暗色丝孢真菌分类研究

1、真菌分类学研究导师：蔡玉梅作者：王金叶暗色丝孢真菌分类研究暗色丝孢真菌分类研究目录目录一、研究内容一、研究内容三、技术路线三、技术路线四、暗色丝孢真菌鉴定方法四、暗色丝孢真菌鉴定方法五、实验方法五、实验方法二、研究背景二、研究背景六、研究意义六、研究意义一、研究内容一、研究内容丝孢菌纲丝孢菌纲鞭毛菌亚门鞭毛菌亚门接合菌亚门接合菌亚门子囊菌亚门子囊菌亚门担子菌亚门担子菌亚门半知菌亚门半知菌亚门粘菌门粘菌门真菌门真菌门真菌界真菌界腔孢菌纲腔孢菌纲暗色丝孢真菌暗色丝孢真菌( (DematiaceousDematiaceous hyphomyceteshyphomycetes) )是无性丝孢真菌是无性

2、丝孢真菌( (HyphomycetesHyphomycetes) )的重要类群。该类群真菌的菌丝、分生孢子梗或分生孢子具的重要类群。该类群真菌的菌丝、分生孢子梗或分生孢子具色泽，并在分生孢子座或者梗上产生分生孢子。色泽，并在分生孢子座或者梗上产生分生孢子。作为一种腐生真菌，可在各作为一种腐生真菌，可在各种自然基质上完成生活史，如植物种自然基质上完成生活史，如植物、昆虫以及一些其他真菌。昆虫以及一些其他真菌。二、研究背景二、研究背景u 全世界已承认丝孢真菌1500余属（Shifert et al.，2011；Shifert & Gams，2011），其中暗色丝孢真菌约占650余属。资料统

3、计约25%-35%的暗色丝孢真菌属种来源于凋落枯枝基质，约100多个属的多数种直接来源于凋落枯枝基质。u 中国菌物种数估计约18万种以上，中国目前已发现菌物约1.48万种，其中暗色丝孢真菌约占1/3。我国南方凋落枯枝资源丰富，巨大的真菌资源有待进一步发掘及研究利用。真菌的自然分类系统主要以有性生殖器官有性生殖器官和有性孢子有性孢子为依据，但丝孢但丝孢真菌（传统概念的半知菌）以有丝分裂的方式产生分生孢子，不具备有性真菌（传统概念的半知菌）以有丝分裂的方式产生分生孢子，不具备有性生殖的特点。生殖的特点。丝孢真菌在自然界分布广泛，种类繁多，约占全部已知真菌的30%左右，为研究和应用方便，该类群被提出

4、作为一相对独立的大类群。早期，无性丝孢真菌分类特征极不统一，许多真菌学家所持分类观点不尽一致，如Costantin(1888)主张以分生孢子在产孢梗上着生特点为分类依据；Vuillemin(1910)注意到产孢方式的动态特点并据此区分分生孢子的类型；Hughes(1953)提出以分生孢子的形成方式和产孢梗延伸方式为丝孢真菌的分类依据等。Holubova-Jechova(1990)总结前人研究结果概括讨论了无性丝孢真菌的分类标准。暗色丝孢真菌分类标准暗色丝孢真菌分类标准在多年分类研究基础上，继承前人分类观点，较系统地概括了凋落枯枝暗色丝孢真菌属、种级划分标准：I.对于以腐生为主的凋落枯枝暗色丝孢

5、真菌，应以自然基质上的形态特征为主要鉴别依据；对于单孢分离可培养的，其培养条件下的特征和产孢表型可作必要补充；II. 以载孢体的类型、产孢细胞的延伸方式载孢体的类型、产孢细胞的延伸方式及孢子形成方式孢子形成方式为属级分类属级分类的主要依据；产孢位点产孢位点特征、分生孢子脱落方式分生孢子脱落方式（裂解式/破生式）及其突出形态属级鉴别标准；产孢梗的分枝类型、产孢细胞形状、刚毛及子座有无等特征对少数属的划分具一定参考价值；暗色丝孢真菌分类标准暗色丝孢真菌分类标准III. 分生孢子的形状、大小、隔膜、色泽、孢壁纹饰形状、大小、隔膜、色泽、孢壁纹饰及附属附属部件特征等是分分种种的主要依据。在近似种间，共

