【课件】3.2.1基因工程的基本操作程序课件2021-2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3

1、3.2 基因工程的基本操作程序（1）提提 取取普通大肠杆菌普通大肠杆菌( (不能分泌胰岛素不能分泌胰岛素) )人体组织细胞人体组织细胞胰岛素基因胰岛素基因（2 2）与运载体与运载体DNADNA拼接拼接（3 3）导入导入大肠杆菌大肠杆菌( (含含胰岛素基因胰岛素基因) )（4）转基因大肠杆菌）转基因大肠杆菌( (能分泌胰岛素能分泌胰岛素) )培育转基因大肠杆菌一般需要哪些步骤？培育转基因大肠杆菌一般需要哪些步骤？第一步：目的基因的筛选与获取第二步：基因表达载体的构建（核心） 第三步：将目的基因导入受体细胞第四步：目的基因的检测与鉴定 从社会中来（1）定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细

2、胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。根据不同的需要，目的基因不同，根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因主要是指编码蛋白质的基因。如：如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。相关的基因。资料：资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt Bt 抗虫蛋抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将科学家将“杀虫基因杀虫基因”转入棉花中，棉花产生转入棉花中，棉花产生Bt Bt 抗虫蛋白抵抗虫害

3、。抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因目的基因一.目的基因的筛选与获取1.目的基因非编码区非编码区非编码区非编码区启动子：启动子：RNARNA聚合酶的识别和结合聚合酶的识别和结合位点位点 开始转录开始转录编码区编码区（1）原核生物基因终止子终止子：终止：终止转录转录非编码区 组成：编码区上游与编码区下游 功能：不能编码蛋白质，遗传信息的表达启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号终止子：终止RNA的合成编码区：编码蛋白质的合成一.目的基因的筛选与获取2.基因的结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶结合聚合酶结合位点位点外显子外显子内含子内含子1 12 23 34 45

4、 5加 工mRNA前体成熟mRNA不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子12345启动子启动子终止子终止子一.目的基因的筛选与获取（2）真核生物基因转 录2.基因的结构 科学工作者分离得到了某科学工作者分离得到了某原核生物原核生物基因，并将其解离成两条单链。基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RNARNA杂交配对，结果如图所示。杂交配对，结果如图所示。信使信使RNARNA基因的一条链基因的一条链一.目的基因的筛选与获取（1）原核生物基因2.基因的结构成熟信使成熟信使RNARNA对应基因的一条链对应基因的一条

5、链一.目的基因的筛选与获取（2）真核生物基因【思考1】从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是 。胰岛素基因胰岛素基因含含内含子内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的的RNARNA序列序列不能不能被被切除切除，无法，无法表达表达出胰岛素出胰岛素2.基因的结构原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较（2）编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细

6、胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码（1）非编码序列：包括非编码区和内含子【思考2】一.目的基因的筛选与获取2.基因的结构目的基因获取方法目的基因获取方法利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因一.目的基因的筛选与获取3.目的基因的筛选与获取方法从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选人工合成人工合成从从基因文库基因文库中获取中获取PCR技术：PCR是_ _的缩写，是一项根据_的原理，在_ _提供参与DNA复制的_ _与_ _，对_ _进行_ _的技术；聚合酶链式反应DNA半保留复制体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制全称全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体

7、外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因一.目的基因的筛选与获取4.利用PCR获取和扩增目的基因原理原理操作环境操作环境目的目的优点：优点：DNA复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用 解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的DNA聚合酶）（体外用高温代替）（2种）引物是一小段能与_的一段碱基序列_的_DNA母链互补配对短单链核酸35DNA母链35DNA母链35引物35引物一.目的基因的筛选

8、与获取4.利用PCR获取和扩增目的基因耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）DNADNA模板模板引物引物（2 2种种）稳定的缓冲溶液稳定的缓冲溶液（一般添加（一般添加MgMg2+2+）PCR条件:一.目的基因的筛选与获取四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶4.利用PCR获取和扩增目的基因3 35 53 35 53 35 53 35 5A.变性 当温度上升到当温度上升到9090以上以上时，时，双链双链DNADNA解聚为单链解聚为单链B.复性当温度下降到当温度下降到5 500左右左右时，时，两种引物通过两种引物通过碱基互补配对

9、碱基互补配对与两条单链与两条单链DNADNA结合结合C.延伸当温度上升到当温度上升到7272左右左右时，时，溶溶液中的液中的4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸在在耐高温耐高温的的DNADNA聚合酶聚合酶的作用下，根据的作用下，根据碱碱基互补配对原则基互补配对原则合成新的合成新的DNADNA链链PCR反应过程3 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 5一.目的基因的筛选与获取4.利用PCR获取和扩增目的基因第一轮循环的第一轮循环的产物产物作为第二轮反应的作为第二轮反应的模板模板，经过，经过变性、变性、复性和延伸复性和延伸三步产三步产生第二轮循环的产

