4蛋白质化学2一级结构及分析

1、1902年，年，Hofmeister和和 Fischer提出，肽键是蛋白质提出，肽键是蛋白质分子中氨基酸间的主要连接方式，即一个氨基酸的分子中氨基酸间的主要连接方式，即一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的-氨基脱去一分子水以肽键相氨基脱去一分子水以肽键相互连接，形成了蛋白质结构的肽键理论（学说），并互连接，形成了蛋白质结构的肽键理论（学说），并 为多数研究者所证实。为多数研究者所证实。1902年年Fischer人工合成了十人工合成了十八肽，能被蛋白酶水解为氨基酸，具双缩脲反应。八肽，能被蛋白酶水解为氨基酸，具双缩脲反应。氨基酸的多聚物，分子量大小差异极大，可以是氨基酸的多聚物

2、，分子量大小差异极大，可以是2或或3个到成千上万个氨基酸残基连接而成。个到成千上万个氨基酸残基连接而成。两个氨基酸残基之间通过共价的肽键（酰胺键）连两个氨基酸残基之间通过共价的肽键（酰胺键）连接形成一个二肽；三个氨基酸残基连接成三肽；接形成一个二肽；三个氨基酸残基连接成三肽；有限数量的数十个氨基酸残基连接成寡肽；多个氨有限数量的数十个氨基酸残基连接成寡肽；多个氨基酸残基则连接成多肽；蛋白质可以是数百基酸残基则连接成多肽；蛋白质可以是数百 到成千到成千上万个氨基酸残基连接而成。上万个氨基酸残基连接而成。多肽与蛋白质有时混用，但一般将分子量在多肽与蛋白质有时混用，但一般将分子量在10000以以下的

3、称为肽或多肽。下的称为肽或多肽。肽或蛋白质的水解是耗能的，由于高的活化能，水肽或蛋白质的水解是耗能的，由于高的活化能，水解很慢，蛋白质的肽键非常稳定，多数胞内条件下解很慢，蛋白质的肽键非常稳定，多数胞内条件下的半衰期长达的半衰期长达7年。年。肽键就是一个氨基酸的肽键就是一个氨基酸的-羧基与另一羧基与另一个氨基酸的个氨基酸的-氨基脱水缩合形成的键氨基脱水缩合形成的键 缩合缩合水解水解氨基酸连接成肽链后，由于氨基酸之间通过一个氨基酸连接成肽链后，由于氨基酸之间通过一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合脱水，肽链上氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合脱水，肽链上的一个氨基酸单位被称为残基（的一个氨

4、基酸单位被称为残基（residue），带有游离），带有游离-氨基的一端被称为氨基氨基的一端被称为氨基(末末)端端(或或N端端)，带有游离，带有游离-羧基的一端被称为羧基羧基的一端被称为羧基(末末)端端(或或C端端)。H3+N-S-G-Y-A-L-COO-氨基酸形成肽链后，整个肽链上留下氨基酸形成肽链后，整个肽链上留下N端可解端可解离的氨基、羧基端可解离的羧基、侧链上能够离的氨基、羧基端可解离的羧基、侧链上能够解离的解离的R基团，中间氨基酸的基团，中间氨基酸的-氨基和氨基和-羧羧基由于形成肽键而不再对整个肽链的解离有贡基由于形成肽键而不再对整个肽链的解离有贡献。献。肽也有特征滴定曲线及特征肽也有

5、特征滴定曲线及特征pI。R基团的解离常数由于氨基酸的氨基和羧基被基团的解离常数由于氨基酸的氨基和羧基被用于形成肽键成为了残基，其解离在一定程度用于形成肽键成为了残基，其解离在一定程度上会发生改变，这种变化受到上会发生改变，这种变化受到-氨基及氨基及-羧羧基失去电荷、与其他基失去电荷、与其他R基团的作用、其他能够基团的作用、其他能够影响解离常数的环境因子有关。影响解离常数的环境因子有关。不能对生物活性肽的大小及蛋白质的不能对生物活性肽的大小及蛋白质的分子量大小与功能之间作出相关性结论。分子量大小与功能之间作出相关性结论。自然存在的肽的大小从自然存在的肽的大小从2个到数千个氨基酸个到数千个氨基酸残

