选修三基因工程的基本工具

1、愿同学们在新的一年里，愿同学们在新的一年里，健康快健康快乐像马猴，乐像马猴，无忧无虑比猿猴，聪无忧无虑比猿猴，聪明伶俐胜孙猴！好事多如猴毛，明伶俐胜孙猴！好事多如猴毛，成绩猴顺猴顺滴！成绩猴顺猴顺滴！选修选修3 生态工程生态工程生物技术的安全性生物技术的安全性和伦理问题和伦理问题胚胎工程胚胎工程细胞工程细胞工程基因工程基因工程现代生物科技现代生物科技专题专题专题专题1.1.基因工程基因工程 基因工程的概念基因工程的概念1.1 基因工程的基本工具基因工程的基本工具1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程的发展史基因工程的发展史1.3 基因工程的应用基因工程的应用1.4 蛋白

2、质工程的崛起蛋白质工程的崛起基因工程的概念基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外严格的设计，并通过体外DNADNA重组和转基重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在和生物产品。由于基因工程是在DNADNA分子分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNADNA重组技术重组技术或或基因拼接技术基因拼接技术。基因工程基因工程名称名称基因拼接技术或基因拼接技术或DN

3、ADNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNADNA分子水平分子水平基本过程基本过程“剪切剪切”“”“拼接拼接”“”“导入导入”“”“表达表达”结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物基因工程的概念基因工程的概念这种技术是在生物体外，通过对这种技术是在生物体外，通过对DNADNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所

4、需要的基因产物。类所需要的基因产物。 为什么能把一种生物的基因为什么能把一种生物的基因“嫁接嫁接”到另一种生物上并成功表达？到另一种生物上并成功表达？即：（即：（1）不同生物）不同生物DNA分子的基分子的基本结构是相同的，都遵循碱基互补本结构是相同的，都遵循碱基互补配对原则。配对原则。（2）生物界共用一套遗传密码。）生物界共用一套遗传密码。一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”分分 布：布： 主要从原核生物中分离纯化得到主要从原核生物中分离纯化得到作用特点：作用特点： 特异性，即识别特异性，即识别双链双链DNA分子的分子的 特定核苷酸序列，切割特定切点特定核苷酸序列，切割特定切点切切 点：点： 每

5、一条链中每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的特定部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键磷酸二酯键种种 类：类： 约约4000种种举举 例：例： EcoRI限制酶能识别限制酶能识别GAATTC序列，序列， 并在并在G和和A之间切开之间切开结结 果：果：形成两种末端形成两种末端黏性末端黏性末端平末端平末端限制酶所识别的序列有什么特点 限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6 6个碱基还是个碱基还是4 4个碱基，个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNADNA上上的碱基是反向对称重复排列的。的碱基是反向对称重复排列的。限制性内切酶限制限制

6、酶酶DNADNA被限制酶切断后有两个反向互补的被限制酶切断后有两个反向互补的“黏黏性末端性末端”。被同一种限制切断的几个。被同一种限制切断的几个DNADNA具有相具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。同的黏性末端，能够通过互补进行配对。模型构建1CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 练习使用练习使用EcoRI 剪切目的基因剪切目的基因CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 目的基因目的基因黏性末端黏性末端3.限制酶在原核生物中的作用

7、原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入侵，但是，的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源菌的一种防御性工具，当外源DNADNA侵入时，会利用侵入时，会利用限制酶将外源限制酶将外源DNADNA切割掉，以保证自身的安全。所切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNADNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。使之失效，从而达到保护自身的目的

8、。 含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNADNA分子中或者不具备分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。能将其切开。 二、DNA连接酶“分子缝合针”1.1.连接酶有两种：连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为EcoliEcoli连连接酶。接酶。另一种是从另一种是从T4T4噬菌体中分离得到，称为噬菌体中分离得到，称为T T4 4连接酶连接酶。2.2.这两种连接酶催化反应基本相同，

9、这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链都是连接双链DNADNA的缺口，的缺口，而不能连接单链而不能连接单链DNADNA。3.Ecoli3.Ecoli连接酶只能连接黏性末端；连接酶只能连接黏性末端； T T4 4连接酶既可连接酶既可“缝合缝合”黏性末端，又可黏性末端，又可“缝合缝合”平平末端。末端。DNA连接酶“分子缝合针” DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶一样吗？为什么？聚合酶一样吗？为什么？ 模型构建2使用使用DNA连接酶制作重组连接酶制作重组DNA分子分子甲片段甲片段CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT 乙片段乙片段GGCATCTTA

10、AAATTCCGTAG 重组重组DNA分子分子Recombinant DNAGGCATCTTAAAATTCCGTAG 答：答：不是一回事。（在相邻核苷酸的不是一回事。（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与位碳原子上的羟基与5位碳原位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成）子上所连磷酸基团的羟基之间形成）（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端末端 的羟基上，形成磷酸二酯键；的羟基上，形成磷酸二酯键； 而而DNA连接酶是在两个连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNA链

11、为模板，将单个核苷酸通过磷酸链为模板，将单个核苷酸通过磷酸 二酯键形成一条与模板链互补的二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；链； 而而DNA连接酶是将连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。双链上的两个缺口同时连接起来。 因此因此DNA连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。比较项目比较项目DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相同点相同点作用实质相同，都是催化两个核苷酸之间作用实质相同，都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键不不同同点点是否需要模板是否需要模板不需

12、要不需要需要需要接接DNA链链双链双链单链单链作用过程作用过程在两个在两个DNA片片段间形成磷酸段间形成磷酸二酯键二酯键将单个核苷酸加到已存将单个核苷酸加到已存在的在的DNA单链片段上，单链片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键作用结果作用结果将已存在的将已存在的DNA片段连接片段连接合成新的合成新的DNA分子分子用途用途基因工程基因工程DNA复制复制三、基因的载体“分子运输车”2.载体必须具备的条件：载体必须具备的条件： 能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； 具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接； 具有某些标记基因，便于

13、进行筛选；具有某些标记基因，便于进行筛选； （如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ） 对受体细胞无害。对受体细胞无害。1.载体的作用：载体的作用： 将外源基因转移到受体细胞中去。将外源基因转移到受体细胞中去。 利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。3.常用的载体有：常用的载体有： 质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等噬菌体的衍生物，动植物病毒等质粒 质粒是基因工质粒是基因工程最常用的运载体，程最常用的运载体，它广泛地存在于细它广泛地存在于细菌中，是细菌染色菌中，是细菌染色体外能够自主复制体外能够自主复制的很小的环状的很小的环状DNA分子，大小只有普分子，大小只有普通细菌拟核通细菌拟核DNA的的百分之一。百分之一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造能复制并带着插能复制并带着插入的目的基因一入的目的基因一起复制起复制有切割位点有切割位点有标