6、同的、突出的分生孢子形态特征对属的划分也有意义。分生孢子隔膜的有无，形成的顺序和位置，在不同种间，有时甚至在不同属间有稳定的差异，也可作为分种（属）的标准之一；IV. 在种级种级分类标准中，分生孢子的形状、大小和隔膜形状、大小和隔膜视为主要标准，分生孢子附属物及色素沉积等则通常视为次要标准。三、技术路线三、技术路线 形态学分类法形态学分类法数值分类法生物化学方法四、暗色丝孢真菌鉴定方法四、暗色丝孢真菌鉴定方法分子生物学分类方法生物化学方法生物化学方法A. 可溶性蛋白质及同工酶凝胶电泳技术B. 次生代谢产物分析C. 胞壁组分分析分子生物学分类方法分子生物学分类方法A. 真菌DNA碱基组成B. 分

7、子杂交技术C. 随机扩增多态性DNA（RAPD）分析D. 线粒体DNA酶切片段多态性（RFLP）分析形态学分类法主要根据种菌的菌落、分生孢子梗、产孢细胞以主要根据种菌的菌落、分生孢子梗、产孢细胞以及分生孢子的形态特征和产孢方式进行鉴定。依据及分生孢子的形态特征和产孢方式进行鉴定。依据凋凋落枯枝暗色丝孢真菌属、种级划分标准对目的种菌进落枯枝暗色丝孢真菌属、种级划分标准对目的种菌进行分类，确定其属、种。行分类，确定其属、种。暗色丝孢真菌的属级、种级分类标准自然状态下的形态特征为最主要的鉴定依据。载孢体的类型、分生孢子的产孢方式以及产孢细胞的延伸方式。分生孢子的脱落形式及其隔膜的真假。分生孢子的形态

8、、颜色、大小、是否具有附属物及表面纹饰、隔膜数量等。1234载孢体的类型载孢体的类型(1) 分生孢子梗分生孢子梗：由菌丝特化形成的、其上着生分生孢子的一种丝状结构。：由菌丝特化形成的、其上着生分生孢子的一种丝状结构。载孢体：载孢体：由菌丝特化而用于承载分生孢子的特殊结构。(2) 分生孢子器分生孢子器(pycnidium)：是一个球形或瓶形的结构，在器内壁四周表面或底部生有极短的分生孢子梗，梗上产生分生孢子(A)。(3) 分生孢子座分生孢子座(sporodochium)：许多分生孢子梗紧密聚集成簇，形成垫状，分生孢子着生于每个梗的顶端。这种结构称为分生孢子座(B)。(4) 孢梗束孢梗束(synn

9、ema)：分生孢子梗的基部联合成束状，束丝顶端分开而且常具分枝，分生孢子着生在无数分枝的顶端。此称孢梗束(C)。(5) 分生孢子盘分生孢子盘(acervulus)：在寄主的角质层或表皮下，分生孢子梗簇生在一起而形成的盘状或扁平状的结构。其中夹杂有或没有刚毛。分生孢子梗自薄而平展或厚而垫状的拟薄壁组织上面形成(D)。分生孢子的形成方式分生孢子的形成方式 按分生孢子个体发育的基本形式，其形成方式分为：1）体生式分生孢子）体生式分生孢子 2）芽生式分生孢子）芽生式分生孢子由产孢细胞以芽殖芽殖的方式产生，产孢细胞的某一部分向外凸起并生长膨大形成分生孢子。又分为：全壁芽生式全壁芽生式分分生孢子生孢子内壁

