蛋白纯化答疑

1、蛋白纯化答疑By aqiao 发表于 2007-4-15 18:38:00 凝胶过滤层析 也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 关键是不知道你用什么凝胶过滤层析。一般来说大部分细菌比蛋白质小，要看是什么的凝胶过滤层析，才能达到材料上的阻挡。 响凝胶过滤层析的多种因素 很多人以为凝胶过滤非常简单直接，无需花太多精神仔细优化。其实影响凝胶过滤的参数非常多，现与大家分享几点经验： 1 层析柱必须有柱头及分布器，即adaptor，紧压胶面完合没有空隙，否则样品上样受影响。 2 凝胶悬浮液不可太稠，否则很容易出气泡；太稀装柱时间过长，亦影响效果

2、。50- 70%较适合。若是干粉，溶胀时间必须充足。装前完全搅匀。 3 一次性倒入层析柱中，容量不够则需加装柱器。切不可分几次倒，柱效和对称性都很难合格。 4 装柱及层析工作所用缓冲液的温度需一样。 5 柱底网下的气泡一定要除掉，可先用20%乙醇湿一下底网。 6 每种胶在不同柱高下的装柱流速、压力都不一样。跟足介质说明书的指引就万无一失了！找不到查AKTA系统的 Unicorn 中主屏幕的 adviser 即可，也可以查这光盘上有关层析凝胶的操作手册。 7 上样前柱平衡非常重要，不光UV平稳，至少平衡一个柱体积。 8 缓冲液pH值会影响分离效果，经验中用pH7.0和pH4.5的缓冲液分离5个低

3、分子量标准蛋白，结果颇有不同。 9 加入0.15M NaCl可防止非特异性的吸附及蛋白间的聚合。 如果在适当期间加入不同的材料可以有效的防止对应的细菌。 老兄，我新手哈，只能给你这么多的了。 这个网站可以稍微帮你点参考，但是得全综合来总结，我就不方便全部总结了！ 请多支持我哈，个人感觉你的问题太简单了。不好针对性的回答，不可能把所有的情况说出来再分析吧？！ 回答者：janefeng1986 - 试用期 一级 3-23 01:52同意楼上的说法 回答者：菜刀狗狗 - 助理 三级 3-25 18:25一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒

4、内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清

5、亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性

6、，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.59.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很

7、粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较

8、弱的. 取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? 而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的. 2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？ 在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。 首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。 我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次

9、。然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。菌体来自200 ml培养液，用20 ml PBS重悬。 然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100 ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1 mg/ml，半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。 真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。 同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。 溶菌酶在pH7.4时

10、是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？ 加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。 而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。 我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。据此可以判断细胞只是部分破碎。 不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。 如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。因为超声有可

11、能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。 我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。 如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？ 只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？ 溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH8.0，同时溶菌酶的量一定要足！ 在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。菌体来自500 ml培养物，用30 ml

12、PBS重悬，超声效率还是可以的。 哪儿的溶菌酶好用？ 我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重悬，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到56，加20 ul 2M Tris碱，体系pH升到8。4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。测pH仍在8左右。再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。 另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。条件：300W，超5秒停5秒，重复99次。菌液有变化，但很不明显。继续超声400次，从外观来看没有太大区别。我简直要说tmd了。见鬼了。 我的

13、操作有什么地方不妥当，请各位指正。 溶菌酶的厂商要求是否很重要？ 我的诱导物来自1：20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mM IPTG）。 是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬，我用20 ml，仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200 ml用3040 ml重悬。但实际操作也不够理想。 SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。 3、酵母的破碎 酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下，做破碎酵母的

14、几种方法： 1 机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。 2 化学裂解的方法：10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评） 3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高压匀浆。（这个好象也该在方法2中） 4 液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。 5 温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体 酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。lyt

15、icase，可以从sigma定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。 我用过化学裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的，不妨试一下。 一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），据说效果可以 酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。 4、超声破碎的条件选择 超声

16、破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。 5、如何鉴定细菌超声破碎的程度 最简单的方法：涂片-革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟-显微镜观察 切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下 6、细菌裂解的DNaseI 不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换算说明。 另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。 我用过

17、华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。华美也有RNase free的DNA酶，定量用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。 我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。 其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。 7、超声裂解细菌是否完全？ 最简单的方法：涂片-革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟-显微镜观察 切记：只用结晶紫染色 二、包涵体的洗涤 1、包涵体的洗涤问题 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留

18、样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。 2、如何得到比较纯的包涵体 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一

