形态学实验第6周细胞培养基础

1、 细胞培养定义细胞培养定义 细胞培养细胞培养简史简史 生长类型生长类型 细胞形态细胞形态 传代次数传代次数u定义：定义： 模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。u优点：优点：1活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控；3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；u缺点：缺点： 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； 当细胞被置于体外培养后，生活

2、在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 按生长方式: 贴壁型细胞（Monolayer cells） 悬浮型细胞（Suspension cells）l 绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。按细胞形态(贴壁细胞）： 成纤维型细胞（Fibroblast-liked cells） 上皮型细胞（Epithelium-liked cells） 其它，不定型 成纤维型细胞成纤维型细胞梭形或不规则三角形中央有卵圆形核胞质向外伸出长短不同的突起中胚层间质起源 上皮型细胞上皮型细胞扁平不规则多角形细胞中央有圆形核紧密相连单层膜样生长内、外胚层细胞如皮

3、肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞游走型细胞散在生长，一般不连成片细胞质经常伸出伪足或突起活跃的游走或变形运动羊水细胞培养的早期多形细胞型多形细胞型 难以确定规律和稳定的形态 如神经组织的细胞等 细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；转化细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。 原代培养

4、原代培养 （primary culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 克隆克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的遗传性状一致的细胞群细胞群。 细胞系细胞系（cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 细胞株细胞株（cell strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有具有特定性质或标志特定性质或标志的细胞群的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。 The American Type

5、Culture Collection (ATCC) The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) National Institute of Health (NIH), USA National Cancer Institute (NCI), USA 常用仪器设备常用仪器设备 培养器皿培养器皿 培养基培养基 血清血清 其他细胞培养试剂其他细胞培养试剂 超净台或生物安全柜：超净台或生物安全柜：细胞操作 CO2 培养箱：培养箱：细胞培养 液氮罐：液氮罐：细胞长期冻存 37 水浴：水浴：培养溶液预热，细胞复苏 倒置显微镜：倒置显微镜：观

6、察细胞 离心机：离心机：收集细胞，细胞常用300g转速5min 冰箱：冰箱：细胞培养溶液分装储存 负压吸引器：负压吸引器：细胞培养废液吸取垂直风超净台垂直风超净台水平风超净台水平风超净台生物安全柜生物安全柜没有一定的标准，有几点建议可供参考： 1.建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 2.其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 3.用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 1.血清必须贮存于20 -70，若存放于4

7、，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2.血清解冻步骤(逐步解冻法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。3.热灭活（heat-inactivation）是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，

8、一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。4.勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质凝絮物：凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白脂蛋白(lipoprotein) 变性变性及解冻后血清中存在之及解冻后血清中存在之血纤维蛋白血纤维蛋白(fibrin) 造成，造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心物，可用离心3000 rpm, 5 min

9、 去除，或离心后上清液可以加入培去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。阻塞过滤膜。 显微镜下观察之显微镜下观察之“小黑点小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点小黑点”，常，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此中欲培养此“微生物微生物“，但在但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖

10、，环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。另一批号的血清。 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，44下放置下放置7 7天天即可分解约即可分解约50%50%，所以都是在使用前添加，所以都

11、是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在配制好的培养液（含谷氨酰胺）在44放置放置2 2周以上时，要重新周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内入培养液内使用终浓度为使用终浓度为1-4mM1-4mM一般配制为一般配制为100100倍浓缩液，即浓度为倍浓缩液，即浓度为200mM200mM（29.22g/L29.22g/L）配制方法为配制方法为 ：谷氨酰胺：谷氨酰胺2.922g2.922g溶于三蒸水加至溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成200mM200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温的溶

12、液，充分搅拌溶解后（应加温3030），过滤除菌，分），过滤除菌，分装小瓶，装小瓶，-20-20保存，使用时可向保存，使用时可向100ml100ml培养液中加入培养液中加入0.5-2ml0.5-2ml谷谷氨酰胺浓缩液，终浓度为氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM 1-4mM 细胞原代培养细胞原代培养 细胞换液与传代细胞换液与传代 细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏 细胞计数与活力细胞计数与活力 细胞污染与控制细胞污染与控制换液：换液：全量换液和半量换液换液时机的选择换液时机的选择：培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄。 细菌污染细菌污染 真菌污染真菌污染 细菌

13、和真菌的清除细菌和真菌的清除 支原体污染支原体污染 支原体的清除支原体的清除 细胞培养常见的污染 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 使用抗生素使用抗生素 抗生素对杀灭细菌较有效。 联合用药比单独用药效果好。 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 污染后清除用药需采用大于常用量510倍药物冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规

14、培养液。此法在污染早期有效。9595以上是以下四种支原体：以上是以下四种支原体：口腔支原体（口腔支原体（M.oraleM.orale）精氨酸支原体（精氨酸支原体（M.argininiM.arginini）猪鼻支原体（猪鼻支原体（M.hyorhinisM.hyorhinis）牛莱氏无胆甾原体（牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawiiA.laidlawii）危害：危害：世界性问题，平均发生率达到世界性问题，平均发生率达到11%11%能改变细胞的能改变细胞的DNA,RNADNA,RNA及蛋白表达及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染对细

15、胞的生长率影响较小，不易引起注意污染来源：来源：操作环境不良操作环境不良操作人员的疏失操作人员的疏失实验器具不洁等实验器具不洁等已受污染的细胞已受污染的细胞已受污染的培养基、血清已受污染的培养基、血清荧光染色法荧光染色法电镜检查电镜检查：扫描电镜扫描电镜、透射电镜透射电镜支原体培养支原体培养聚合酶链反聚合酶链反应应(PCR)法法细胞营养液常常细胞营养液常常仍清亮但仍清亮但变黄变黄,细胞生长变缓细胞生长变缓，部部分细胞发生脱落等等分细胞发生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样，细胞间隙可见铺满细沙样小点小点。 支原体清除剂支原体清除剂MRA （Mycoplasma Removal Agent）处理法

16、）处理法每每4天换一次液，连续处理天换一次液，连续处理15天天 清洗纯化法清洗纯化法细胞营养驯化细胞营养驯化优质细胞群的筛选优质细胞群的筛选细胞清洗细胞清洗反复离心洗涤反复离心洗涤 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数使其中潜在的支原体数量降低至极限量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 药物辅助高温处理法药物辅助高温处理法先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41培养培养18小时，小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。可杀死支原体，但对细胞有不良影响。 支原体特异性血清法支原体特异性血清法 用用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，