糖及其代谢物的测定

1、第八章糖及其代谢物的测定第一节血清 (浆)葡萄糖测定血液中的葡萄糖称为血糖。 血糖测定是临床生化检验中历史最久、 占日常工作量比重较大的项目之一。过去测定血糖多采用全血，但目前多采用血清或血浆。测定血糖的方法很多，可分为三大类：氧化还原法、缩合法及酶法。国际上推荐的参考方法是已糖激酶法，但试剂比较昂贵，不适用于常规分析。我国已淘汰氧化还原法，推荐的方法是葡萄糖氧化酶法，而目前有些基层单位仍沿用邻甲苯胺法。实验 39葡萄糖氧化酶法测定血清（浆）葡萄糖【原理】葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase， GOD)利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase

2、，POD)在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder 反应。红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。【试剂】10.1mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH7.0) 称取无水磷酸氢二钠 8.67g 及无水磷酸二氢钾 5.3g 溶于蒸馏水 800ml 中，用 1mol/L 氢氧化钠 (或 1mol/L 盐酸 )调 pH 至 7.0，用蒸馏水定容至 1L。2酶试剂 称取过氧化物酶 1 200U，葡萄糖氧化酶 1 200U，4-氨基安替比林 10mg，叠氮钠 100mg，溶于磷酸盐缓冲液 80ml 中，用 1 mol/L Na

3、OH 调 pH 至 7.0，用磷酸盐缓冲液定容至 100ml，置 4保存，可稳定 3 个月。3酚溶液称取重蒸馏酚100mg 溶于蒸馏水 100ml 中，用棕色瓶贮存。4酶酚混合试剂酶试剂及酚溶液等量混合，4可以存放 1 个月。512mmol/L 苯甲酸溶液溶解苯甲酸 1.4g 于蒸馏水约 800ml 中，加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至l L 。6100mmol/L 葡萄糖标准贮存液苯甲酸溶液约 70ml 中，以 12mmol/L75mmol/L 葡萄糖标准应用液称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g，溶于 12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h 以后方可使用。吸取葡萄糖标准贮存液5.

4、0ml 放于 100ml 容量瓶中，用12mmol/L 苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。【操作步骤】1自动分析法按仪器说明书的要求进行测定。2手工操作法取试管3 支，按表 8-1 操作。表 8-1葡萄糖氧化酶法测血糖操作步骤加入物 (ml)空白管标准管测定管血清0.02葡萄糖标准应用液0.02蒸馏水0.02酶酚混合试剂3.03.03.0混匀，置 37水浴中，保温15min，在波长 505nm 处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。【计算】血清葡萄糖 (mmol/L)测定管吸光度5标准管吸光度【参考范围】空腹血清葡萄糖为3.896.11mmol/L 。【临床意义】1生理性高血糖可见摄入高糖

5、食物后，或情绪紧张肾上腺分泌增加时。2病理性高血糖(1) 糖尿病：病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。(2) 内分泌腺功能障碍：甲状腺功能亢进，肾上腺皮质功能及髓质功能亢进。引起的各种对抗胰岛素的激素分泌过多也会出现高血糖。注意升高血糖的激素增多引起的高血糖，现已归入特异性糖尿病中。(3) 颅内压增高：颅内压增高刺激血糖中枢，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等。(4) 脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。3生理性低血糖见于饥饿和剧烈运动。4病理性低血糖 (特发性功能性低血糖最多见，依次是药源性、肝源性、胰岛素瘤等)(1) 胰岛 细胞增生或胰岛 细胞瘤等，使胰岛素

6、分泌过多。(2) 对抗胰岛素的激素分泌不足，如垂体前叶功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减少。(3) 严重肝病患者，由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下，肝脏不能有效地调节血糖。【注意事项】1葡萄糖氧化酶对 - D 葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约36%为 型，64%为型。葡萄糖的完全氧化需要型到 型的变旋反应。国外某些商品葡萄糖氧化酶试剂盒含有葡萄糖变旋酶，可加速这一反应，但在终点法中，延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。新配制的葡萄糖标准液主要是 型，故须放置 2h 以上 (最好过夜 )，待变旋平衡后方可应用。2葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量

7、，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。3测定标本以草酸钾氟化钠为抗凝剂的血浆较好。取草酸钾6g，氟化钠 4g。加水溶解至 100ml。吸取 0.1ml 到试管内，在 80以下烤干使用，可使2 3ml 血液在 34 天内不凝固并抑制糖分解。4本法用血量甚微，操作中应直接加标本至试剂中，再吸试剂反复冲洗吸管，以保证结果可靠。5严重黄疽、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。【评价】 线性范围至少可达 22.24mmol/L，回收率 94% 105%，批内 CV 为 0.7%2.0%。批间 CV 为 2%左右，日间

