高通量药物筛选研究进展

1、高通量药物筛选研究进展2高通量药物筛选高通量药物筛选高通量药物筛选现状高通量药物筛选现状高通量药物筛选存在的问题高通量药物筛选存在的问题新技术新方法新技术新方法药物靶点研究药物靶点研究从基因到药物从基因到药物展望展望3药药 物物 发发 现现 起始阶段，寻找探索起始阶段，寻找探索临床前研究临床前研究 制剂、药效、毒理制剂、药效、毒理 程序化研究程序化研究临临 床床 研研 究究 临床资料临床资料临临 床床 应应 用用 应用资料积累应用资料积累4药物发现是药物研究的起始药物发现是药物研究的起始药物筛选是药物筛选是 实现药物发现的重要手段实现药物发现的重要手段高通量药物筛选是高通量药物筛选是 药物发现

2、的早期阶段药物发现的早期阶段符合药物发现的规律符合药物发现的规律是药物发现重要途径是药物发现重要途径5类型 创新特点 发现途径 创新产品创新产品 新型制剂新型制剂 剂型研究剂型研究复方配伍复方配伍 理论研究理论研究 新适应症新适应症 药物筛选药物筛选部分部分创新药物创新药物 优化结构提高疗效优化结构提高疗效 定向筛选定向筛选机理相同结构不同机理相同结构不同 定向研究定向研究同样机制用途不同同样机制用途不同 药物筛选药物筛选创新药物创新药物 新靶点，新化合物新靶点，新化合物 新靶点，已知化合物新靶点，已知化合物 随机筛选随机筛选已知靶点，新化合物已知靶点，新化合物 6方式方式途径途径举例举例偶然

3、发现偶然发现 生产、生活生产、生活奎宁、强心甙、奎宁、强心甙、医疗实践医疗实践丙戊酸钠、醋氨丙戊酸钠、醋氨酚、酚、研究过程研究过程青霉素、青霉素、主动寻找主动寻找 （药物筛选）（药物筛选）理论指导理论指导扎那米韦、中药扎那米韦、中药 定向研究定向研究半合成抗生素半合成抗生素药物筛选药物筛选全新药物全新药物 7方式方式特点特点优缺点优缺点偶然发现偶然发现 有效有效不可控过程不可控过程直接直接无规律可循无规律可循机遇机遇偶然事件偶然事件主动寻找主动寻找 （药物筛选）（药物筛选）发挥人类优势发挥人类优势随机事件，规模效应随机事件，规模效应借助有利条件借助有利条件过程可控、条件可控过程可控、条件可控选

4、择特定目标选择特定目标绩效绩效/ /工作工作 比低比低89 采用适当的方法，对可能作为药物使用的采用适当的方法，对可能作为药物使用的 物质（样品）进行生物活性、药理作用及物质（样品）进行生物活性、药理作用及 药用价值的评价过程。药用价值的评价过程。10 高通量药物筛选就是应用分子细胞水平的药高通量药物筛选就是应用分子细胞水平的药物活性评价方法（模型），通过自动化手段，物活性评价方法（模型），通过自动化手段，对大量样品进行生物活性或药理作用的检测，对大量样品进行生物活性或药理作用的检测，发现新药的过程。高通量药物筛选的规模至发现新药的过程。高通量药物筛选的规模至少为每日筛选数千个样品。少为每日筛

5、选数千个样品。 11传统药理学研究传统药理学研究反向药理学研究反向药理学研究动物模型动物模型药物作用分子靶点药物作用分子靶点药效学筛选药效学筛选活性化合物活性化合物活性化合物活性化合物作用机理研究作用机理研究分子细胞水平研究分子细胞水平研究药效学研究药效学研究 作用机理研究作用机理研究疾病相关动物模型研究疾病相关动物模型研究药药 物物 开开 发发 研研 究究12筛选方法筛选方法( (药物筛选模型药物筛选模型) )基本要求基本要求: : 微量化；高灵敏度；高特异性；操作简便，能反应药物作用微量化；高灵敏度；高特异性；操作简便，能反应药物作用基本类型：基本类型：分子水平筛选模型：靶点明确，药物作用