6、基，甚至最小的肽也能表现出重要的生残基，甚至最小的肽也能表现出重要的生物学作用，如商业化合成的二肽物学作用，如商业化合成的二肽L-天冬氨天冬氨酰酰-L-苯丙氨酸甲酯苯丙氨酸甲酯人工甜味剂人工甜味剂-阿斯巴甜阿斯巴甜(aspartame)或纽特健康糖（或纽特健康糖（NutraSweet)，比蔗糖甜比蔗糖甜200倍倍。1965年由科学家年由科学家James Schlatter在研究蛋白质时发现，经在研究蛋白质时发现，经16年年100多次的科学研究及验证后，阿斯巴甜于多次的科学研究及验证后，阿斯巴甜于1981年年(FDA批准）批准）以以Nutrasweet（纽特健康糖）品牌正式推出市面。（纽特健康糖

7、）品牌正式推出市面。1986年我国年我国卫生部批准可用于除罐头以外的所有食品中。卫生部批准可用于除罐头以外的所有食品中。 COCH2CH2CHNH2COOHNHCHCH2SHCONHCH2COOHgamma-Glu-L-Cys-AlaGSH可被氧化成可被氧化成GSSGGSH作用：在红细胞中作为巯基缓冲剂存在；作用：在红细胞中作为巯基缓冲剂存在； 维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。处于还原状态。例如，它可防止例如，它可防止H2O2将红细胞中血色素的二价铁氧化成将红细胞中血色素的二价铁氧化成三价铁形成高铁血红蛋白。三价铁形成高铁血

8、红蛋白。谷胱甘肽谷胱甘肽Glutathion(e)Glutathion(e)（GSHGSH）(GSSG)(GSSG)-Gly肌联蛋白肌联蛋白一些脊椎动物的激素是小肽，如：催产素一些脊椎动物的激素是小肽，如：催产素(oxytocin) (9肽），由垂体后叶制造肽），由垂体后叶制造 ，能刺激子，能刺激子宫收缩；舒缓激肽宫收缩；舒缓激肽(bradykinin) (9肽）能使呼吸肽）能使呼吸道平滑肌收缩，抑制组织炎症；甲状腺激素释放道平滑肌收缩，抑制组织炎症；甲状腺激素释放因子因子(TRH)(3肽肽)，下丘脑分泌，能刺激垂体前叶，下丘脑分泌，能刺激垂体前叶促甲状腺素的释放，它们发挥作用的浓度极低。促甲

9、状腺素的释放，它们发挥作用的浓度极低。与许多抗生素一样，一些极毒的毒蘑菇毒素，与许多抗生素一样，一些极毒的毒蘑菇毒素，如鹅膏蕈碱（毒素）如鹅膏蕈碱（毒素）(双环的双环的8 肽毒素）肽毒素） (amanitin)，对动物有致死作用，与真核生物，对动物有致死作用，与真核生物RNA聚合酶聚合酶II作用抑制转录。作用抑制转录。 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽脑啡肽 Leu-脑啡肽脑啡肽CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGlyNH2SS牛催产素CysTyrGlnAsnCysProSSPh

10、eArgGlyNH2牛加压素牛催产素牛催产素牛加压素牛加压素脑啡肽脑啡肽(enkephalin)是神经递质的一种，能改变神经元对经典神经递质的反是神经递质的一种，能改变神经元对经典神经递质的反应，起修饰经典神经递质的作用，又称神经调质应，起修饰经典神经递质的作用，又称神经调质(neuromodulator)，又被，又被称为称为“脑内吗啡脑内吗啡”。引发分娩时引发分娩时的子宫收缩，的子宫收缩，刺激乳汁分刺激乳汁分泌。减少肾泌。减少肾上腺酮等压上腺酮等压力激素水平，力激素水平，降低血压。降低血压。又名抗利尿激又名抗利尿激素，可调节细素，可调节细胞的进水量，胞的进水量，增加肾中水的增加肾中水的重吸收