8、CV 为 2% 3%。葡萄糖氧化酶法与己糖激酶法比较， 73 份标本葡萄糖氧化酶法均值为 8.31mmol/L，已糖激酶法均值 8.21mmol/L ，相关系数为 0.9986，回归方程 y=1.0026x2.29。本法测定葡萄糖非常特异， 从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。然而，在本法的测定条件下，溶血标本血红蛋白的浓度达10g/L，黄疽标本胆红素浓度达342 mol /L ，维生素C 小于30mg

9、/L ，均不影响测定结果。氟化钠浓度达2g/L不干扰测定结果。标本中含尿素浓度达46.7mmol/L，尿酸浓度达2.95mmol/L ，肌酐浓度达4.42mmol/L 。半胱氨酸浓度达3.30mmol/L，甘油三酯浓度达5.6mmol/L ，胆固醇 4.40 mmol/L ，对测定结果均无显著影响。左旋多巴 100mg/L，维生素 C 5mg/L 以上，谷胱甘肽100mg/L 时，可引起负误差；半胱氨酸达 10mmol/L 时，产生相当 0.72mmol/L 葡萄糖的正误差。实验 40邻甲苯胺法测定血清（浆）葡萄糖【原理】在热的醋酸溶液中，葡萄糖醛基与邻甲苯胺缩合、脱水，生成希夫氏碱(Schi

10、ffbase)，经分子重排生成蓝绿色化合物，其颜色深浅在一定范围内与血糖浓度成正比。缩合脱水邻甲苯胺葡萄糖葡萄糖基胺希夫氏碱蓝绿色化合物【试剂】10.38mol/L 硼酸溶液称取硼酸 24g，溶于蒸馏水 800ml 中，再用蒸馏水定容至1 000ml，摇匀即可。2邻甲苯胺试剂 称取硫脲 (AR)1.5g，溶于冰醋酸 (AR)700ml 中。将此液转入 1 L 容量瓶内，加邻甲苯胺 60ml，0.38mol/L 硼酸溶液 100ml，用冰醋酸定容至刻度。此溶液应置棕色瓶内室温保存，至少可应用 2 个月。新配制试剂应放置 24h 后待“老化”使用，否则反应产物的吸光度低。3100mmol/L 葡萄

11、糖标准贮存液见实验 39。45mmol/L 葡萄糖标准应用液见实验 39。50.3mol/L 三氯醋酸溶液称取三氯醋酸 5g，溶于蒸馏水 70ml 中，然后用蒸馏水定容至 100ml，混匀即可。【操作步骤】1血清、血浆、脑脊液及清亮的胸腹水按表8-2 操作。表 8-2邻甲苯胺法操作步骤加入物 (ml)蒸馏水葡萄糖标准应用液血清 (血浆、脑脊液 )邻甲苯胺试剂空白管标准管测定管0.10.10.13.03.03.0混匀，置沸水中煮沸5min，取出置冷水中冷却3min ，在 630nm 处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。2严重黄疸、溶血及乳糜样血清制备无蛋白血滤液：取血清0.2ml，加入 0.3

12、mol/L 三氯醋酸溶液 l.8ml ，混匀，静置 5min，离心 5min，取上清液按表8-3 操作。表 8-3溶血、脂浊、黄疸血清操作步骤加入物 (ml)空白管标准管测定管0.3mol/L 三氯醋酸溶液1.00.9葡萄糖标准应用液0.1无蛋白血滤液1.0邻甲苯胺试剂5.05.05.0混匀，置沸水浴中煮沸 12min，取出置自来水中冷却 3min ，在波长 630nm 处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。【计算】血清葡萄糖（ mmol/L ）测定管吸光度5标准管吸管度【参考范围】3.896.11mmol/L 。【临床意义】见实验 39。【注意事项】1邻甲苯胺为浅黄色油状液体，易氧化。配制前

13、宜重蒸馏，收集 199 201的馏出部分，此部分馏出液应为无色或浅黄色， 然后加入盐酸经胺 (1g/L) 防止氧化， 置棕色瓶密封避光保存。2邻甲苯胺在冰醋酸中并不十分稳定，易氧化产生棕色物质而干扰比色，故在邻甲苯胺试剂中加入硫脲，使试剂有抗氧化作用，减少棕色干扰，增加试剂的稳定性，降低空白管的吸光度，并有一定的增色效应。3硼酸与 - 葡萄糖的羟基结合，能促进葡萄糖转变醛式构型，增加反应的活性。4沸水浴时沸水一定要盖过管内的液面，否则温度不均匀，影响显色。5此法受煮沸时间、比色时间、试剂存放时间等因素的影响。一般不宜以校正曲线法进行计算，故每次应同时作标准管。6最终反应液偶尔会产生混浊，最常见