19、些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去

20、除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍

21、溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验际温度要比设定温度低至少4度（呵呵，不好意思！）。不过我接着往下进行SDS-PAGE、层析等发现没有什么不良影

22、响。所以，你不用担心也许你的蛋白也只是和你开了个玩笑呢！ 三、关于包涵体的溶解： 1、 请教GST包涵体溶解 直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。（由于快速稀释相当于复性过程，产物用于检测没有问题的） 我所用的包涵体提取方法： 1PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体，超声波破碎至清亮 24度，10000rpm离心10分钟，弃上清 3用PBS或生理盐水洗涤沉淀23次 4往沉淀中加197ml Buffer A及03ml 20的SKL（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置30分钟至2小时 54度，10000rpm离心10

23、分钟，取上清 6加20PEG4000 210ul至终浓度为02，加50mM的氧化型谷胱甘肽420ul至终浓度为1mM,加100mM的还原型谷胱甘肽420ul至终浓度为2mM,静置30分钟至2小时（亦可4度复性过夜） 7以PBS（pH8.0)或TE（pH8.0)透析，取出20度保存备用 ！Buffer A配方： Tris-base 50mM EDTA 0.5mM NaCl 50mM 甘油 5% DTT 5mM 2、包涵体的溶解 十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了 3、有关包涵体的溶

24、解问题 强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨

25、酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。 4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存? 我在4度放了半个月，目前没出什么问题 5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题? BI溶液在室温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。 6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？ GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂，否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的 GST的Beads是应用酶与底物结合的原理，所以要

26、去除处理因素后才好结合，不知你的温和的去污剂是什么？ 做完裂解之后加Triton X100轻摇30min，蛋白溶解的会多些！ 四、包涵体的复性 1、包涵体如何复性 包涵体的复性主要有两种方式： 1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释 2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂 其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上的2硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！ 另外，你用多大体积的透析缓冲液？可能不够，要更换几次 你家了多少蛋白呀 ？蛋白量过大也会使复性困难。 你用的透析代是否是新的，处理过没有？新代有化学杂质！ 最后，有些复

27、性过程就是还有沉淀（透析方法的缺点）看看溶液中蛋白含量，说不定已经够用了 包涵体的复性还要注意以下几点： 1.首先要获得较高纯度的包涵体。 2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。 3.透析前后均要离心 4.透析不能太快. 5.纯化的最佳条件要摸索。 小技巧： 1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100. 2) 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性 3）复性液的组成很有讲究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-

28、24h 4) 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h 5) 复性率的测定 据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解） 6）TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于0.5%吧，忘了。 我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。 这段文字可以参考： 用Novagen公司pET System Manual提供的方法，分

29、别进行细菌渗透休克，超声波裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。 渗透休克 用方法诱导细菌（10ml体积），测菌液OD600，10000 r/min离心0.5 min去上清，加入渗透休克溶液1（V1= OD 600V2/5，V1为渗透休克溶液1，V2为培养新鲜菌液），冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，去上清。加V1体积渗透休克溶液2重悬，摇动冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，保存上清、细菌沉淀。作如下处理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加1/10体积100% TCA (w/v)，涡漩

30、15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min离心5 min，100 ul丙酮洗涤沉淀，干燥1 h，加V1/2体积1 PBS（pH 10）溶解，-20保存，取10 ul加入等体积2SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系统照相。 超声波裂解细菌 渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0）重悬，冰浴，超声波裂解，20%工作选择，脉冲粉碎1 min，然后13000 r/min离心5 min，-20保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀，处理同上。沉淀用Protein Extraction

31、Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen公司pET System Manual提供方法反复处理，洗涤包涵体。包涵体按培养菌100OD600/3 ul体积加1% SDS溶解，加等体积2SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30占细菌总蛋白的相对含量。 1.2.7重组融合蛋白的纯化 PrP-pET-32a（+）转化表达菌E.coli BL21（DE3），TB培养基中，25，AMP 200 ug/ml，摇床（250 rmin）培养至OD600约为1.5，

32、更换等体积新鲜TB培养基，加入IPTG至终浓度1 mM，AMP 200 ug/ml，25，4 h，4000 g离心收集菌体。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。 或使用笔者改进方法，将Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免长菌。 洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrP

33、C27-30，冻干保存。然后12% SDS-PAGE凝胶电泳分析。 3、包涵体复性2 精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。 另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。 对于疏水蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。或者换成GST融合表达载体，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我的蛋白包涵体在经变性纯化后透析复性过程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成

