胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率，用量为胞的克隆形成率，用量为1010-8 -8 1010-7 -7mol/Lmol

34、/L。人表皮生长因子（人表皮生长因子（hEGFhEGF) )对大鼠宫颈鳞状上皮细胞对大鼠宫颈鳞状上皮细胞(RCEC)(RCEC)有促进增殖的作用。有促进增殖的作用。表皮生长因子表皮生长因子(EGF(EGF) )、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF(FGF) )等生等生长调节因子都能促进细胞的生长和增殖。长调节因子都能促进细胞的生长和增殖。培养细胞生长状况常规检查培养细胞生长状况常规检查培养液：颜色与透明度的变化培养液：颜色与透明度的变化细胞细胞生长状况。生长状况。细胞细胞形态变化。形态变化。微生物微生物污染污染变黄，表示变黄，表示PHPH值下降，细胞生长旺盛，代谢值下降，细胞生长旺

35、盛，代谢产生的酸性物不断积累导致。产生的酸性物不断积累导致。变红或紫红色，表示变红或紫红色，表示PHPH值上升，细胞生长停值上升，细胞生长停滞、死亡。滞、死亡。一般生长稳定的细胞需要一般生长稳定的细胞需要2-32-3天换液天换液1 1次，生长次，生长慢的细胞需要慢的细胞需要3-43-4天换液一次。天换液一次。原代细胞原代细胞经经2424小时培养，培养液颜色变浅，表示小时培养，培养液颜色变浅，表示细胞代谢好。少量换液可刺激细胞生长。细胞代谢好。少量换液可刺激细胞生长。通常每周两次，每次换半量或通常每周两次，每次换半量或1/5-1/31/5-1/3量。原代细量。原代细胞第胞第1 1次换液时，切记不

36、要把培养液全部倒掉次换液时，切记不要把培养液全部倒掉。细胞株（系）细胞株（系）：条件合适时生长迅速，过夜就变条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进行全量换液。这种情况下，最好减少细黄，可进行全量换液。这种情况下，最好减少细胞接种数，延长换液的时间。胞接种数，延长换液的时间。常规应特别注意细胞的生长增殖情况。常规应特别注意细胞的生长增殖情况。原代细胞：经历一个适应或潜伏期。原代细胞：经历一个适应或潜伏期。细胞系：多为细胞系：多为2424小时以内。小时以内。细胞细胞长满瓶底长满瓶底80%80%时应及时传代。时应及时传代。生长良好细胞：透明度大，折光性强，轮廓不生长良好细胞：透明度大，折光性强，轮廓不

37、清。清。生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞之间空隙加大。之间空隙加大。培养液颜色与透明度：培养液颜色与透明度：培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。支原体污染，没有明显症状，但细胞生长却明支原体污染，没有明显症状，但细胞生长却明显变缓。显变缓。不仅仅指微生物，包括所有混入培养环境中对细不仅仅指微生物，包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物，因此胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物，因此一般包括一般包括微生物微生物

38、( (真菌、细菌、病毒和支原体真菌、细菌、病毒和支原体) )、化学物质化学物质( (影响细胞生存、非细胞所需的化学成份影响细胞生存、非细胞所需的化学成份) )及及细胞细胞( (非同一种的其它细胞非同一种的其它细胞) )。其中以微生物污。其中以微生物污染最多见。另外随着细胞种类增多不同种细胞染最多见。另外随着细胞种类增多不同种细胞交叉污染也时有发生、从而造成细胞不纯。交叉污染也时有发生、从而造成细胞不纯。空气空气：空气是微生物传播的最主要途径。：空气是微生物传播的最主要途径。 净化净化工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可使净工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可使净化工作不能正常化工作不能正常进行进行

39、工作工作时不戴口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽等时不戴口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽等使外界气流过使外界气流过强强减少减少空气流动是防止污染的重要环节。空气流动是防止污染的重要环节。器材器材：各种培养器皿及器械清洗消毒不：各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底彻底 洗刷洗刷不干净，污物残留及培养用液等灭菌不不干净，污物残留及培养用液等灭菌不彻底彻底CO2CO2温箱由于温箱内湿度大，温度适宜，取存温箱由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，而而CO2CO2温箱内是开放式培养如不定期消毒温箱内是开放式培养如不定期消毒, ,可形