14、原因是高脂血症。此时，可向显色液3ml 中加入异丙醇 1.5ml，充分混匀。溶解脂质可消除混浊，所测吸光度乘以1.5。注射右旋糖酐时，由于右旋糖酐不溶于邻甲苯胺试剂而产生混浊。冷水浴太冷时亦会出现混浊。【评价】1准确度回收率 98.6% 99.6%。葡萄糖标准液在16.65mmol/L 范围以内时，测得值与真值的相关系数为0.9996。与己糖激酶 (HK) 法比较，结果十分相近； y(HK 法)1.03x0.8(mg/dl)。邻甲苯胺法的结果略高于酶法，但差异并不明显。2线性范围可达 30.8mmol/L。3精密度日内 CV2% 左右，日间 CV 不大于 4%。4特异性和干扰邻甲苯胺法较Fol

15、in-Wu 法特异，但不及酶法。D- 甘露糖能以相同的反应速率与邻甲苯胺试剂发生反应，产生与葡萄糖相似的吸收光谱，造成正误差。果糖和戊糖与邻甲苯胺试剂发生反应，分别在375nm 和 480nm 处产生吸收峰。乳糖、麦芽糖和阿拉伯糖也可造成不同程度的干扰。但在正常情况下，血中这些糖含量甚微，对测定结果影响不大。轻度溶血无干扰，但 1g/L Hb 能使结果增高 0.11mmol/L 。胆红素 171mol/L 无影响。浓度达 342mol/L 时测定结果偏高为 1.39mmol/L 。重度脂血可使反应产生混浊，向最终反应液加异丙醇可消除。实验 41己糖激酶法测定血清（浆）葡萄糖【原理】 葡萄糖和三

16、磷酸腺苷 (ATP)在己糖激酶 (hexokinase，HK) 催化下，发生磷酸化反应，生成葡萄糖 -6-磷酸 (G-6-P)与二磷酸腺苷 (ADP) 。G-6-P 在葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶 (G-6-PD) 的催化下脱氢，生成 6-磷酸葡萄糖酸 (6-PGA) ，同时使 NADP +还原成 NADPH H+，还原型 NADPH 的生成速度与葡萄糖浓度成正比，在波长 340nm 监测吸光度升高速率，可计算血清中葡萄糖浓度。【试剂】l 酶混合试剂己糖激酶测定葡萄糖，多用试剂盒，目前国外生产试剂盒的厂家很多，但酶混合试剂的配方大同小异。酶混合试剂的组成成分与浓度如下：三乙醇胺盐酸缓冲液(pH7.

17、5)50mmol/LMgSO42mmol/LATP2mmol/LNADP2mmol/LHK 1 500U/LG-6-PD2 500U/L根据试剂盒说明书配制，保存于4冰箱。2100mmol/L葡萄糖标准贮存液见实验39。35mmol/L 葡萄糖标准应用液见实验 39【操作】1速率法使用自动分析仪器。仪器的操作程序，测定的主要参数(如系数、延迟时间、监测时间及次数、波长、被测样品和试剂用量、温度等)须按说明书进行。2终点测定法(1) 按表 8-4 加入样品及试剂：表 8-4 己糖激酶法操作步骤加入物 (ml)空白管标准管对照管测定管血清0.020.02葡萄糖标准应用液0.02生理盐水0.022.

18、0酶混合试剂2.02.02.0(2) 以上各管充分混合， 在 37水浴， 准确放置 10min，用蒸馏水调零， 用 5mm 径比色皿，在 340nm 波长处读取各管吸光度。【计算】1速率法测定管A / min空白管A / min系数葡萄糖（ mmol/L ）A / min空白管A / min标准管空白管以蒸馏水代替血清。葡萄糖（ mmol/L )A测定 A对照 A空白5A标准A空白2终点法【参考范围】3.896.11mmol/L( 空腹 )。【临床意义】见实验 39。【注意事项】1HK 是关键的工具酶，必须使用高纯度产品，其比活性应140 IU/mg 酶蛋白 (25)。杂酶 G-6-DP、谷胱

19、甘肽还原酶、 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶均应0.01%HK 活性单位，磷酸葡萄糖异构酶 0.02%HK 活性单位。 HK 的最适 pH6.0 9.0， pI 为 4.5 4.8。 Mg2+为 HK 的激活剂， EDTA 为抑制剂。2G-6-PD 亦是关键的工具酶，其纯度要求高，比活性应140 IU/mg 酶蛋白 (25)。杂酶磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶均应0.01% G-6-PD 活性单位，谷胱甘肽还原酶和磷酸葡萄糖异构酶均应0.02% G-6-PD 活性单位。以 NADP +为辅酶的最适 pH8.5，以NAD +为辅酶的最适 pH 为 7.8。3NAD +或 NADP +的纯度要求