34、正确的二硫键。复性是一个很难捉摸的过程，不同蛋白的复性条件也各不相同。 5、包涵体复性问题 包含体复性三大原则： 1。低浓度 2。平缓梯度 3。低温 有蛋白析出最大的可能型是：蛋白浓度太高，建议你稀释以后再作透析。 此外，透析的盐浓度（比如ura）要平缓降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。 6、包涵体复性形成聚集物 关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节PH可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白有没有活性还是问题，虽然样品溶解了，但活性不高或没有也不行呀！ 7、复性中蛋白析出！ 出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据你包含体的溶液成分

35、，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。 若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M； 另外可将甘油浓度增加，范围可在30%，且在复性样品中也可加适量甘油；一些拙见。 8、包涵体复性液配方 对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。TRIS系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；不过复性过程主要是注意以下几个问题： 1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；

36、 2) 温度适宜选择4； 3）复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL； 4) 复性时间一般为24-36小时； 5) 低分子化合物 如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6) 氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。 还有就是你的蛋白质的特性 9、什么叫复性成功 复性效果的检测： 根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 1，凝胶电泳：一般可以用非

37、变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 2，光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。 3，色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同， 4，生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 5，黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水

38、溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。 6，免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。 在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间结构，以执行某一些生命活动。当外界环境改变时，可能造成基因突变和蛋白质序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体有害的反应，引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚，许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，且没有普遍性，但从这许许多多的个例中发现了一些规律：如聚集的发生是由链

39、间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等，并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。 10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功 问：最近在做GST融合蛋白的纯化，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，所以在变性条件下将包涵体溶解，经复性，透析后用GSH sepharose 4B纯化，结果得到了比较纯的融合蛋白，这是否说明GST的活性已得到恢复（因为能与GSH结合），请问这种情况下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复？由于我的目的蛋白

40、只是一个蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受体之类的，所以不知如何鉴定它的活性。 如果我得到的是变性的融合蛋白，那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗？ 如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B纯化得到的融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？溶液中的GSH，Tis等成分对免疫动物有影响吗？是否需要透析除取这些成分才能去免疫动物呢？ 答：1）。不可以。GST 具体多大忘记了，但做为TAG 使用的 蛋白纯化中的一点心得 .大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对

41、其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。 2.利用Ni2+亲和层析纯化带有His Tag的融合蛋白，在洗脱非特异结合蛋白的时候，首先用PBS洗脱3遍，每次10min，然后用含有低浓度的咪唑（40mM）的PBS继续洗涤3遍，每遍10min；这样可以将非特异的结合蛋白降低到最低。3.本人在选择亲和层析的时候偏向于选择beads而不是已经量化的柱子。分析其原因是因为beads的用量可以根据自己要纯化的蛋白的多少决定beads的用量，而柱子不能；另外，一种蛋白最好选择单独的纯化系统，无论怎样洗脱，都很难将结合的蛋白全部洗下来，这样就很容易对接下来其他蛋白的纯化造成污染。4.Novagen的NTA是用来纯

42、化His tag得比较好的产品，Pharmasia的GST tag纯化系统比较好。5.要是纯化后的蛋白用来做PULL-DOWN试验，最后的洗脱步骤就不用做了，直接将挂有蛋白的Beads保存在4度，不过要添加一定量的蛋白酶抑制剂和NaN3，保存时间可以到一个月。6.最后做完试验，要上样SDS-PAGE鉴定，不用将蛋白洗脱下来，直接取10ul 的beads然后加入等体积的2*上样buffer，然后沸水煮沸10min，短暂离心后，去5ul就可以上样了。异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。另外，表达的宿主也是多种多样，目前

43、比较常用的包括E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。1. 宿主的选择。表达宿主虽众多，但比较常用的也就E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。 E.coli 原核宿主，无翻译后修饰。但周期短、费用低、表达量大，一直是最常用的宿主之一。蛋白一般很好表达，量很大，但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。酵母，有了比较完备的翻译后修饰系统，尤其是糖基化。但是个人感觉酵母表达异源蛋白时对蛋白本身的特点要求很大，有的蛋白表达量非常大，有的却几乎一点也

44、没有，很折磨人。昆虫细胞和动物细胞本人没有做过，但园子里也有很详细的介绍，搜一下google也有不少，其中还有许多是画成了表格，对比各自的优缺点，网络不好，没找链接，希望有人可以不全，多谢多谢！另外，也有很多用链霉菌表达的成功实例，不过个人感觉链霉做起来相当麻烦，周期长，转化困难，表达量也没什么优势，而且翻译后修饰虽然也有，但仍与真核差别较大。不过链霉菌有许多次级代谢产物（一些小分子物质）可能比蛋白表达本身更有意义2. 转化子、表达子的筛选转化子的筛选，由于许多质粒是穿梭质粒，因此大多具有E.coli中的抗性筛选标记，筛选起来是很方便的（当然，我不清楚细胞方面的筛选，一般使用病毒载体吧，希望高