10、芽生式内壁芽生式分生孢子分生孢子分生孢子的形成是由原来菌丝的顶端菌丝的顶端形成隔膜而断裂。又分为：全壁体生式节全壁体生式节孢子孢子内壁体生式内壁体生式节孢子节孢子。分生孢子分生孢子的发育类的发育类型型产孢细胞的产孢方式产孢细胞的产孢方式（芽殖）（芽殖）合轴式环痕式芽生式孔生式瓶梗式分生孢子的形态分生孢子的形态分生孢子的形态变化很大，可以分为单胞、单胞、双胞、多胞、双胞、多胞、砖隔状、线状、砖隔状、线状、螺旋状、星状螺旋状、星状这七种基本类型。分生孢子的脱落方式分生孢子的脱落方式裂解式脱落破生式脱落隔膜类型隔膜类型假隔膜假隔膜真隔膜真隔膜四、实验方法四、实验方法1、实验材料、仪器与试剂2、标本采

11、集3、标本处理与玻片制作4、种菌形态学观察、描述与鉴定5、种菌保藏1、实验材料、仪器与试剂1）培养基）培养基常用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）成分：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，主要用于真菌的单孢分离培养及菌种保存。2）仪器）仪器OLYMPUS BX53生物显微镜，OLYMPUS SZX10体视镜Nikon YS100显微镜，RXZ型智能人工气候箱SPX智能型生化培养箱，DHP-9052型电热恒温培养箱3）试剂）试剂25%乳酸溶液，乳酚油，中性树胶2、标本采集 采集时期：采集时期：初春和初秋（3-5月、9-10月） 采集地点：采集地点：代表性的生态地理及植被的

12、区域，如原始森林、热带雨林、自然保护区等。 采集标本采集标本：表层具分生孢子体的凋落枯枝。将采集到的标本置于采集袋中，贴标签密封。 注意注意：a.采集应全方面采集，注重对不同生境地区的采集，注意对多年积累厚实凋落枯枝层的重采集。b.采集完毕标本带回实验室后及时处理，尽量1-3月内完成。3、标本处理与玻片制作 标本室内处理：标本室内处理：将枯枝标本剪成适当大小，进行保湿培养。 种菌玻片制作种菌玻片制作：a.a. 挑孢挑孢：将标本置于体视镜下进行观察，发现目标菌落之后，利用挑针挑取发育完整的个体，制成玻片。b.b. 烘烤烘烤：在55C下烘烤2-3d，每个菌种至少制备2-3个玻片。c.c. 封片封片

13、：烘烤完毕后，用中性树胶对其进行封胶处理，制成永久玻片。 种菌分离纯化种菌分离纯化：枯枝表层单孢挑取法；琼胶平板稀释纯化法；琼胶平板单孢挑取法；解剖镜下单孢分离。 种菌分生孢子诱发种菌分生孢子诱发：对于一些不产孢或难以产孢的种菌进行适宜的人工诱发处理，诱发产生全形发育的无性孢子。几种简单的分生孢子诱发方法：a. 刺伤处理b. 冷冻处理c. 紫外线短期照射d. 黑暗交替处理e. 培养基贫瘠化f.培养物干燥处理g. 延长放置时间4、种菌形态学观察、描述与鉴定对含有分生孢子及产孢梗的乳酚油玻片，在OLYMPUS BX-53光学绘图显微镜下观察、绘观察、绘图、照相、测量图、照相、测量。注重菌落、菌丝的

14、形态及颜色特征。分生孢子梗的有无、形态、 分枝、长短、隔膜。产孢细胞的产孢方式、延伸方式、形态特征。分生孢子的着生、脱落方式、形态、大小、隔膜特征（包括隔膜的有无、真假、多少）以及颜色等。根据菌落、分生孢子梗、产孢细胞以及根据菌落、分生孢子梗、产孢细胞以及分生孢子的形态特征和产孢方式进行鉴分生孢子的形态特征和产孢方式进行鉴定。定。5、种菌保藏 斜面试管保存 无菌水离心管保存 石蜡油保存既适宜短期内目的种菌的反复移置、培养及描述研究，也适用于一些模式种菌的长期保存。六、研究意义我国国土面积大，植被种类丰富，提供了很好的研究材料及环我国国土面积大，植被种类丰富，提供了很好的研究材料及环境。境。1热带、亚热带地区气候条件特殊，对该地区