6、机理明确，特异性检分子水平筛选模型：靶点明确，药物作用机理明确，特异性检测测细胞水平筛选模型：机理明确，检测指标特异性高，模型稳定细胞水平筛选模型：机理明确，检测指标特异性高，模型稳定13药物靶点的定义药物靶点的定义 所谓药物靶点，简单的定义就是指那些能够与特定药物特异所谓药物靶点，简单的定义就是指那些能够与特定药物特异性结合并产生特定作用（主要是指调节生理功能，改变病理性结合并产生特定作用（主要是指调节生理功能，改变病理过程，缓解疾病症状，治疗疾病等作用）的生物大分子或特过程，缓解疾病症状，治疗疾病等作用）的生物大分子或特定的生物分子结构。定的生物分子结构。 在上述定义中有两个重要的前提条件

7、，即药物和药物作用。在上述定义中有两个重要的前提条件，即药物和药物作用。没有药物存在或没有认识药物作用之前，利用上述定义判断没有药物存在或没有认识药物作用之前，利用上述定义判断药物靶点就不适用了。因此，发现新的药物靶点需要在理论药物靶点就不适用了。因此，发现新的药物靶点需要在理论上和实验方面给予全面的研究和认识。这也是当前许多研究上和实验方面给予全面的研究和认识。这也是当前许多研究人员面对人类基因组研究的成就盲目乐观的主要原因。人员面对人类基因组研究的成就盲目乐观的主要原因。14药药物物药物药物 靶点靶点生理生理调节调节解除解除疾病疾病药物靶点数据库： :/ drugtarget /15药物靶

8、点药物靶点根据目前已经认识的约根据目前已经认识的约500种药物靶点进行分析，药物靶点种药物靶点进行分析，药物靶点必须具备的生物学特征主要表现在以下方面：必须具备的生物学特征主要表现在以下方面：a、属于生物学大分子（通常为蛋白质），可以单独存在或、属于生物学大分子（通常为蛋白质），可以单独存在或形成聚合体存在；形成聚合体存在；b、具有可以与其他物质（主要是外源性或内源性小分子、具有可以与其他物质（主要是外源性或内源性小分子物质）相结合的部位或位点；物质）相结合的部位或位点；c、该物质的结构可以发生变化，而且是在与小分子结合后、该物质的结构可以发生变化，而且是在与小分子结合后发生变化，正常情况下，

9、这种变化通常是可逆的；发生变化，正常情况下，这种变化通常是可逆的；16药物靶点药物靶点d、该大分子可以通过结构的变化，在生理条件下发挥生、该大分子可以通过结构的变化，在生理条件下发挥生理调节功能，引起机体某些功能或表现的变化；理调节功能，引起机体某些功能或表现的变化；e、该物质结构状态变化产生的生理效应在复杂调节过程或、该物质结构状态变化产生的生理效应在复杂调节过程或作用通路中具有主导作用；作用通路中具有主导作用； f、病理条件下该物质的表达、活性、结构或特性可以发生、病理条件下该物质的表达、活性、结构或特性可以发生变化，这种变化可以是原发性，也可以是继发性的。变化，这种变化可以是原发性，也可

10、以是继发性的。g、在体内可能存在内源性与之结合的小分子（内源性配基）、在体内可能存在内源性与之结合的小分子（内源性配基）或外源性配基，其配基的作用已经被认识。或外源性配基，其配基的作用已经被认识。17药物靶点的分类药物靶点的分类药物靶点：能够与特定药物特异性结合并产生治疗疾药物靶点：能够与特定药物特异性结合并产生治疗疾病作用或调节生理功能作用的生物大分子或生物分病作用或调节生理功能作用的生物大分子或生物分子结构。子结构。候选药物靶点：符合药物靶点的基本特点，但还没有候选药物靶点：符合药物靶点的基本特点，但还没有发现特异的药物的生物大分子或生物分子结构。发现特异的药物的生物大分子或生物分子结构。

11、 潜在药物靶点：部分符合候选靶点的条件。潜在药物靶点：部分符合候选靶点的条件。18以上条件基本上摆脱药物和作用的限制，可以通过对生理条件下的物以上条件基本上摆脱药物和作用的限制，可以通过对生理条件下的物质信息进行分析，然后判断是否可以确定为药物靶点。但是仍然不质信息进行分析，然后判断是否可以确定为药物靶点。但是仍然不能保证符合条件的位点就一定是药物靶点，仍然需要对其进行多方能保证符合条件的位点就一定是药物靶点，仍然需要对其进行多方面的研究。对于全部或部分满足以上要求的蛋白质或其他生物大分面的研究。对于全部或部分满足以上要求的蛋白质或其他生物大分子，可以作为候选药物靶点进行研究，特别是需要进行生