20、达 98%以上。4对整个试剂的要求(1) 试剂空白在保温 30min 时吸光度小于 0.1，保温 6min 与 30min 间吸光度变化 0.01。(2) 33.3mmol/L 葡萄糖标准液在保温 30min 后的吸光度在 1.6 1.8 之间，保温 8min 与30min 吸光度之差 0.01。5如用耐热的葡萄糖激酶代替HK ，即可提高专一性，又可提高稳定性。【评价】1线性范围可达 33.31mmol/L，最高达 40.8mmol/L 。2准确度回收率99.4%101.6%，平均为100.5%(样品含量为2.22、486、8.34mmol/L) 。3精密度日内CV为 0.6%1.0%，日间C

21、V为1.3%左右。4方法学比较与质谱法比较， y=1.02x 0.5。与 GOD-POD 法比较， r=0.998，y=1.01x 0.190。5特异性和干扰HK 法最大优点是特异性相当高，干扰少。HK 对 D葡萄糖、 D-甘露糖、 D-果糖、 D-葡糖胺均有催化作用，来源于牛脑和酵母的HK 的最适底物是 D-甘露糖和 D-葡萄糖。但 G-6-PD 的最适底物是 G-6-P，对 G-6-P 具有高度专一性，对 6-磷酸果糖和 6-磷酸甘露糖不起作用，因此 HK 法的特异性很强。轻度溶血、脂血、黄疽、维生素C、氟化钠、肝素、 D-甘露糖、草酸盐、谷胱甘肽及某些药物如左旋多巴、肼苯哒嗪等均无干扰。

22、严重溶血 (Hb 2 5.12g/L)致使红细胞内有机磷酸酯及一些酶类释放，消耗NADP +，可使葡萄糖测定值下降6.6%32%。第二节血清 (浆)糖化蛋白的测定葡萄糖可以和体内多种蛋白质中的氨基不可逆地以共价键结合，这个过程不需要酶的参与，反应速度主要取决于葡萄糖的浓度。这种被葡萄糖糖化的蛋白主要存在于糖尿病或其他高血糖患者中，糖化过程经常缓慢地进行，一旦形成，不再解离。故对血糖或尿糖波动较大的患者来说，采用糖化蛋白来诊断或追踪病情的发展有其独特的临床意义，它可以反映较长时期以来的平均血糖浓度。临床上测定的糖化蛋白主要有糖化血红蛋白(glycohemoglubin，GHb)和糖化血清蛋白 (

23、glycated serum protein，GSP)。测定糖化蛋白的方法有比色法、电泳法、等电聚焦法、离子交换层析法、高效液相层析法、亲和层析法、免疫化学法、毛细管电泳法等。国内以比色法、离子交换层析法及电泳法较常用。实验 42微柱法分离糖化血红蛋白【原理】 带负电荷的 Bio-Rex 70 阳离子交换树脂与带正电荷的HbA 及 HbA 1 有亲和力，但由于 HbA 1 的两个 链 N-末端正电荷被糖基清除， 正电荷较 HbA 少，二者对树脂的亲和力不同。用 pH6.7 磷酸盐缓冲液可首先将带正电荷较少、吸附力较弱的HbA 1 洗脱下来，用分光光度计测定洗脱液中的 HbA 1 占总 Hb 的

24、百分数。【试剂】10.2mol/L 磷酸氢二钠溶液称取无水 Na2HPO428.369g，溶于蒸馏水中并定容至1L。20.2mol/L 磷酸二氢钠溶液24·2H2，溶于蒸馏水中并定容至1L。称取 NaH POO 31.206g3溶血剂取 0.2mol/L 磷酸二氢钠 25ml，加 Triton X-100 100mg ，加蒸馏水定容至 100ml。4磷酸盐缓冲液 (pH6.7)取 0.2mol/L 磷酸氢二钠 100ml，0.2mol/L 磷酸二氢钠 150ml，加蒸馏水定容至1 L。5磷酸盐缓冲液 (pH6.4)取 0.2mol/L 磷酸氢二钠 300ml，0.2mol/L加蒸馏水

25、 300ml，混匀即成。6Bio-Rex 70 阳离子交换树脂200400 目，钠型，分析纯级。磷酸二氢钠700ml，【操作】1树脂处理 称取树脂 10g，加 0.1mol/L 氢氧化钠溶液 30ml，搅匀，置室温 30min，间常搅拌 23 次。然后加浓盐酸数滴，调至 pH6.7，弃去上清液。用蒸馏水约 50ml 洗 1 次，用磷酸盐缓冲液 (pH6.4)洗 2 次，再用磷酸盐缓冲液 (pH6.7)洗 4 次即可。2装柱将树脂加磷酸盐缓冲液 (pH6.7)搅匀，用毛细滴管加入塑料微柱内，使树脂床高度达 3 4cm 即可，树脂床应均匀，无气泡无断层即可。3血红蛋白溶液的制备取 EDTA 抗凝血