40、可形成污染成污染. .操作操作无菌无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具或观念不强、动作不准确、使用污染的器具或封瓶时不封瓶时不严严培养培养两种以上细胞时，操作不规范、交叉使用吸两种以上细胞时，操作不规范、交叉使用吸管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。血清血清：有些血清在生产时就已被支原体或病毒：有些血清在生产时就已被支原体或病毒等污染，即可成为污染的来源。等污染，即可成为污染的来源。组织样本组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样：原代培养的污染多数来源于组织样本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘

41、可以影响细胞生长。组织中的碘可以影响细胞生长。支支原体和病毒原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的、缓慢的和潜在的的霉菌霉菌和细菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内压制细胞繁殖迅速，能在很短时间内压制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。生长或产生有毒物质杀灭细胞。化学物质污染化学物质污染如重金属或其它化学试剂混入培养如重金属或其它化学试剂混入培养液中后，有的毒性较小、如能及时排出，细胞仍液中后，有的毒性较小、如能及时排出，细胞仍可存活但有些烃化物如多环芳烃等有致突变性，可存活但有些烃化物如多环芳烃等有致突变性，能导致细胞发生转化能导致细胞发生转化细菌污

42、染是实验室细胞培养中常见的污染，即使细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如革兰氏阳性菌，如枯草杆菌、白色葡萄球菌，枯草杆菌、白色葡萄球菌， 以及以及大肠杆菌、假单大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。胞菌等革兰氏阴性菌。 培养细胞受细菌污染后，培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，会出现培养液变混浊，pHpH改变。污染后细胞发生改变。污染后细胞发生病理改病理改 变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。死

43、亡。肉眼直接观察法肉眼直接观察法培养检查法培养检查法显微镜观察法显微镜观察法PCRPCR检测检测真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有真菌有烟曲霉、烟曲霉、 黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。菌和酵母菌。培养细胞受培养细胞受真菌真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，肉眼可见；有的散在生长，倒置显微浅黄色的小点，肉眼可见；有的散在生长，倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有

44、的呈链状排列，培养液一般不发之间或培养基中，有的呈链状排列，培养液一般不发生浑浊。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营生浑浊。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径微生物，最小直径0.2um0.2um，一般，一般过滤除菌过滤除菌无法去无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在

45、于细胞之间。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。不及时处理，还会产生交叉污染。相差显微镜观察法相差显微镜观察法HayflickHayflick 培养基直接培养法培养基直接培养法DNADNA荧光染色法（荧光染色法（Hoechst 33258Hoechst 33258）PCRPCR方法（即用型细胞培养中支原体检测方法（即用

46、型细胞培养中支原体检测PCRPCR试剂盒）试剂盒）细胞的直接观察细胞的直接观察动物接种检查动物接种检查电子显微镜观察电子显微镜观察PCRPCR技术技术防止污染，防止污染，预防预防是关键，预防措施应贯穿于整个细胞培养的是关键，预防措施应贯穿于整个细胞培养的始终。始终。器皿器皿准备准备开始操作开始操作前前操作过程操作过程中中其他细节方面的预防其他细节方面的预防在在培养液中加入适量的培养液中加入适量的抗菌素抗菌素。常规加入青霉素和链霉素各。常规加入青霉素和链霉素各100U/ml100U/ml。必要时加入庆大霉素、卡那霉素或两性霉素。必要时加入庆大霉素、卡那霉素或两性霉素B B等。等。培养箱内应经常清