12、物学的实子，可以作为候选药物靶点进行研究，特别是需要进行生物学的实验研究。验研究。以上药物靶点的基本条件实际上并不能反映药物靶点的生物学特征，以上药物靶点的基本条件实际上并不能反映药物靶点的生物学特征，通过生物信息学技术和方法，对已知靶点的规律性分析，发现更多通过生物信息学技术和方法，对已知靶点的规律性分析，发现更多新的靶点生物学特征，如结构特征，氨基酸序列特征等，将会有利新的靶点生物学特征，如结构特征，氨基酸序列特征等，将会有利于促进药物靶点的发现。于促进药物靶点的发现。19药物靶点的发现：药物靶点的发现： 基因组学研究基因组学研究 蛋白质组学研究：蛋白质组学研究： 生物信息学研究：生物信息

13、学研究： 药物研究：药物研究：（传统方法）（传统方法）20样品类型：样品类型： 单一化合物（合成化合物，天然化合物）单一化合物（合成化合物，天然化合物） 混合物混合物 （天然提取物，合成化合物）（天然提取物，合成化合物）样品来源：样品来源： 化学合成、组合化学合成化学合成、组合化学合成 天然产物提取物、组合生物合成、代谢产物天然产物提取物、组合生物合成、代谢产物样品保存：样品保存： 样品库（）样品库（） 温度、湿度、光线温度、湿度、光线 样品管理：样品管理： 数据库管理数据库管理 化合物数据库，提取物数据库化合物数据库，提取物数据库21SupplierUnit医科院药物所Supplier徐世平

14、SerialNumber6300AddressTutorPhoneNum.DeliverDateStructureONNNNSSONNOOOSourceSample_No.Beijing_No.XSP3-5AmountSolventStereoInformationStabilityRecrystalSolventFurtherSupplyC1 6H2 0N6O5S2SampleIndicatorAppearancePuritySampleNum.Mp化化 合合 物物 数数 据据 库库中中国国医医学学科科学学院院 药药物物研研究究所所 国国家家药药物物筛筛选选中中心心440.5030Activ

15、ity_IndicatorObjectMolName22自动化操作系统自动化操作系统（实验室自动化工作站）（实验室自动化工作站）自动操作（加样、稀释、混合、温孵、转移等）自动操作（加样、稀释、混合、温孵、转移等）自动检测（时间、顺序、条件等）自动检测（时间、顺序、条件等）数据获得（原始数据、简单处理数据）数据获得（原始数据、简单处理数据）结果储存（计算机保存）结果储存（计算机保存）23l自动化工作站自动化工作站2425检测仪器：检测仪器：分光光度计分光光度计荧光检测仪荧光检测仪放射活性计数仪放射活性计数仪其他其他26l液闪发光计数仪液闪发光计数仪27lFluoStar 比色仪比色仪28数据分析

16、：数据分析： 数据处理，单位换算，活性结果数据处理，单位换算，活性结果专业分析：专业分析： 活性强度比较活性强度比较29123456789101112ACEG-10,0-8,0-6,0-4,0-2,00,02,04,06,08,010,03096384864 1536310 020204040606080801001001201201 15 510102020505010010020020050050010001000Volume (uL)Volume (uL)实验成本实验成本32模型优化模型优化Assay Optimization建立模型建立模型Assay Development活性筛选活性

17、筛选Screening分析技术分析技术Assay Technologies分析方法微量化分析方法微量化Assay Miniaturization筛选结果筛选结果Profiling活性化合物活性化合物Quality Leads样品准备样品准备Compound Archive3334规模扩大：规模扩大：制药企业为提高工作效率已经投入巨额资金，这种投入成为发展的制药企业为提高工作效率已经投入巨额资金，这种投入成为发展的巨大压力，这种压力意味着药物能够竞争的自由时间很少。巨大压力，这种压力意味着药物能够竞争的自由时间很少。通过增通过增加筛选靶点的数量以及对每个筛选靶点进行筛选的化合物数量，成加筛选靶点

18、的数量以及对每个筛选靶点进行筛选的化合物数量，成为为HTS部门已经响应这种竞争趋势的措施；在不同的制药企业已经部门已经响应这种竞争趋势的措施；在不同的制药企业已经制定了面对这些挑战的各种策略。制定了面对这些挑战的各种策略。重要环节：重要环节：提高提高HTS工作效率仍具有巨大潜力，除设备生产、检测方法建立需工作效率仍具有巨大潜力，除设备生产、检测方法建立需要不断创新外，将筛选活性化合物的过程与先导化合物的确证等阶要不断创新外，将筛选活性化合物的过程与先导化合物的确证等阶段（段（hit-to-lead steps）密切结合，形成完整的整体，将更有利于相）密切结合，形成完整的整体，将更有利于相互之间

