十二味液化散质量标准的研究

1、十二味液化散质量标准的研究         【摘要】  目的：建立十二味液化散的质量控制标准。方法：采用薄层色谱法对制剂中主要药材赤芍、丹参、黄柏、陈皮进行定性鉴别，采用HPLC测定丹参中丹参酮A的含量。结果：鉴别方法专属性强，定量方法简便、准确。丹参酮A在5.440 g32.640 g范围内呈良好的线性关系（r=0.999 966 3），平均回收率为99.99（n=5），RSD0.3。结论：本质量标准所用方法准确可靠，可行性及重现性良好，能有效地控制该制剂的质量。 【关键词】  十二味液化散；

2、质量标准；TLC；HPLC；丹参酮A   Key words   Shier wei Yehua Powder，quality standard，TLC，HPLC，tanshinone A    十二味液化散由深圳市中医院提供，由黄柏、女贞子、知母、地黄、赤芍、丹参、炮山甲、三棱、莪术、海金沙、泽泻、陈皮12味中药组成。为了更好地控制该制剂的质量，保证临床用药安全有效，本文对十二味液化散的质量标准进行了研究。根据处方中药材的理化性质，采用薄层色谱法对制剂中黄柏、赤芍、丹参、陈皮4味药材进行了定性鉴别，采用HPLC法测定丹参中

3、丹参酮A的含量。结果表明该方法操作简便、快速、专属性强、重复性好，结果令人满意，可作为该制剂质量控制的方法。    1   实验材料   .1   实验仪器   Diamonsil 钻石C18（250 mm×4.6 mm）色谱柱，SPD-10AVP检测器，LC-10ADVP，CS-Light工作站，CTO-10ASVP柱温箱，AG285电子分析天平，HS2060超声波清洗机。   1.2   药品与试剂   

4、;   丹参对照药材（批号：923-9001），黄柏对照药材（批号：121510-200501），芍药苷对照品（批号：110736-200527），盐酸小檗碱对照品（批号：713-9003），丹参酮A对照品（批号：766-200112，HPLC用丹参酮A对照品批号：110766-200315），均购于中国药品生物制品检定所；水为乐百氏纯净水；甲醇为色谱纯（天津科密欧）；其他试剂均为分析纯。    2   方法与结果   2.1   十二味液化散定性鉴别   取本品粉

5、末置显微镜下观察：纤维束鲜黄色，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维。果皮表皮细胞黄棕色或紫棕色，表面呈类多角形，胞间层似细缝状，垂周壁厚，胞腔由深入的外壁分隔成若干个不规则的小腔，胞腔内含黄棕色或紫棕色物。草酸钙针晶成束或散在，针晶长36 m110 m，较细。薄壁细胞类圆形，内含圆形细胞核。草酸钙簇晶众多，散在或存在于薄壁细胞中，常数个或数十个纵向排列成行。孢子黄色，圆锥体状，表面有颗粒状突起。薄壁细胞类圆形，有椭圆形纹孔集成纹孔域。   2.2   赤芍的薄层鉴别   取处方粉末10 g，加乙醇50 mL，超声提取20 min，滤过，

6、滤液蒸干，加水20 mL 使溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，用乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液。取芍药苷对照品适量，加乙醇制成2 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。除赤芍以外，其余各药按处方比例投料，制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺赤芍的阴性对照品溶液。参照薄层色谱法（中国药典2005年版一部 152附录VIB）试验，吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液各5 L分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（455100.2）为展开剂，展开，取出，晾干。喷5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相

7、应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。阴性对照品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，无蓝紫色斑点。结果见图1。      2.3   黄柏的薄层鉴别   取处方粉末5 g，加甲醇50 mL，加热回流30 min，滤过，滤液浓缩至10 mL，作为供试品溶液。取黄柏对照药材50 mg，加甲醇5 mL同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成0.5 mg /mL的溶液，作为对照品溶液。除黄柏以外，其余各药按处方比例制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺黄柏的阴性对照品溶液。参照薄层色谱法（中国药典20

8、05年版一部 1109附录VIB）试验，吸取供试品溶液、阴性对照药品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各5 L分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮 -甲酸-水（10611）为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。阴性对照品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，无荧光斑点。结果见图2。   2.4   丹参的薄层鉴别   取处方粉末10 g，加乙醚10 mL，振摇，放置1 h，滤