47、洁消毒，放置含硫酸铜的消毒水。培养箱内应经常清洁消毒，放置含硫酸铜的消毒水。购入的未灭活血清应采取购入的未灭活血清应采取5656水浴灭活水浴灭活30min30min的措施以使血清的措施以使血清中的补体和支原体中的补体和支原体灭活灭活。小牛小牛血清血清是造成支原体初级污染的主要是造成支原体初级污染的主要来源来源次级次级污染源，即已污染支原体的细胞在污染的传播中更为污染源，即已污染支原体的细胞在污染的传播中更为重要重要保证保证培养细胞的培养细胞的来源来源绝对干净，同时应做好检测，一旦发现支绝对干净，同时应做好检测，一旦发现支原体污染就应废弃原体污染就应废弃严禁已知污染了支原体的细胞进入未污染的工作

48、区域。严禁已知污染了支原体的细胞进入未污染的工作区域。严格严格无菌操作无菌操作，杜绝人为污染。，杜绝人为污染。对每批小牛血清严格检查，对每批小牛血清严格检查，灭活、过滤灭活、过滤有利于抑制支原体的污有利于抑制支原体的污染。染。培养的细胞一旦污染应及时处理，防止污染其培养的细胞一旦污染应及时处理，防止污染其他细胞他细胞。高压灭菌高压灭菌被污染的细胞，然后弃掉被污染的细胞，然后弃掉。有价值有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常正常常用常用的排除微生物污染的方法有以下的排除微生物污染的方法有以

49、下4 4种种 抗生素是细胞培养中杀灭抗生素是细胞培养中杀灭细菌细菌的主要手段的主要手段。联合联合应用应用比单用效果好，预防性应用比污染后应比单用效果好，预防性应用比污染后应用用好好有有的抗生素对细菌仅有抑制作用，无杀灭效应。的抗生素对细菌仅有抑制作用，无杀灭效应。反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，而且反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，而且对细胞本身也有一定对细胞本身也有一定影响影响尽量尽量不用抗生素不用抗生素处理处理一些一些有价值的细胞被污染后，仍需要用抗生素挽有价值的细胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在这种情况下，可采用救，在这种情况下，可采用5 51010倍于常用量的倍于常用量的冲

50、击法，加入高浓度抗生素后作用冲击法，加入高浓度抗生素后作用24244848小时，小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效再换入常规的培养液，有时可以奏效根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支原根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支原体污染的细胞置于体污染的细胞置于4141度作用度作用5 51010小时小时（最长（最长可以达可以达1818小时）杀灭支小时）杀灭支原体原体但是但是4141度对细胞本身应有较大影响，故在处理度对细胞本身应有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定最大限度杀伤支原前，应先进行预试验，确定最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。体而对细胞影响较小的处理时间。 受微生

51、物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，从体内取出再进行培养繁殖。从体内取出再进行培养繁殖。在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活7 71010天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的克隆生长胞的克隆生长。巨噬细胞巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化将其消化。利用利用9696孔板将极少培

52、养细胞与巨噬细胞共培养，孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度地同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染程度地同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染的效能污染的效能。与与抗生素联合应用效果更佳。抗生素联合应用效果更佳。 细胞计数法细胞计数法胎盘兰染色法胎盘兰染色法MTTMTT比色法比色法细胞生长曲线法细胞生长曲线法 3 3H-H-TdRTdR( (3 3H-H-胸腺嘧啶核苷）掺入法胸腺嘧啶核苷）掺入法BrdUBrdU (5-bromo-2 (5-bromo-2deoxyuridinedeoxyuridine，5- 5-

53、溴脱氧溴脱氧尿嘧啶核苷尿嘧啶核苷 ）掺入法）掺入法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度。的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度。细胞计数结果以细胞数细胞计数结果以细胞数/ /毫升表示毫升表示将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并，并将盖片盖将盖片盖在计数板上。在计数板上。将将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使，使悬液充满悬液充满盖片和计数板之间。盖片和计数板之间。静静置置3 3分钟。分钟。镜下观察，计算计数板四大格细胞总数镜下观察，计算计数板