19、的合作以及全面提高工作效率。互之间的合作以及全面提高工作效率。 35Size exclusion chromatography： 通过象共聚焦技通过象共聚焦技术和寿命测定等，适用于快速筛选并产生巨大效益的术和寿命测定等，适用于快速筛选并产生巨大效益的新的检测技术的高密度板，并新的检测技术的高密度板，并已经实现了微量筛选技已经实现了微量筛选技术。基于亲和力的快速筛选技术。这种技术可将靶点术。基于亲和力的快速筛选技术。这种技术可将靶点蛋白与化合物的混合物共同孵育后，利用大小排除法蛋白与化合物的混合物共同孵育后，利用大小排除法色谱技术（色谱技术（size exclusion chromatograp

20、hy）分离）分离化合物，最后通过质谱技术进一步分析化合物的特性。化合物，最后通过质谱技术进一步分析化合物的特性。36Small focused subsets：根据分子间相互作用力的筛根据分子间相互作用力的筛选方法广泛应用，采取的策略也非常灵活，相对集中选方法广泛应用，采取的策略也非常灵活，相对集中筛选（筛选（small focused subsets），由于具体操作过程），由于具体操作过程易于控制，而且常采用易于控制，而且常采用384孔板作为筛选载体，效果孔板作为筛选载体，效果更明显。因为激酶靶点的检测试剂的来源问题，适用更明显。因为激酶靶点的检测试剂的来源问题，适用于激酶检测的芯片实验室的

21、芯片技术（于激酶检测的芯片实验室的芯片技术（Caliper lab-on-a-chip），以更小的反应体积实现活性筛选，提），以更小的反应体积实现活性筛选，提高筛选速度。高筛选速度。37滤过和学习的循环：滤过和学习的循环：Aventis的的滤过和学习的循环滤过和学习的循环策略，能够提高活性化合物的发现率，这种过程包括策略，能够提高活性化合物的发现率，这种过程包括了来自经过确定的活性结构的新数据库，以此为研究了来自经过确定的活性结构的新数据库，以此为研究的向导，通过与数据库进行联合应用，经过反复验证的向导，通过与数据库进行联合应用，经过反复验证和信息反馈，提高化合物中的活性化合物发现率。不和信息

22、反馈，提高化合物中的活性化合物发现率。不过，这种方法并不是对全部的靶点来说都是成功的。过，这种方法并不是对全部的靶点来说都是成功的。38IQ检测：近年来研制成功的一种适用于激酶、磷酯酶以检测：近年来研制成功的一种适用于激酶、磷酯酶以及蛋白酶分析的及蛋白酶分析的IQ检测平台。这种技术利用溶液中的检测平台。这种技术利用溶液中的铁离子化合物与磷酸化的多肽结合时所消失的荧光信铁离子化合物与磷酸化的多肽结合时所消失的荧光信号变化，确定药物作用。这种技术也适用于蛋白酶的号变化，确定药物作用。这种技术也适用于蛋白酶的检测并成功地用于检测并成功地用于1536孔板。由于这是一种不使用孔板。由于这是一种不使用抗体

23、的检测技术，适用于具有广泛范围的荧光颜料、抗体的检测技术，适用于具有广泛范围的荧光颜料、用用DMSO溶解的多肽类底物的检测。溶解的多肽类底物的检测。39另一种称为另一种称为光速光速(Lightspeed)的检测模式也可的检测模式也可以适用于激酶、蛋白酶以及以适用于激酶、蛋白酶以及DNA检测。的这种技术可检测。的这种技术可以利用超淬火聚合体监测它们之间的结合信息。这种以利用超淬火聚合体监测它们之间的结合信息。这种模式具有不使用抗体、操作步骤少，只需使用自动化模式具有不使用抗体、操作步骤少，只需使用自动化操作系统等快速、简便等优点。操作系统等快速、简便等优点。 40数据采集：筛选能力的不断提高，筛

24、选方法的多样化，从数据采集：筛选能力的不断提高，筛选方法的多样化，从HTS过程过程采集的数据也在不断地增加，提高数据质量成为重要研究内容。采集的数据也在不断地增加，提高数据质量成为重要研究内容。提高数据质量可以通过提高数据获取技术，如共聚焦技术和高信提高数据质量可以通过提高数据获取技术，如共聚焦技术和高信息读数器等技术；也可以通过降低筛选过程的错误，提高筛选效息读数器等技术；也可以通过降低筛选过程的错误，提高筛选效率，如率，如Genedata的筛选策略（的筛选策略（ :/ genedata ）就特）就特别注意整个筛选过程中每一个检测板上的错误情况。别注意整个筛选过程中每一个检测板上的错误情况。