26、或毛细管血20l ，加入生理盐水2.0ml 中摇匀，离心弃上清液，仅留下细胞。加溶血剂0.3ml，摇匀，置 37水浴中 15min，以除去不稳定的 HbA 1。4柱的准备将微柱摇动使树脂混悬，然后去掉上下盖，将柱插入1.5cm×15cm 的试管中，让柱内缓冲液完全流出。5上样用微量加样器取血红蛋白溶液100 l，加至微柱内树脂床上，待其完全进入树脂床后，将柱移入另一支1.5cm×15cm 的试管中。6洗脱取磷酸盐缓冲液 (pH6.7)3ml 缓缓加至树脂床上， 注意勿冲动树脂。 收集洗脱液，此即为 HbA 1(测定 )。7对照取上述血红蛋白溶液50l，加蒸馏水 7.5ml，

27、摇匀，此即为总Hb 管。8比色以蒸馏水作空白，于415nm 波长测定各管吸光度。9柱的清洗用过的柱先加磷酸盐缓冲液(pH6.4)3ml，使 Hb 全部洗下、再用磷酸盐缓冲液 (pH6.7)洗 3 次，每次 3ml。最后加磷酸盐缓冲液 (pH6.7) 3ml，加上下盖，保存备用。【计算】测定管吸光度100%HbA 1%对照管吸光度5【参考范围】HbA 1： 6.59%0.69%。【临床意义】 糖化血红蛋白测定用于评定糖尿病的控制程度，当糖尿病控制不佳时，糖化血红蛋白浓度可高至正常 2 倍以上。因为糖化血红蛋白是血红蛋白生成后与糖类经非酶促结合而成的。它的合成过程是缓慢的，而且是相对不可逆的，持续

28、于红细胞 120 天生命期中，其合成速率与红细胞所处环境中糖的浓度成正比。因此，糖化血红蛋白所占比率能反映测定前 12 个月内平均血糖水平，现已成为反映糖尿病较长时间血糖控制水平的良好指标。【注意事项】1层析时一般在28较为适宜，冬季应将柱置于28温箱中洗脱。2HbA 1 不能和 HbF、HbH 及 Hb Barts分开，有前述异常血红蛋白病者不宜用此方法。3标本置室温超过24h 可使结果增高，贮4冰箱可稳定5 天。4抗凝剂 EDTA 和氧化物不影响结果，肝素可使结果增高。实验 43果糖胺法测定糖化血清蛋白【原理】血清蛋白质分子中的末端氨基能与葡萄糖经非酶促反应生成高分子酮胺结构。其生成量直接

29、与血糖浓度有关，并且和糖化血红蛋白高度相关。在碱性溶液中，这种酮胺结构与硝基四氮唑蓝 (NBT) 发生还原反应，产生紫红色甲臢然后以具有同样氨基-1-脱氧 -2-酮糖结构的 1-脱氧 -1-吗啉果糖 (DMF) 为标准同时操作，作比色测定。【试剂】10.1mol/L 碳酸盐缓冲液 (pH10.8)无水碳酸钠 9.54g，碳酸氢钠 0.84g，溶于蒸馏水并定容至 1 000ml。20.11mmol/L NBT 试剂称取氯化硝基四氮唑蓝1 000ml。置冰箱保存，至少可稳定3 个月。100mg，用上述缓冲液溶解并定容至340g/L 牛血清白蛋白溶液。44mmol/L DMF 标准液称取 DMF 9

30、9.6mg，溶于 40g/L 牛血清白蛋白溶液100ml 中。【操作】1样本的测定按表8-5 操作。2表 8-5血清 (血浆 ) DMF 测定步骤加入物 (ml)空白管待测管血清(血浆)0.1蒸馏水0.1NBT(37 预温 )4.04.0混匀，置 37水浴中 15min，取出试管在流水中冷却15min(25)，于 550nm 波长处空白管调零，读取测定管吸光度，从校正曲线上查出DMF 浓度。2校正曲线制备取 4mmol/L DMF 标准液用牛血清白蛋白溶液 (40g/L) 稀释成 1、2、3、4mmol/L ，并以 40g/L牛血清白蛋白为空白，与测定管同样操作，读得各浓度DMF 相应的吸光度

31、。以DMF 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制成校正曲线。糖化血清蛋白浓度在4mmol/L 内与吸光度呈线性关系。【参考范围】1.90.25mmol/L DMF 。【临床意义】1血清蛋白半寿期较短 (血清白蛋白 17 天，总蛋白 30 天，Hb 为 120 天 )，本试验可有效地反映患者过去12 周内的血糖控制水平。2本试验不受临时血糖浓度波动的影响，对糖尿病人的诊断和较长时间血糖控制水平的观察，以及同一患者前后连续检测结果的比较具有一定的价值。【注意事项】1必须严格控制pH 值、反应温度及反应时间。237加温 15min 时间需正确掌握并立即冷却，否则颜色将继续加深影响结果。所以在测定时宜加测

