第十八章_高效液相色谱法

1、2022-3-24第第第第第第十八十八十八十八十八十八章章章章章章高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法一、一、HPLCHPLC与经典与经典LCLC区别区别二、二、HPLCHPLC与与GCGC区别区别三、三、HPLC主要类型和原理主要类型和原理第一节第一节第一节第一节第一节第一节HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC主要类型与原理主要类型与原理主要类型与原理主要类型与原理主要类型与原理主要类型与原理2022-3-24高效液相色谱法：高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色

2、谱法。色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。2022-3-24一、一、一、一、一、一、HPLCHPLCHPLC与经典与经典与经典与经典与经典与经典LCLCLC区别区别区别区别区别区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1、经典经典LC：仅做为一种分离手段仅做为一种分离手段柱内径柱内径13cm，固定相粒径固定相粒径100m 且不均匀；常压输送流且不均匀；常压输送流动相；柱效低（动相；柱效低（H，n）；分析周期长；无法在线检测）；分析周期长；无法在线检测2、HPLC：分离和分析分离和分析柱内径柱内径26mm，固定相粒径固定相粒径流动相极性流动相极性（

3、1）正相键合相色谱：采用极性键合相为固定相，）正相键合相色谱：采用极性键合相为固定相，以非极性或弱极性溶剂为流动相。以非极性或弱极性溶剂为流动相。组分极性越大，保留组分极性越大，保留时间越长时间越长正相键合相色谱正相键合相色谱极性基团极性基团丙氨基丙氨基氰乙基氰乙基醚和醇等醚和醇等分离溶于有机溶剂的极性分离溶于有机溶剂的极性至中等极性分子型化合物至中等极性分子型化合物有机基团有机基团2022-3-24（2）反相键合相色谱：采用非极性键合相为固定）反相键合相色谱：采用非极性键合相为固定相，以极性或弱极性溶剂为流动相相，以极性或弱极性溶剂为流动相反相键合相色谱反相键合相色谱固定相极性固定相极性流动

4、相极性流动相极性组分极性越小，保组分极性越小，保留时间越长留时间越长疏水基团疏水基团C18基基C8基基苯基苯基分离溶于有机溶剂分离溶于有机溶剂的非极性或中极性化合物的非极性或中极性化合物有机基团有机基团2022-3-24（3）键合相色谱法分离机理）键合相色谱法分离机理反相键合相色谱反相键合相色谱:常用固定相：常用固定相：C18（ODS）分离对象分离对象非极性非极性中等极性化合物中等极性化合物常用流动相常用流动相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水反相键合相色谱疏溶剂分离机制反相键合相色谱疏溶剂分离机制固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性 2022-3-24分离机制？分离机制？分配：把有机键合层作为

5、一个液膜看待，溶质分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用定向作用 分离选择性：分离选择性：极性强的组分极性强的组分k k大，后洗脱出柱。大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k k减小，减小，t tR R 减小。减小。2022-3-24例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基（疏水十八烷基（疏水基团）键合相基

6、团）键合相二醇基（极性二醇基（极性基团）键合相基团）键合相2022-3-24保留时间：保留时间：例：以例：以ODS键合色谱柱、甲醇键合色谱柱、甲醇- -水为流动相分离水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。COOHOHOHCOOHOHOHHO没食子酸没食子酸3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸固定相固定相: 非极性非极性; 流动相流动相: 极性极性组分极性组分极性: 3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸没食子酸没食子酸2022-3-24第第第第第第十八十八十八十八十八十八章章章章章章高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱

7、法一、化学键合相色谱法固定相一、化学键合相色谱法固定相二、化学键合相色谱法流动相二、化学键合相色谱法流动相三、分离条件的选择三、分离条件的选择第二节第二节第二节第二节第二节第二节固定相和流动相选择固定相和流动相选择固定相和流动相选择固定相和流动相选择固定相和流动相选择固定相和流动相选择2022-3-24一、化学键合相色谱法的固定相一、化学键合相色谱法的固定相一、化学键合相色谱法的固定相一、化学键合相色谱法的固定相一、化学键合相色谱法的固定相一、化学键合相色谱法的固定相1 1、键合相的种类、键合相的种类 （1 1）非极性键合相）非极性键合相 ：非极性烃基，如非极性烃基，如C C1818C C8

8、8C C1 1与苯基等键合在硅胶表面；与苯基等键合在硅胶表面； 用于反相色谱；用于反相色谱；长链烷基可使溶质的长链烷基可使溶质的k k增大，选择性改善，载样量提高，增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。稳定性更好。 固定相应符合下列要求：固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。2022-3-24（2 2）弱极性键合相：）弱极性键合相：醚基和二羟基等键合相醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱用于反相或正相色谱（3 3）极性键合相：）极性键合相：常