25、 采用剂量采用剂量-反应模块，可自动阻挡无效数据以及重新绘制已经反应模块，可自动阻挡无效数据以及重新绘制已经画出的拟合曲线。画出的拟合曲线。数据处理：对数据处理：对IC50的分析，大多数数据处理工具存在数据利用率的分析，大多数数据处理工具存在数据利用率的缺陷，而且需要人工操作，消耗大量的时间。的缺陷，而且需要人工操作，消耗大量的时间。Genedata 软软件具有绘制趋势能力，能够处理多种数据，获得多种模式数据中件具有绘制趋势能力，能够处理多种数据，获得多种模式数据中的各种最重要信息的功能。通过运算可以列出的各种最重要信息的功能。通过运算可以列出候补候补活性化合活性化合物目录，并能够完成假阳性结

26、果的删除和假阴性结果的确认。物目录，并能够完成假阳性结果的删除和假阴性结果的确认。41在高通量筛选的发展过程中，为了减少高通量筛选成本在高通量筛选的发展过程中，为了减少高通量筛选成本提高筛选速度，采用了缩小筛选样品反应体积的措施，提高筛选速度，采用了缩小筛选样品反应体积的措施，由原来主要在由原来主要在96孔板上筛选实现了孔板上筛选实现了384孔板或孔板或1536孔孔板的高密度微孔板筛选。但由于反应体积不可能无限板的高密度微孔板筛选。但由于反应体积不可能无限缩小，因此增加每样品单次筛选信息量，发现更多的缩小，因此增加每样品单次筛选信息量，发现更多的信息内容，成为新的发展方向，因此逐渐形成了高内信

27、息内容，成为新的发展方向，因此逐渐形成了高内涵高通量筛选概念。涵高通量筛选概念。在一种筛选模型上同时采集具有不同意义的药物作用信在一种筛选模型上同时采集具有不同意义的药物作用信号，这种筛选模型称为高内涵（号，这种筛选模型称为高内涵（high contents）药物）药物筛选：能够采集多种信号的高通量药物筛选，则称为筛选：能够采集多种信号的高通量药物筛选，则称为高通量高内涵药物筛选。高通量高内涵药物筛选。新概念是为了工作的方便。新概念是为了工作的方便。42多细胞因子生成调节药物的筛选多细胞因子生成调节药物的筛选炎症发生过程中有多种细胞如成纤维细胞、巨噬细胞、炎症发生过程中有多种细胞如成纤维细胞、

28、巨噬细胞、白细胞等和多种因子参与，特别是白细胞等和多种因子参与，特别是IL-1IL-1、TNF-TNF- 、IL-IL-8 8、IL-6IL-6等细胞因子对炎症反应起着重要的调节作用。等细胞因子对炎症反应起着重要的调节作用。实验证明许多抗炎药对这些因子的释放和合成有抑制作实验证明许多抗炎药对这些因子的释放和合成有抑制作用。用。建立针对这些因子的体外抗炎药筛选体系，为发现新的建立针对这些因子的体外抗炎药筛选体系，为发现新的具有抗炎作用的药物提供一种快速有效的方法。具有抗炎作用的药物提供一种快速有效的方法。 43本实验利用本实验利用脂多糖体外刺激人血白细胞释放炎性脂多糖体外刺激人血白细胞释放炎性因

29、子的筛选体系因子的筛选体系人血白细胞人血白细胞5 5* *10106 6/ml+LPS(5ug/ml)/ml+LPS(5ug/ml)3737、5%CO5%CO2 2 孵育孵育 4h4h取上清待测取上清待测IL-1IL-1、IL-8IL-8、TNF-aTNF-a44高内涵筛选计数仪，原理是基于一个完全自动荧光显微高内涵筛选计数仪，原理是基于一个完全自动荧光显微镜，根据细胞的数目反映单个细胞内的荧光强度和信镜，根据细胞的数目反映单个细胞内的荧光强度和信号位置。作者使用该方法对体外正常人类表皮成纤维号位置。作者使用该方法对体外正常人类表皮成纤维细胞增殖进行了量化。作者用胰岛素生长因子、血小细胞增殖进行了量化。作者用胰岛素生长因子、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子板衍生的生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子或血清刺激正常人表皮成纤维细胞后，检测了或血清刺激正常人表皮成纤维细胞后，检测了KI-6