9、过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作为供试品溶液。取丹参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取丹参酮A对照品适量，加乙酸乙酯制成2 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。除丹参以外，其余各药按处方比例制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺丹参的阴性对照品溶液。参照薄层色谱法（中国药典2005年版一部1132附录VIB）试验，吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各5 L分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯（191）为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点。在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。阴

10、性对照品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，无斑点。结果见图3。   2.5   陈皮的薄层鉴别   取本品粉末适量，加甲醇20 mL，加热回流20 min，滤过，滤液蒸干，加甲醇2 mL，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品50 mg，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。除陈皮以外，其余各药按处方比例制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺陈皮的阴性对照品溶液。参照薄层色谱法（中国药典2005年版一部 1214附录VIB）试验，吸取对照品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液各5  L分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-

11、丁酮-甲酸-水（7211）为展开剂，展开，取出，晾干，喷2%三氯化铝乙醇溶液，挥干后，置紫外灯（365 nm）下检视。因对照品放置时间过长，不显示斑点，故放弃。            3   含量测定   3.1   色谱条件与系统适应性实验   用十八硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水（8713）为流动相，检测波长为270 nm。理论塔板数按丹参酮A峰计算不应低于6 000。   3.2 

12、;  对照品溶液的制备     取丹参酮A对照品适量，精密称定0.006 8 g，置50 mL棕色的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为初始液；精密量取3 mL，置25 mL棕色瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（每毫升含丹参酮A 16.32 g）。   3.3   供试品溶液的制备    取本品粉末约4.0 g，精密称定3.453 4 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，精密称定，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得。 &#

13、160; 3.4   阴性对照品溶液的制备   除丹参以外，其余各药按处方比例制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺丹参的阴性对照品溶液。   3.5   测定方法   精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照品溶液各20 L，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见图4图6。      3.6   线性关系考察   精密吸取3.2中初始液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、6 mL，分别置25 mL容量瓶中

14、，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取3.2中对照品溶液20 L注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，丹参酮A进样量为横坐标，经线性回归，得回归方程为Y=136 019.8 X-1 843.088。结果表明：丹参酮A在 5.440 g32.640 g范围内线性关系良好。   3.7   精密度试验   取丹参酮A对照品，在上述色谱条件下，连续进样5次，RSD=0.648 578 2，结果表明精密度良好。   3.8   稳定性试验   精密吸取对照品溶液， 在1 h、

15、2 h、4 h、6 h、8 h各进样20 L，重复5次， RSD=0.9，结果表明丹参酮A在8 h内稳定。   3.9   重复性试验   取同一批样品，按3.3项下方法制备5份供试品溶液，测定含量，RSD=1.2，表明此法重复性良好。   3.10   干扰试验   分别吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照品溶液各20 L，按上述色谱条件分别进行测定，结果表明阴性对照溶液对丹参酮A峰无干扰。   3.11   加样回收率试验 

16、;  精密称取已知丹参酮A含量同一批号的样品5份，分别加入对照品溶液1.0 mL，按供试品溶液制备及含量测定的方法进行测定，计算回收率。结果见表1。      结果表明本测定方法丹参酮A的平均回收率为99.97%，RSD为0.3，回收率良好。   3.12   样品含量测定   取3个批号样品，按3.3项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各20 L，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定丹参酮A含量，结果样品1的浓度和含量分别为0.018 67 mg/mL和0.36%，样品2

17、的浓度和含量分别为0.018 71 mg/mL和0.36%，样品3的浓度和含量分别为0.018 76 mg/mL和0.36%。    4   讨   论   盐酸小檗碱具有一定的极性，在黄柏的薄层鉴别中用氨饱和的展开剂，在实验过程中出现Rf值过小的现象，分析原因可能为氨蒸气饱和时间太短（15 min），将饱和时间延长为25 min后，展开后盐酸小檗碱的Rf值有显着改善 2。   流动相中甲醇的体积分数很重要，甲醇体积分数过低，样品中各组分能完全分离，但保留时间相对延长，峰有不同程度的扩散；甲醇体积分数过高，保留时间相对缩短，但丹参酮A与其他峰有重叠，会给分析结果带来误差 3。   流速的大小直接影响色谱柱系统的压力、各组分分离度、洗脱时间等，流速太小，分析时间过长；流速太大，系统的压力过高 4。实验考察了流速为0.8 mL/mi