分子医学技能：实验六离子交换层析和紫外分光光度法测蛋白质

1、http:/ 2：离子交换层析：离子交换层析http:/ 分光光度法及其分类（分光光度法及其分类（） 透光度（透光度（T T）、吸光度（）、吸光度（A A）、光密度（）、光密度（ODOD，D D） Lambert-BeerLambert-Beer定律定律 D = -lg I/I o= -lgT= KCLD = -lg I/I o= -lgT= KCL 分光光度法的概念和相关知识分光光度法的概念和相关知识http:/ 一、一、紫外吸收法定量分析蛋白质的原理紫外吸收法定量分析蛋白质的原理 1. 1.原理：原理：酪氨酸、色氨酸的苯环共轭双键酪氨酸、色氨酸的苯环共轭双键，ODOD280280 2. 2

2、.优点：优点：简单、快速、样品可以回收简单、快速、样品可以回收 3.3.缺点：缺点：有一定的误差（酪氨酸、色氨酸含量差异）；有一定的误差（酪氨酸、色氨酸含量差异）； 受核酸类物质干扰受核酸类物质干扰 4.4.注意：注意：石英杯的使用石英杯的使用http:/ 蛋白质溶液（牛血清白蛋白溶液）蛋白质溶液（牛血清白蛋白溶液） 生理盐水生理盐水2. 2. 设备设备 可见光分光光度计，比色杯可见光分光光度计，比色杯 移液管移液管二、实验试剂及设备二、实验试剂及设备http:/ 100%键键6、置标尺为吸光度，空对照吸光度为、置标尺为吸光度，空对照吸光度为07、样品置入光路、样品置入光路8、读出数据、读出数

3、据以上步骤重复以上步骤重复2 2次：在波长次：在波长260nm260nm（检测核酸）、（检测核酸）、280nm280nm（检测（检测蛋白质处分别测蛋白质样品的蛋白质处分别测蛋白质样品的ODOD值，每次以检测样品的溶剂作值，每次以检测样品的溶剂作为空对照调零。为空对照调零。http:/ 1 1、ODOD2802800D0D2602601.51.5时，用时，用Lowry-KalokarLowry-Kalokar公式：公式： 样本蛋白质含量样本蛋白质含量(mg(mgml)=1.5ml)=1.5ODOD2802800.750.75ODOD2602602 2、ODOD280280ODOD2602601.

4、51.5时，用时，用Lamber-BeerLamber-Beer定律计算：定律计算： 样本蛋白质含量样本蛋白质含量(mg(mgml)ml) = = ODOD280280（K KL L） K K：克分子消光系数；：克分子消光系数；L L：溶液厚度：溶液厚度* * 本实验样品为牛血清白蛋白，本实验样品为牛血清白蛋白， K K0.630.63（mlmlcm. mgcm. mg），），L=1cmL=1cmhttp:/ 一、层析法（色谱法）概念一、层析法（色谱法）概念http:/ 经典的层析实验经典的层析实验叶绿素的层析分离叶绿素的层析分离http:/ 1 固定相：固定相：固定不移动的一相，一般是指支持

5、物中固定不移动的一相，一般是指支持物中固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂）或液体物固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂）或液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），阻止所分离质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），阻止所分离的样品向前移动（阻力）的样品向前移动（阻力） 2 2 流动相：流动相： 洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱液。不断洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱液。不断地前移，并带动所分离的样品向前移动（动力）地前移，并带动所分离的样品向前移动（动力）http:/ 3 洗洗 脱：脱： 用洗脱液冲洗层析柱，使样品中不用洗脱液冲洗层析柱，使样品中不同组分得以分离的过程。同组分得以分离的过程。4 4 洗脱曲线

6、：洗脱曲线：以洗脱的体积为横坐标，组分的以洗脱的体积为横坐标，组分的浓度为纵坐标作图所得的曲线。浓度为纵坐标作图所得的曲线。http:/ 薄膜层析薄膜层析柱层析柱层析洗脱液洗脱液样品样品填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱1 1、按固定相基质的形式分类、按固定相基质的形式分类http:/ 2、根据流动相的形式分类、根据流动相的形式分类液相层析：流动相为液相（液液相层析：流动相为液相（液-液层析，液液层析，液-固层析）；固层析）；气相层析：流动相为气相（气气相层析：流动相为气相（气-液层析，气液层析，气-固层析）。固层析）。http:/ 3、按分离原理分类、按分离原理分类吸附层析吸附层析分配