54、四大格细胞总数，压线，压线细胞只细胞只计左侧和上方的计左侧和上方的按下按下式计算：式计算：（细胞悬液的细胞数）（细胞悬液的细胞数）/ml/ml （四（四个大格子细胞数个大格子细胞数/4)/4)稀稀释倍数释倍数10104 4 /ml /ml公式中除以公式中除以4 4因为计数了因为计数了4 4个大格的细胞数个大格的细胞数。公式公式中乘以中乘以10104 4因为计数板中每一个大格的体积为：因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm1.0mm（长）（长）1.0mm1.0mm（宽）（宽）0.1mm0.1mm（高）（高）0.10.1mmmm3 3 而而 1ml1ml10001000mmmm3 3 。要求

55、悬液中细胞数目不低于要求悬液中细胞数目不低于10104 4个个/ml/ml，如果细，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。要求要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。数准确性。取样取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更应该每次取样都要混匀，以求次取样计数时更应该每次取样都要混匀，以求计数准确。计数准确。数数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算成团时只按照一个细胞计算。如果如果细胞压在

56、格线上时，则只计上线，不计下细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。线，只计左线，不计右线。 操作操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。液流入旁边槽中，否则要重新计数。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，活细胞所占总细胞中的百分比叫做活细胞所占总细胞中的百分比叫做细胞活力细胞活力。由由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏复苏后的细胞也要检查活力，了

57、解冻存和复苏的后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。效果。细胞死亡细胞死亡后，细胞膜通透性改变，台盼蓝大量进后，细胞膜通透性改变，台盼蓝大量进入细胞内而不被排出呈蓝色。活细胞选择性强，入细胞内而不被排出呈蓝色。活细胞选择性强，不易着色不易着色0.5ml0.5ml台盼蓝台盼蓝0.3ml0.3ml培养液培养液0.2ml0.2ml细胞悬液细胞悬液 染色染色5 515min15min 至少计数至少计数500500个细胞中着色细胞数个细胞中着色细胞数 细胞活力细胞活力= =（总细胞数着色细胞（总细胞数着色细胞)/ )/总细胞数总细胞数100100 原理原理：活细胞线粒体中：活细胞线粒体中琥珀酸脱氢

58、酶琥珀酸脱氢酶能将能将MTTMTT黄色溶黄色溶液还原成不溶于水的蓝紫色产物颗粒（液还原成不溶于水的蓝紫色产物颗粒（formazanformazan) )，并，并沉积在细胞中。二甲基亚砜（沉积在细胞中。二甲基亚砜（DMSODMSO）或酸性异丙醇）或酸性异丙醇能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅（以（以ODOD值表示）与所含的值表示）与所含的formazanformazan量成正比。可反映量成正比。可反映活细胞的代谢水平。而死细胞没有这种活细胞的代谢水平。而死细胞没有这种功能功能MTTMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞法简单快速、准

59、确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等加入培养液量加入培养液量10的的MTT(5g/L)，继续，继续34h培养培养吸去培养液，加入等量异丙醇或吸去培养液，加入等量异丙醇或DMSO，振荡，振荡10min 490/630nm 测定测定OD值值细胞存活率实验组细胞存活率实验组OD值值/对照组对照组OD值值100观察同一代细胞的增殖过程，根据细胞生长曲观察同一代细胞的增殖过程，根据细胞生长曲线分析细胞的增殖速度，确定具体实验、细胞线分析细胞的增殖速度，确定具体实验、细胞传代、细胞冻存的最佳时间传代、细胞冻存的最佳时间计数细胞浓度，等量加入培养板各孔，培

60、养计数细胞浓度，等量加入培养板各孔，培养7 7天天 以以接种时间始，接种时间始， 每隔每隔24h24h计数计数3 3孔细胞数目，取孔细胞数目，取均值均值 以横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度以横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度（10104 4 /ml) /ml)注：注：1 1、各孔消化时间应一致。、各孔消化时间应一致。 2 2、计数细胞前应混匀。、计数细胞前应混匀。 3 3H-H-TdRTdR掺入法掺入法是将用是将用 3 3HH标记的胸腺嘧啶脱氧核标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到新合成的苷掺入到新合成的DNADNA中，通过测定中，通过测定 3 3HH放射性放射性脉冲数比较不同细胞的增殖活性。脉冲数