32、已知浓度DMF 的质控管，以观察与校正曲线的符合程度。有人认为改用加入10%乙酸 0.1ml，比用物理冷却终止效果更佳，可使pH 降至 7.0 以下而有效地终止反应。3DMF 的合成方法称取无水 D-葡萄糖 90g(0.5mol)，吗啡啉 58g(0.67mol)，加蒸馏水1 L，溶解后在 6070水浴上搅拌，开始为黄色糊状物，后颜色逐渐加深。20min 后，移去水浴，缓慢地加入丙二酸18g(0.17mol)。整个加入过程需在10min 以上。再置水浴并使温度上升至 80，不断搅拌，颜色逐渐由黄绿色转变为琥珀色。 10min 后，加入无水乙醇 70ml，维持 7530min，再加入丙酮 70m

33、l。此时可见到结晶析出，此即为 DMF 。放 4冰箱过夜，收集结晶，并用无水乙醇重结晶 3 次，使产物脱色纯化，干燥备用。熔点 146147，分子式 C10H19O6N，分子量 249。4另外现已有酮化氨基酸氧化酶法，该法的准确度和精密度优于果糖胺法。第三节血液其他糖类及糖代谢产物的测定实验 44半乳糖氧化酶法测定半乳糖【原理】在半乳糖氧化酶催化下半乳糖被氧化生成半乳已二醛糖(galactohexodialdose)和过氧化氢。过氧化氢由偶联的过氧化物酶催化释放出氧，使色原性氧受体(邻联茴香胺 )被氧化而呈色。【试剂】10.02mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH7.6)称取磷酸二氢钾1.06g

34、和磷酸氢二钠 1.74g，溶解于蒸馏水 950ml 中，调 pH 至 7.0，然后加蒸馏定容至1 000ml。2半乳糖氧化酶溶液称取半乳糖氧化酶干粉约1mg(相当于 30U)置于乳钵中，加缓冲液研磨助溶，最后加缓冲液至50ml，过滤。此液可在冰箱保存数天。3显色剂将 POD 干粉 10mg(相当于 90U)溶解于缓冲液500ml 中，加入 1%邻联茴香胺甲醇溶液 5ml，置冰箱保存。如溶液颜色变深，空白管吸光度增高则应弃去，重配新液。430%(V/V) 硫酸溶液小心加浓硫酸 300ml 于蒸馏水 700ml 中。硫酸锌溶液4·7H2，用蒸馏水溶解并定容至5 0.175mol/L称取结

35、晶硫酸锌 (ZnSOO)50g1 000ml。60.15mol/L 氢氧化钡溶液 称取氢氧化钡 Ba(OH) 2· 8H2O47g，溶于新蒸馏或刚煮沸的去离子水中，然后定容至 1 000ml。如溶液出现混浊，则将瓶口塞紧，在室温中放置数日，取上清液应用。氢氧化钡能吸收空气中的二氧化碳生成碳酸钡沉淀，故应避免与空气接触。756mmol/L半乳糖标准贮存液称取D()半乳糖1 g，溶解于蒸馏水并定容至100ml。811.2mmol/L半乳糖标准应用液取贮存液2ml用蒸馏水稀释至100ml。【操作步骤】1取蒸馏水 0.5ml、血清 0.1ml、 0.15mol/L 氢氧化钡 0.2ml，混匀

36、，加 0.175mol/L 硫酸锌 0.2ml，混匀， 4 000r/min 离心 5min，制成 1/10 的去蛋白滤液。3按表 8-6 加入试剂。4表 8-6半乳糖酶法测定半乳糖步骤加入物 (ml)空白管标准管测定管显色剂1.01.01.0半乳糖氧化酶试剂1.01.01.0去蛋白血滤液0.5标准应用液0.5蒸馏水0.5混匀， 37水浴，30min30%硫酸溶液2.52.52.5混匀，用空白管调零，在波长530nm 处读取各管吸光度。【计算】测定管吸光度11.2 10血半乳糖浓度 (mmol/L ）标准管吸光度【参考范围】成人：0 mmol/L ；儿童：1.1mmol/L 。 正常人耐量指数

37、不超过 8.9mmol/L 。【临床意义】正常成人血液及尿中不合或仅有微量半乳糖。哺乳期妇女及新生儿血液及尿中有时可有少量半乳糖。先天性半乳糖代谢障碍的患者血液及尿中可出现半乳糖。临床上测定血液半乳糖多用在作半乳糖耐量试验。正常人耐量指数不超过8.9mmol/L ，肝脏病患者半乳糖耐量指数增加，传染性肝炎及中毒性肝炎，耐量指数可升高至28 33mmol/L ，随病情好转耐量指数亦降低。肝硬化患者耐量指数可为16.2 22.2mmol/L 或更高。甲状腺功能亢进时半乳糖指数亦可增高。【注意事项】1口服半乳糖耐量试验的具体操作步骤 受试者经一夜禁食后， 次晨取空腹血测定半乳糖作试前空白对照。然后口