7、层析分配层析凝胶过滤（分子筛层析）凝胶过滤（分子筛层析）离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析 http:/ 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝 、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土 、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 琼脂糖琼脂糖 、 葡聚糖葡聚糖离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、葡聚糖、纤维素、葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物

8、与配体之间有 带配基的琼脂糖或葡聚糖带配基的琼脂糖或葡聚糖 特殊亲和力特殊亲和力http:/ 离子交换层析离子交换层析（ion-change chromatography）http:/ 1. 原理原理 离子交换层析离子交换层析是用是用离子交换剂离子交换剂（具有离子交（具有离子交换性能的物质）换性能的物质）作固定相作固定相，利用它与流动相中的，利用它与流动相中的离子能进行离子能进行可逆的交换可逆的交换性质来分离离子型化合物性质来分离离子型化合物的层析方法。的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。换反应的过程。 广泛用于蛋白质、氨基酸

9、、糖类等的分离纯广泛用于蛋白质、氨基酸、糖类等的分离纯化化。http:/ 磺酸甲基纤维素磺酸甲基纤维素(SMC)(SMC) 羧甲基纤维素羧甲基纤维素(CMC)(CMC) 磷酸基纤维素磷酸基纤维素(PC)(PC) 阴离子交换纤维素阴离子交换纤维素: pH8.6: pH8.6以下分离中性或酸性物质以下分离中性或酸性物质 二乙基胺乙基纤维素二乙基胺乙基纤维素(DEAEC)(DEAEC) 三乙基胺乙基纤维素三乙基胺乙基纤维素(TEAEC)(TEAEC)http:/ 3）离子交换凝胶）离子交换凝胶 分离大分子物质分离大分子物质 葡聚糖（葡聚糖（SephadexSephadex） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（

10、PAGPAG） 琼脂糖（琼脂糖（SepharoseSepharose）http:/ 4. 操作注意点操作注意点（一）离子交换剂的选择（一）离子交换剂的选择原则：原则：根据被分离物质的性质选择根据被分离物质的性质选择同一性质离子同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差差异大异大的型号交换剂，以保证通过离子交换层析后的型号交换剂，以保证通过离子交换层析后能得到比较满意的结果。能得到比较满意的结果。http:/ 避免使样品变性避免使样品变性http:/ (三三) )洗脱剂洗脱剂 原则原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离：所用洗脱液比吸着物质具

11、有更活泼的离 子或基团子或基团 改变改变pHpH或离子强度或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱http:/ 5. 应用应用分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子。生物分子。http:/ 目的：目的：离子交换层析浓缩蛋白质溶液离子交换层析浓缩蛋白质溶液( (每组一柱每组一柱) ) 原理：原理： 蛋白质的等电点一般低于蛋白质的等电点一般低于8 8，在，在pHpH为为8 8的的弱离子强度溶液带负电荷，可以被阴离子交换树弱离

12、子强度溶液带负电荷，可以被阴离子交换树脂吸附。当增加缓冲液离子强度或阴离子电负性脂吸附。当增加缓冲液离子强度或阴离子电负性时，可以将蛋白质成批量洗脱下来，达到蛋白质时，可以将蛋白质成批量洗脱下来，达到蛋白质浓缩的目的。浓缩的目的。 http:/ 材料：材料： 1 1、 阴离子交换剂：纤维素阴离子交换剂：纤维素DE-52DE-52 2 2、 样品：样品： 低浓度蛋白质溶液低浓度蛋白质溶液 3 3、 上样缓冲液：低离子强度缓冲液上样缓冲液：低离子强度缓冲液0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.02mol/L NaCl0.02mol/L NaCl 4