11、，并刺重吸收，并刺激血管收缩而激血管收缩而增加血压。增加血压。 oxytocinvasopressinNHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鹅膏覃碱的化学结构鹅膏蕈碱（鹅膏毒素、蝇蕈素）的化学结构鹅膏蕈碱（鹅膏毒素、蝇蕈素）的化学结构-Amanitin：毒蘑菇鬼笔鹅蕈：毒蘑菇鬼笔鹅蕈(Amanita phalloides)的真菌毒素，二环八肽，能抑制的真菌毒素，二环八肽，能抑制真核真核RNA聚合酶聚合酶与与RNA聚合酶聚合酶转录。转录。Asn-Hyp-H

12、yi-Trp-Gly-Ile-Gly-Cys Bridge: 4-8 Asn-Hyp-Hyi-Trp-Gly-Ile-Gly-Cys Bridge: 4-8 一些蛋白质只含有一条简单的多肽链，而另一些蛋白一些蛋白质只含有一条简单的多肽链，而另一些蛋白质成为多亚基蛋白质，含有两条或更多条非共价结合质成为多亚基蛋白质，含有两条或更多条非共价结合的多肽链。多亚基蛋白质的独立的多肽链可以是同一的多肽链。多亚基蛋白质的独立的多肽链可以是同一多肽链，也可以是不同的多肽链。多肽链，也可以是不同的多肽链。有时，不同的亚基形成小的寡聚体有时，不同的亚基形成小的寡聚体(oligomer) ，并以，并以此进一步装配

13、。这种小的寡聚体被称为原体此进一步装配。这种小的寡聚体被称为原体(protomer)，原体再装配成更大的聚集体。如血红蛋，原体再装配成更大的聚集体。如血红蛋白，四条非共价结合的多肽链，两条一致的白，四条非共价结合的多肽链，两条一致的链和两链和两条相同的条相同的链，可以称为四条多肽亚基的四聚体或者链，可以称为四条多肽亚基的四聚体或者原体的二聚体；天冬氨酸氨甲酰磷酸转移酶由原体的二聚体；天冬氨酸氨甲酰磷酸转移酶由6个调节亚基（个调节亚基（R）和）和6个催化亚基（个催化亚基（C）组成，装配时）组成，装配时先由先由1个个C亚基和亚基和1个个R亚基组成一个原体亚基组成一个原体CR ，再由，再由6个原体装

14、配成一个有活性的酶。个原体装配成一个有活性的酶。胰岛素的两条多肽链通过二硫键共胰岛素的两条多肽链通过二硫键共价连接，这种情况下，单条多肽链不价连接，这种情况下，单条多肽链不是亚基，通常被简单地认为是肽链。是亚基，通常被简单地认为是肽链。因此一条多肽链及共价连接的多肽链因此一条多肽链及共价连接的多肽链不是多亚基结构（四级结构）。不是多亚基结构（四级结构）。可以从一个不含有其他化学基团的蛋白质分子可以从一个不含有其他化学基团的蛋白质分子估算其中的氨基酸残基的大概数目，用蛋白质估算其中的氨基酸残基的大概数目，用蛋白质的分子量除以的分子量除以110，即为组成氨基酸的数目。，即为组成氨基酸的数目。20种