38、服半乳糖 40g(溶于 250ml 水中 )。服糖后 30min、1 h 及 2h 分别取血测定半乳糖浓度。 Maclagan 提出判断结果的标准是将各次测定结果的总和作为一个指数。正常人耐量指数不超过 8.9mmol/L 。2过氧化物酶催化的反应易受巯基化合物、尿酸、维生素C 及其他含氧化色素的物质干扰，在本法中用碱性去蛋白的方法可去除这些干扰物质，而用酸性去蛋白则巯基化合物、尿酸不能被破坏。3半乳糖氧化酶还能氧化含半乳糖的寡糖和糖蛋白，且反应速率比氧化半乳糖还高。但在大多数体液中这类成分很少发现，因此可认为本测定的专一性是很好的。实验 45比色法测定全血乳酸【原理】将血液除去蛋白质后于无蛋

39、白上清液中加入硫酸铜和氢氧化钙，以除去葡萄糖和其他干扰物质。取经处理过的溶液同硫酸一起加热，使乳酸氧化成乙醛，后者与对 -羟基联苯作用产生紫色缩合产物。其紫色缩合产物生成量与血液中乳酸浓度有关。将标准与样品同样处理，可求出血液中乳酸含量。在有铜离子存在时，可使颜色反应的强度增强。【试剂】1三氯醋酸贮存液 称取三氯醋酸结晶 100g，加少量蒸馏水使溶解，再加蒸馏水定容至 100ml，贮于磨口瓶中，可长期保存。2三氯醋酸应用液取三氯醋酸贮存液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，每周新鲜配制。3200g/L 硫酸铜溶液称取硫酸铜结晶 (CuSO4·5H2O)20g，溶于蒸馏水中，用蒸馏水定

40、容至 100ml。440g/L 硫酸铜溶液取 200g/L 硫酸铜溶液 20ml，用蒸馏水定容至100ml。5氢氧化钙粉末 (AR) 。6浓硫酸 (AR ，无铁 )应用滴定管加注，滴定管上应装有吸潮装置，同时，滴定管的活塞不应含有任何润滑油，可用少量浓硫酸润滑。对羟基联苯试剂在 250ml烧杯中加入对-羟基联苯6 5·C64，加2.5mol/L7-(C HH OH)1.5g氢氧化钠溶液 5ml 和蒸馏水 10ml，稍微加热。不断搅拌，直至完全溶解，然后加蒸馏水稀释定容至 100ml，贮存于棕色瓶中置室温可稳定6 个月。当试剂空白的吸光度增加很多时，此试剂应弃去。81mmol/L 乳酸

41、标准液 精确称取 L- 乳酸锂 9.6mg 或 DL- 乳酸锂 19.2mg，以少量蒸馏水溶解，加浓硫酸 25l，用蒸馏水定容至 100ml。4可长期保存。【操作步骤】1血样乳酸浓度的测定(1) 取有塞 15ml 离心管 2 支，分别标明测定和试剂空白，每管各加入三氯醋酸应用液4.5ml，于测定管中逐滴加入血液0.5ml，边加边摇，加塞用力振摇30s。于试剂空白管中加入蒸馏水 0.5ml，塞好，混匀。(2) 于室温放置 5min 后， 5 000r/min 离心 3min(不能过滤 )。(3) 分别取上述两管上清液 2ml 放入相应标记的 15ml 有塞离心管中，各加 200g/L 硫酸铜溶液

42、 1ml，混匀。加蒸馏水定容至 10ml，加塞，混匀。加氢氧化钙粉末约 1 g，加塞，用力振摇 30s，如果混合物不带亮蓝色，则应多加一些氢氧化钙。(4) 在室温放置 30min，每隔 10min 振摇一次。然后 5 000r/min 离心 5min(不能过滤 )。(5) 分别吸取上清液 1 ml 放入相应标记的 18mm×150mm 的试管中，上清液中不能混有任何微小颗粒。每管各加 40g/L 硫酸铜溶液 0.05ml，混匀，在不断振摇的情况下各加浓硫酸8ml ，用力振摇以充分混匀。(6) 将试管置沸水中加热 5min，然后取出在流动自来水中冷却至 20左右， 加入对 -羟基联苯液

43、 0.1 ml，注意应使试剂直接加入酸中 (勿沿管壁 )，同时应用力振摇以混匀沉淀物。将试管置 30水浴中至少 30min，每 10min 应振摇试管一次，使沉淀的试剂再分散，溶液应显紫蓝色。此时如显红紫色表明温度太高，必须重作。(7) 放入沸水浴中准确 90s，此时溶液应完全清澈，显红紫色。取出，在流动自来水中冷却到室温。(8) 以试剂空白管调零，在 565nm 波长下测得样品管的吸光度，查校正曲线，可求出血样中乳酸的含量。2校正曲线的制备(1) 取 6 个 10 ml 容量瓶分别加入 1 mmol/L 乳酸标准液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml。用蒸馏水定容至 10m