13、 4、 洗脱缓冲液：高离子强度缓冲液洗脱缓冲液：高离子强度缓冲液0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液1mol/L NaCl1mol/L NaClhttp:/ DE-52DE-52预处理：预处理：将将DE-52DE-52在蒸馏水中浸泡过夜，充分溶涨，然后倾在蒸馏水中浸泡过夜，充分溶涨，然后倾去上清，加入过量的去上清，加入过量的0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液浸泡磷酸盐缓冲液浸泡1 1小时，小时，真空抽气。真空抽气。 试剂配制：试剂配制： NaNa2 2HPOHPO4 4.12H.12H2 2O 71.64 g

14、 O 71.64 g 定量至定量至1 L 1 L （0.2mol/L Na0.2mol/L Na2 2HPOHPO4 4） NaHNaH2 2PO4.2HPO4.2H2 2O 31.21 g O 31.21 g 定量至定量至1 L 1 L （0.2mol/L NaH0.2mol/L NaH2 2POPO4 4） 91.5ml Na91.5ml Na2 2HPOHPO4 4 8.5ml NaH8.5ml NaH2 2POPO4 4 加水定量至加水定量至1L1L，配成，配成0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液。 1.15g NaCl 1.15g Na

15、Cl 1000ml 0.02mol/L pH8.01000ml 0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液，配成磷酸盐缓冲液，配成0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.02mol/L NaCl0.02mol/L NaCl； 58.5g NaCl 58.5g NaCl 1000ml 0.02mol/L pH8.01000ml 0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液，配成磷酸盐缓冲液，配成0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液1mol/L NaCl1mol/L NaCl； 蛋白质溶液：蛋白质溶液：1

16、g 1g 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓磷酸盐缓冲液冲液 100ml100ml，配成，配成10mg/ml 10mg/ml 蛋白质溶液蛋白质溶液。 http:/ 装柱：装柱：关上出口阀门，在层析柱内装入关上出口阀门，在层析柱内装入1/31/3体积的体积的0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸磷酸盐缓冲液盐缓冲液0.02mol/L NaCl0.02mol/L NaCl，然后用一根玻璃棒将纤维素导入层析柱，然后用一根玻璃棒将纤维素导入层析柱，不要带入气泡。然后打开出口阀门，保持不要带入气泡。然后打开出口阀门，保

17、持1.5ml/min1.5ml/min的流速，使纤维素堆的流速，使纤维素堆积。待液面接近纤维素面时进行平衡（保持不要干柱）。积。待液面接近纤维素面时进行平衡（保持不要干柱）。平衡：平衡：1 1倍纤维素体积的倍纤维素体积的0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.02mol/L 0.02mol/L NaClNaCl用玻棒引导沿壁缓慢倒入柱内，尽量勿将已堆积好的纤维素冲起。出用玻棒引导沿壁缓慢倒入柱内，尽量勿将已堆积好的纤维素冲起。出口流速可保持在口流速可保持在1.5ml/min1.5ml/min。加入样品：加入样品：取待浓缩取待浓缩蛋白质溶液蛋白质溶

18、液2ml2ml在在752752分光光度计检测溶液的分光光度计检测溶液的ODOD280280读数读数（用平衡液做溶剂对照调零）。（用平衡液做溶剂对照调零）。等步骤等步骤2 2的平衡结束后，待平衡液下降接的平衡结束后，待平衡液下降接近柱面时，将出口阀门关闭，然后将近柱面时，将出口阀门关闭，然后将50ml50ml的的蛋白质溶液蛋白质溶液小心加入柱内（保小心加入柱内（保护柱面），打开阀门，保持护柱面），打开阀门，保持1.5ml/min1.5ml/min的流速，使蛋白质溶液缓慢进入柱的流速，使蛋白质溶液缓慢进入柱内。内。平衡：平衡：两倍柱体积的两倍柱体积的0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.02mol/L NaCl0.02mol/L NaCl 流过柱，洗杂质。流过柱，洗杂质。洗脱：洗脱：待平衡液下降接近柱面时，关上出口阀门，加入待平衡液下降接近柱面时，关上出口阀门，加入0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液1mol/L NaCl1mol/L NaC