10、生第二轮循环的产物；物；第二轮循环的第二轮循环的产物产物作为第三作为第三轮反应的轮反应的模板模板，经过经过变性、复变性、复性和延伸性和延伸三步三步产生第三轮的产生第三轮的产物；产物；第二轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物第三轮的产物完成以后，完成以后，常采用常采用琼脂琼脂糖凝胶电泳糖凝胶电泳来鉴定来鉴定PCRPCR的产物的产物PCR反应过程一.目的基因的筛选与获取一.目的基因的筛选与获取PCR反应过程一.目的基因的筛选与获取1PCR反应与体内反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？复制的引物在化学本质上是否相同？不相同。体内不相同。体内DNA复制所需引物为复制所需引物为RNA聚合

11、酶合成的一小段聚合酶合成的一小段RNA，但，但PCR反应时所用引物是人工加入的一小段反应时所用引物是人工加入的一小段DNA。思考讨论：2PCR过程中需要加入两种引物，原因是？3两种引物的要求？DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 引物自身不能环化 两种引物之间不能互补配对引物长度不宜过短，防止引物随机结合【典例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 (1）第1组： ； 第2组： 。引物和引物局部发生碱基互补配对而失效引物自身内部部分碱基发生互补配对而失效(2)两种引物与模板链

12、如何配对？ 。引物的5端与模板链3端互补配对（3）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。 (4)若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是 。两个引物从子链的5端向3端延伸5(2n+1-2)=62引物甲、引物丙启动子：启动子：RNARNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出因转录出mRNAmRNA。终止子：终止子：终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。 ; ; 。二.基因表达载体的构建1.目的使目的基因在受体细胞

13、中稳定存在使目的基因在受体细胞中稳定存在, ,并且可以遗传给下一代并且可以遗传给下一代使目的基因能够表达和发挥作用使目的基因能够表达和发挥作用核心步骤核心步骤2.组成标记基因：标记基因：目的基因：目的基因：复制原点：复制原点：便于重组DNA分子的筛选。能控制表达所需要的特殊性状。注意：目的基因必须插入到 与 之间。启动子 终止子DNA复制的起始位点。非编码区非编码区非编码区非编码区启动子：启动子：RNARNA聚合酶的识别和结合聚合酶的识别和结合位点位点 开始转录开始转录编码区编码区（1）原核生物基因终止子终止子：终止：终止转录转录非编码区 组成：编码区上游与编码区下游 功能：不能编码蛋白质，遗

14、传信息的表达启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号终止子：终止RNA的合成编码区：编码蛋白质的合成基因的结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶结合聚合酶结合位点位点外显子外显子内含子内含子1 12 23 34 45 5加 工mRNA前体成熟mRNA不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子12345启动子启动子终止子终止子（2）真核生物基因转 录 科学工作者分离得到了某科学工作者分离得到了某原核生物原核生物基因，并将其解离成两条单链。基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RN

15、ARNA杂交配对，结果如图所示。杂交配对，结果如图所示。信使信使RNARNA基因的一条链基因的一条链（1）原核生物基因成熟信使成熟信使RNARNA对应基因的一条链对应基因的一条链（2）真核生物基因【思考1】从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是 。胰岛素基因胰岛素基因含含内含子内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的的RNARNA序列序列不能不能被被切除切除，无法，无法表达表达出胰岛素出胰岛素原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和

16、具有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较（2）编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码（1）非编码序列：包括非编码区和内含子【思考2】辨析：辨析：“启动子与终止子启动子与终止子”和和“起始密码子与终止密码子起始密码子与终止密码子”启 动 子 与 终 止 子 位 于启 动 子 与 终 止 子 位 于DNADNA分子分子中，中，作用：起始和终止作用：起始和终止转录转录过程过程。启动密码子与终止密码启动密码子与终止密码子位于子位于mRNAmRNA分子分子中，中，作用：起始和终止作用：起始和终止翻译翻译过程过

17、程。二.基因表达载体的构建【思考1】重组重组DNA分子分子限制酶限制酶目的基因目的基因限制酶切割位点限制酶切割位点获取目的基因获取目的基因DNA连接酶连接酶基因表达载体构建模式图基因表达载体构建模式图限制酶限制酶启动子启动子限制酶切割位点限制酶切割位点终止子终止子标记标记基因基因复制复制原点原点质粒质粒同种同种限制酶或限制酶或能能产生相同末产生相同末端端的限制酶的限制酶二.基因表达载体的构建3.过程 如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用用DNADNA连接酶处连接酶处理后会出现几种产物？理后会出现几种产物？( (只考虑两两结合只考虑两两结合) )目的基因目的基因载体、载体、载体载体载体、载体、目的基因目的基因目的基因目的基因二.基因表达载体的构建【思考2】单酶切缺点：质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因反向连接【典例典例2】如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst、Sma、EcoR、Apa为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是()BA.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaC.图示过程是基