44、l 刻度，混匀。(2) 取 6 支 15ml 有塞离心管，分别加入上述标准液 1ml，各加 200g/L 硫酸铜溶液 1 ml，混匀。加蒸馏水定容至 10ml 刻度，加塞，混匀，加氢氧化钙粉末约 1g，加塞，用力振摇 30s。(3) 以下按照上述第 (4)(8)步骤操作。(4) 以乳酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制校正曲线。其浓度分别相当于全血乳酸 0、1、2、3、4、5mmol/L 。【参考范围】静脉全血乳酸含量为0.552.2 mmol/L (在安静状态时 )。【临床意义】1当剧烈运动时血液乳酸可达11.0 mmol/L 以上，恢复时将迅速降低。2在病理情况下，血乳酸可上升为2 26m

45、mol/L ，血中增高的乳酸取代碳酸氢盐，通常在血乳酸超过 7mmol/L 时，临床上出现乳酸性酸中毒。不论由于情绪或呼吸障碍引起的低血氧，血中乳酸增加比丙酮酸明显。运动、严重贫血、急性喘息、抽搐后可使血乳酸中度增加。休克、周围循环衰竭、分流手术和心脏停搏时血乳酸明显增高。3糖尿病酮症酸中毒昏迷时，血乳酸增高，但一般不超过7mmol/L ，而在非酮性糖尿病酸中毒患者，血乳酸可明显增高，特别多见于口服降糖灵治疗的患者。4严重肝脏病时，可引起血乳酸增加，尿毒症患者亦常伴有乳酸酸中毒。【注意事项】1应强调在安静状态时抽血并尽快送检。当收到血液标本后， 立即制备无蛋白血上清液。2应采用含氟化钠的抗凝剂

46、可防止血液标本在放置期间葡萄糖酵解转变成乳酸。3必须用有玻璃塞的试管进行混合或振摇。4加氢氧化钙时可用一个约1 g 容量的药匙加，不必准确称量。5本测定所用硫酸应预先用乳酸标准液按测定操作进行试验，如显色能达到要求，可作乳酸测定专用试剂；如显色极淡，应另选合适的硫酸。6当温度超过35时对 -羟基联苯在硫酸中很快消失，故在加入此试剂前应将试管充分冷却。对 -羟基联苯溶液与酸接触时即产生沉淀，故应滴加在液面上并立即摇匀，使沉淀物分散成小颗粒，在30min放置期间，应不时摇动试管，使颗粒渐渐消散，最后加热90s，使颗粒完全消失，液体呈透明。加热时间应控制在12min之间，显色后颜色稳定, 1 h 时

47、内无变化， 3 h 约降低5%。7该法准确精密而特异，但操作麻烦和费时。此外还有血浆乳酸测定的氧化酶法，该法无需制备无蛋白滤液，且在 550nm 检测，故可手工操作，也可自动化分析。实验 46乳酸脱氢酶法测定全血乳酸【原理】乳酸在乳酸脱氢酶 (LD) 催化下脱氢生成丙酮酸，氧化型还原型 NADH 。加入硫酸肼可捕获丙酮酸促进反应完成。生成的NADH于 340nm 波长测定 NADH 的吸光度，可计算出血液中乳酸含量。NAD +接受氢转变成与乳酸为等量摩尔，【试剂】130g/L 偏磷酸 (MPA)用少量蒸馏水溶解MPA 3.0g，并定容至 100ml，新鲜配制。250g/L 偏磷酸 (MPA)用

48、少量蒸馏水溶解MPA 5.0g，并定容至 100ml，新鲜配制。3Tris-硫酸肼缓冲液 (pH9.6)称取 Tris 4.79g，硫酸肼 26g，EDTA-Na2 0.93g，加至 1mol/L氢氧化钠溶液 350ml 中调 pH 至 9.6，再用蒸馏水定容至500ml，4保存可稳定 8 天。+427mmol/L(20mg/ml) NAD溶液按需要量用蒸馏水配制，4保存可稳定 48h。5 LD 溶液取 LD 原液，用生理盐水稀释成1 500U/ml。61mmol/L 乳酸标准液精确称取 L- 乳酸锂 9.6mg(或 DL- 乳酸锂 19.2mg)，以少量蒸馏水溶解，加入浓硫酸25 l，用蒸馏水定容至100ml，4保存可长期稳定。【操作步骤】按表 8-7 加入试剂。表 8-7全血乳酸酶法测定操作步骤加入物 (ml)空白管标准管测定管Tris-硫酸肼缓冲液2.002.002.00偏磷酸溶液 (30g/L)0.10乳酸标准液0.10无蛋白上清液0.10混匀LD 溶液0.030.030.03NAD +溶液0.200.200.20混匀，置室温 15min 后，于 340nm 波长处，以空白管调零，读取各管吸光度。【计算】乳酸 (mmol/L)测定管吸光度1.0 D标准管吸光度D 为稀释因子，见注意事项。也可根