15、氨基酸的平均分子量为种氨基酸的平均分子量为138，较小的氨基，较小的氨基酸在多数蛋白质中的丰度高，如果考虑不同氨酸在多数蛋白质中的丰度高，如果考虑不同氨基酸在蛋白质中出现的比例，氨基酸的平均分基酸在蛋白质中出现的比例，氨基酸的平均分子量只有子量只有128，形成肽键时失去一分子水，形成肽键时失去一分子水（18），因此，蛋白质分子中氨基酸残基的平），因此，蛋白质分子中氨基酸残基的平均分子量为均分子量为128-18=110。（a）测得一种血红素蛋白质含）测得一种血红素蛋白质含0.426%铁，计铁，计算其最低相对分子质量。算其最低相对分子质量。(b) 一种纯酶按重量计算含亮氨酸一种纯酶按重量计算含亮氨

16、酸1.65%和异亮和异亮氨酸氨酸2.48%，求最低相对分子质量，求最低相对分子质量?解：解：假设一个这种血红素蛋白质只含一个铁原假设一个这种血红素蛋白质只含一个铁原子，则一摩尔这种血红素蛋白质只含一摩子，则一摩尔这种血红素蛋白质只含一摩尔铁原子。一摩尔铁原子重尔铁原子。一摩尔铁原子重55.85克。克。血红素蛋白质最低相对分子质量血红素蛋白质最低相对分子质量 = 55.85 / 0.00426 = 13110 amu Leu (MW = 131.11 amu) Ile (MW =131.11 amu) Ile : Leu = 2.48% : 1.65% = 3 : 2 假设酶分子中含有三个异亮氨

17、酸和两假设酶分子中含有三个异亮氨酸和两个亮氨酸，三摩尔个亮氨酸，三摩尔Ile重重393.33 克，酶分子克，酶分子的最低相对分子质量的最低相对分子质量 = 393.33 / 0.0248 = 15860 amu. 3(131-18)/2.48% = 13669 Da 2(131-18)/1.65% = 13670 DaCC多肽具有特征性的氨基酸组多肽具有特征性的氨基酸组成，多肽或蛋白质以酸水解成，多肽或蛋白质以酸水解产生游离产生游离-氨基酸的混合氨基酸的混合物。当完全水解时物。当完全水解时,每一种每一种类型的蛋白质产生一种特征类型的蛋白质产生一种特征性的氨基酸比例或混合物。性的氨基酸比例或混合

18、物。20种氨基酸几乎从不以相同种氨基酸几乎从不以相同的比例出现在一个蛋白质中的比例出现在一个蛋白质中，有高有低，甚至有的只出，有高有低，甚至有的只出现一次或根本不出现。现一次或根本不出现。很多蛋白质，如核糖核苷酸酶、胰凝乳蛋很多蛋白质，如核糖核苷酸酶、胰凝乳蛋白酶，仅含有氨基酸残基，没有其他化学基团白酶，仅含有氨基酸残基，没有其他化学基团-单纯蛋白质。单纯蛋白质。但有些蛋白质，除氨基酸残基外，还含有但有些蛋白质，除氨基酸残基外，还含有永久连接的化学组成，被称为复合蛋白质，非氨永久连接的化学组成，被称为复合蛋白质，非氨基酸连接的化学基团被称为辅基基酸连接的化学基团被称为辅基(prosthetic

19、 group)。复合蛋白质的分类根据辅基的化学特性，。复合蛋白质的分类根据辅基的化学特性，如脂蛋白含有脂、糖蛋白含有糖、金属蛋白含有如脂蛋白含有脂、糖蛋白含有糖、金属蛋白含有特异的金属。有些蛋白质甚至含有不止一种辅基，特异的金属。有些蛋白质甚至含有不止一种辅基，辅基通常对蛋白质的功能起重要作用。辅基通常对蛋白质的功能起重要作用。铁蛋白铁蛋白酪蛋白酪蛋白质体蓝素质体蓝素肽末端肽末端-羧基羧基pKa值比游离值比游离AA中的大，中的大，而肽末端而肽末端-氨基氨基pKa值比游离值比游离AA中的小，中的小，侧链侧链R基的差别不大。基的差别不大。等电点（两性）。等电点（两性）。酸碱性质取决于：酸碱性质取决