9、用氨基常用氨基氰基键合氰基键合相（氰乙硅烷基相（氰乙硅烷基Si(CHSi(CH2 2) )2 2CN)CN)键合键合硅胶，一般用于正硅胶，一般用于正相色谱相色谱 键合固定相类键合固定相类型型疏水基团疏水基团烷烃（烷烃（C8和和C18）、）、苯基等苯基等极性基团极性基团丙氨基丙氨基氰乙基氰乙基醚和醇等醚和醇等离子交换基团离子交换基团胺基、季铵盐胺基、季铵盐磺酸、羧酸磺酸、羧酸2022-3-242 2 2 2 2 2、键合相的性质和特点、键合相的性质和特点、键合相的性质和特点、键合相的性质和特点、键合相的性质和特点、键合相的性质和特点 （1 1）键合反应）键合反应硅氧烷（硅氧烷（SiSiO OSi

10、SiC C）型：氯硅烷与硅胶型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应进行硅烷化反应 如：如：YWGYWGC C1818H H3737，无定形硅胶无定形硅胶YWGYWG上键合了十八硅烷上键合了十八硅烷基；基；SpherisorbSpherisorb ODS ODS，球形硅胶球形硅胶SpherisorbSpherisorb 上键上键合了合了ODSODS。 硅胶硅胶十八烷基氯硅烷十八烷基氯硅烷ODS(C18)键合相键合相2022-3-24（2 2）键合相的性质）键合相的性质含碳量：含碳的百分数含碳量：含碳的百分数 覆盖度覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例醇基

11、总数的比例 封尾（封尾（end-cappingend-capping）：）：在键合反应后，用三在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 （3 3）键合相的特点）键合相的特点使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高；使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高；重现性好；适于梯度洗脱；载样量大重现性好；适于梯度洗脱；载样量大 2022-3-24 注意：流动相的注意：流动相的pHpH一般应在一般应在3-83-8，否则会引起硅胶，否则会引起硅胶溶解；溶解；( (也有适用宽也有适用宽pHpH范围的键合相范围的键合相) )二、化学键合相色谱法的流动相二

12、、化学键合相色谱法的流动相二、化学键合相色谱法的流动相二、化学键合相色谱法的流动相二、化学键合相色谱法的流动相二、化学键合相色谱法的流动相 对流动相的要求：流动相也称洗脱剂对流动相的要求：流动相也称洗脱剂 与固定相不发生化学反应。与固定相不发生化学反应。 对试样有适宜的溶解度。使对试样有适宜的溶解度。使k在在110范围内，范围内， 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。截止波长小于检测波长的溶剂。 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈乙腈等可以降低柱压，提高柱效。等可以降低柱压，提高柱效。

13、 2022-3-241、流动相对分离的影响、流动相对分离的影响 n：由色谱柱（固定相）性能决定，：由色谱柱（固定相）性能决定， ：主要受溶剂种类的影响，：主要受溶剂种类的影响， k：受溶剂配比的影响。：受溶剂配比的影响。 2211-4nkkR2 2、流动相的强度和选择性、流动相的强度和选择性 溶剂的极性（强度）溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2022-3-24注意：对于非电离的溶剂，在正相色谱中溶剂的注意：对于非电离的溶剂，在正相色谱中溶剂的强度和极性是同义词。这样强溶

14、剂或极性溶剂能强度和极性是同义词。这样强溶剂或极性溶剂能溶解极性的溶质，并使溶质在较小的溶解极性的溶质，并使溶质在较小的k k值下流出。值下流出。在反相色谱中溶剂极性和使溶质从柱内流出的能在反相色谱中溶剂极性和使溶质从柱内流出的能力之间的关系正好相反。如水是强溶剂，但在反力之间的关系正好相反。如水是强溶剂，但在反相色谱中，它使溶质流出的能力是极小的，水中相色谱中，它使溶质流出的能力是极小的，水中必须加上有机溶剂才能使溶质在反相色谱柱上在必须加上有机溶剂才能使溶质在反相色谱柱上在适当的适当的k k值下流出值下流出2022-3-24三、分离条件的选择三、分离条件的选择三、分离条件的选择三、分离条件

15、的选择三、分离条件的选择三、分离条件的选择 1 1、HPLCHPLC中的速率理论中的速率理论涡流扩散涡流扩散A=2dA=2dp p 球形、小粒度、均匀（球形、小粒度、均匀（RSD5%）固定相，匀浆固定相，匀浆高压填充，以降低高压填充，以降低A。纵向扩散纵向扩散=2D=2Dm m 可以忽略。可以忽略。 因为因为D Dm m很小，室温操作，且很小，室温操作，且U大于大于U最佳最佳，溶剂的选择性：见图溶剂的选择性：见图18-518-5不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）混合溶剂（二元或多元流动相）2022-3-

16、242022-3-24 传质阻抗：（引起色谱峰变宽）传质阻抗：（引起色谱峰变宽） 固定相传质阻抗固定相传质阻抗CS可以忽略可以忽略 ，因，因df极小极小 流动相传质阻抗流动相传质阻抗Cm m因子因子 要求：要求： dp小，小，Dm大大m2PmmDdC静态流动相传质阻抗静态流动相传质阻抗：（引起色谱峰变宽）：（引起色谱峰变宽）由于部分流动相在固定相微孔内的滞留静态由于部分流动相在固定相微孔内的滞留静态流动相中再与固定相作用，传质阻抗系数流动相中再与固定相作用，传质阻抗系数C Csmsm C Csmsm ddp p2 2， C Csmsm 1/D1/Dm m，而，而D Dm mT/T/要求要求:

17、: 固定相固定相d dp p2 2、 流动相流动相都小都小2022-3-242022-3-24H=H=A+CA+Cm mu+Cu+Csmsmu u 原因：化学键合相，液体流动相原因：化学键合相，液体流动相结果：结果：HPLCHPLC的实验条件应该是：的实验条件应该是：小粒小粒度、均匀的球形化学键合相；度、均匀的球形化学键合相；低粘度低粘度流动相，流速不宜过快（流动相，流速不宜过快（1ml/min1ml/min）；）；柱温适当。柱温适当。 2022-3-24第第第第第第十八十八十八十八十八十八章章章章章章高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法一、高压

18、输液系统一、高压输液系统二、进样系统二、进样系统三、分离系统三、分离系统四、检测系统四、检测系统第三节第三节第三节第三节第三节第三节高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪2022-3-242022-3-242022-3-242022-3-242022-3-24高压泵高压泵流动相溶剂流动相溶剂废液废液色谱柱色谱柱进样口进样口检测器检测器2022-3-24一、高压输液系统一、高压输液系统1 高压泵高压泵要求要求输出压力高输出压力高平稳、脉冲小平稳、脉冲小流量稳定可调流量稳定可调耐腐蚀耐腐蚀2022-3-242 梯度洗脱装置梯度洗脱装置通过改变流动相的组

19、成来调整组通过改变流动相的组成来调整组分的分的k k值，改变分离因子值，改变分离因子值，以值，以达到最短时间内得到最佳分离目达到最短时间内得到最佳分离目的得洗脱方式。的得洗脱方式。梯度洗脱梯度洗脱2022-3-24洗脱方式洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似类似GC的等温度洗脱的等温度洗脱2）梯度洗脱：）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类在一定分析周期内不断变换流动相的种类 和比例即不断改变其极性（两个泵）和比例即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分

20、适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似GC的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）2022-3-24等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱各组分各组分k相差较大，相差较大，k大的峰宽矮，大的峰宽矮，分析时间长分析时间长溶解能力较强的溶解能力较强的B，各组分，各组分很快被洗脱下来，但很快被洗脱下来，但k小的小的得不到分离得不到分离梯度洗脱使各组分在适宜梯度洗脱使各组分在适宜k下全部流出，峰形好时间短下全部流出，峰形好时间短2022-3-24梯度洗脱梯度洗脱的特点的特点改善分离改善分离, , 加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形, , 减少拖尾减少拖尾; ;可能引起可能引起基线

21、漂移基线漂移分配比变化范围宽的分配比变化范围宽的复杂样品应采取复杂样品应采取梯度洗脱方式分离梯度洗脱方式分离2022-3-243 贮液瓶及流动相贮液瓶及流动相1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2) 适用于所选择的检测器。适用于所选择的检测器。3) 化学惰性好，以免破坏固定相。化学惰性好，以免破坏固定相。4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5) 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。对流动相溶剂对流动相溶剂的一般要求的一般要求2022-3-24二、

22、二、进样系统进样系统 准备状态准备状态 进样状态进样状态六通阀进样六通阀进样 装置装置自动进样器自动进样器 2022-3-24三、三、色谱柱色谱柱内径：内径：16 mm，柱长：柱长：530 cm；柱填料粒径：柱填料粒径：5m 2022-3-24四、四、检测系统检测系统1 紫外吸收检测器紫外吸收检测器(a) 可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器(b) 二极管阵列检测器二极管阵列检测器氘灯氘灯光栅光栅流通池流通池测量光电二极管测量光电二极管参比光电二极管参比光电二极管2 二极管阵列检测器二极管阵列检测器2022-3-24两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；可变波长紫外检

23、测器；(b)：二极管阵列检测器二极管阵列检测器(b)(a)nm254 2022-3-24紫外检测器紫外检测器灵敏度高，灵敏度高，精密度及线性范围较好精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 流动相选择有限制。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂CS2氯仿氯仿四氢四氢呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截止紫外截止波长波长/nm3802452122101902051872022-3-24第第第第第第十八十八十八十八十八十八章章章章章章高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法一、定性定量方法一、定

24、性定量方法二、分离方法选择二、分离方法选择第四节第四节第四节第四节第四节第四节HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC分析方法分析方法分析方法分析方法分析方法分析方法2022-3-24 定性分析方法定性分析方法 定量分析方法：外标法、内标法定量分析方法：外标法、内标法 同同GC（自己看）自己看）一、定性定量方法一、定性定量方法一、定性定量方法一、定性定量方法一、定性定量方法一、定性定量方法 固定相固定相：十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水100%甲醇，甲醇， 线性梯度淋洗线性梯度淋洗 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器稠环稠环芳烃芳烃多为多为