45、手们介绍一下）。但是转化成功的并不意味着能够成功表达目的蛋白了，因此还需要“表达子”的筛选，尤其是整合入基因组的片断（E.coli一般是游离质粒表达，好像不用再筛选了，有就有，没有就没有了）。我做的是毕赤酵母(GS115,pPIC9k)，在筛选过程中遇到了不小的问题，一般如果目的蛋白有些容易检测的特殊活性（比如抑菌活性），则筛选起来是比较容易的。但是如果没有，由于酵母是整合入基因组表达的，就不太好说了，我用原位点杂交的方法筛选过，效果不好，但筛选量倒挺大；还有就是5ml小量发酵筛选，工作量就比较大了，而且筛了400-500个也没有。还有就是发现不同的筛选方法获得的阳性菌株好像不是很平行，将上述

46、筛到的菌株放大到100ml时就没有了。请教师兄，他说有可能是不同水平发酵溶氧量差别很大，导致酵母生长状态差异，酵母又挺娇气的，差一点也不干活，比较郁闷。不知有没有解决的方法。3. 稀有密码子由于是异源表达，不同宿主之间其密码子的偏好性就有不少的差异，这种差异经常直接导致了异源表达的失败。下面有几个问题，我有一些看法，希望大家能给与指导和帮助。首先，如何确定是否是该问题导致的表达失败。我的一位同学给了我个判断方法的建议，觉得很有道理，和大家分享讨论。他建议我在不同水平简单检测一下表达的情况：基因水平，做个PCR之类的看看是否已成功转入（质粒或整合入宿主）；做个半定量RT-PCR看看mRNA是否转

47、录了；再看看SDS-PAGE是否有蛋白表达。如果根本转化就失败了，没有什么好说的；如果基因进去了但mRNA没有表达，可能需要考虑启动子的问题，换个强启动子或干脆换个质粒；如果mRNA转录了可没有蛋白翻译，那就需要考虑是否是密码子偏好性或mRNA二级结构的问题了。然后进一步查证，需要利用软件或上网查找是否存在这样的二级结构，以及是否含有稀有密码子影响了翻译。在这个问题上我试着查了一些网站，如http:/www.kazusa.or.jp/codon/ ；http:/gcua.schoedl.de/ ；http:/www.genebee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl。等等。但

48、是许多东西看不太懂，理解起来有困难。希望能有软件高手详细介绍一下用法，尤其是能分析自己片断是否含有很多稀有密码子或二级结构等。在此感谢了！接下来就是如果确定有可能是稀有密码子问题如何解决？目前我见到的有两种方法，一是有些宿主比如大肠杆菌的Rosetta，是由BL21改造，整合了含稀有密码子tRNA的片断，使其能顺利表达的新型宿主菌，不知其他种类的宿主是否也有这种商业化的修饰菌；另外就是利用PCR等方法将片断上的稀有密码子改造（突变），换成其他编码同样氨基酸的密码子。当然，还可能干脆就换表达体系了，这一般是大家最不希望的了。 4. 菌种的保存、退化一般来说是加甘油20%左右，-70保存；或制成干

49、粉保存。但是在做甲醇酵母时发现了个问题，就是重组工程菌的退化现象比较严重，一般都是学生做得好好的，但是毕业以后下面的师弟一接手，蛋白就不表达了，或表达量非常的低。连续好几个师兄的结果都是如此，很是奇怪。我猜测可能是由于整合入基因组，毕竟是个外源的基因，不知整合到了染色体的什么部分，会不会过段时间就给“踢”下来，或就沉寂了？E.coli在复苏时都有抗性压着，酵母好像没有太合适的（不知pPICZ系列的那个抗生素好用不好用，但毕竟好贵）。我有个想法，是否也应像公司在做工程细胞时那样，挑个几十上百个，一起传代，10几代后仍然稳定表达的才说明基因整合到了合适的部位，不会再下来了？5. 拷贝数对表达量的影响对于“游离”的质粒，比如E.coli的BL21表达时，质粒的拷贝数是否对表达量有所影响？当然，由于大肠表达最主要的问题经常是表达太高了形成了包涵体，所以说白了应该希望表达量更低点的可能比较多，经常尝试各种方法（低温、低浓度IPTG等等）来降低表达量。那么BL21中的质粒是