20、于：-羧基、羧基、-氨基、侧链基团的解离氨基、侧链基团的解离具有双缩脲具有双缩脲(biuret)反应反应(H2N-CO-NH-CO-NH2) -Pr特有的反应（与硫酸铜特有的反应（与硫酸铜-氢氢氧化钠溶液产生紫红色或蓝紫色颜色反氧化钠溶液产生紫红色或蓝紫色颜色反应，可用于肽和蛋白质定量测定）。应，可用于肽和蛋白质定量测定）。 1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： 螺旋，折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间

21、位置 quarternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和二硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立的三维结构的实体）这两个层次。肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连CONCN+O-CNCOHC肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。显的共轭作用。组成肽键的组成肽键的6个原子处于同一平面。个原子处于同一平面。肽键中的肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋键具有部分双键性质，不能自由旋转。转。在

22、大多数情况下，以反式结构存在。在大多数情况下，以反式结构存在。肽键平面肽键平面两个肽键平面之间的两个肽键平面之间的-碳原碳原子，可以作为一个旋转点子，可以作为一个旋转点形成二面角形成二面角(dihedral angle)。二面角的变化，决定着多二面角的变化，决定着多肽主键在三维空间的排布肽主键在三维空间的排布方式，是形成不同蛋白质方式，是形成不同蛋白质构象的基础。构象的基础。 绕绕C-N键轴旋转的二面角（键轴旋转的二面角（C-N-C-C）称为）称为，绕，绕C-C键轴旋转的二键轴旋转的二面角（面角（N-C-C-N）称为）称为，原则上，原则上和和可以取可以取-180 +180之间的任一之间的任一值

23、，这样多肽链主链的各种可能构象值，这样多肽链主链的各种可能构象都可用都可用和和这两个二面角或扭角来描这两个二面角或扭角来描述。述。二面角二面角和和的图示。其中黄色部分显的图示。其中黄色部分显示的是肽平面，而示的是肽平面，而R1和和R2分别表示左分别表示左右两个残基的侧链。右两个残基的侧链。u研究蛋白质的一级结构，就是要将研究蛋白质的一级结构，就是要将氨基酸的排列顺序搞清楚。氨基酸的排列顺序搞清楚。u二十世纪四十年代起，许多人不遗二十世纪四十年代起，许多人不遗余力地从事蛋白质的一级结构研究，余力地从事蛋白质的一级结构研究，Sanger第一个将一个蛋白质（胰岛第一个将一个蛋白质（胰岛素）的所有氨基

24、酸的排列顺序通过素）的所有氨基酸的排列顺序通过高度的实验技巧加以确定。高度的实验技巧加以确定。最小的蛋白质，由最小的蛋白质，由A链链(21 AA)和和B链链(30 AA)组组成；胰腺成；胰腺细胞分泌的一种激素，通过分泌和细胞分泌的一种激素，通过分泌和作用，可以降低血糖。作用，可以降低血糖。u20 世纪初世纪初, 俄国著名生理学家巴甫洛夫俄国著名生理学家巴甫洛夫(Pavlov)改改用人工瘘的方法研究胰腺分泌，取得了卓越的成用人工瘘的方法研究胰腺分泌，取得了卓越的成就，就， 因此荣获了因此荣获了1904年的诺贝尔医学奖年的诺贝尔医学奖u1921年年Banting & Best 从胰腺中抽提

25、出了有活性从胰腺中抽提出了有活性的胰岛素，的胰岛素，1923年年Banting & Macleod获获Nobel医医学奖；学奖；u阿根廷著名医学家豪塞阿根廷著名医学家豪塞, 他在对脑垂体的研究中他在对脑垂体的研究中, 发现脑垂体对胰腺分泌胰岛素有重要影响发现脑垂体对胰腺分泌胰岛素有重要影响, 由此获由此获得了得了1947年的诺贝尔医学奖年的诺贝尔医学奖u194353年，年，Sanger确定了牛胰岛素的一级结构确定了牛胰岛素的一级结构，1958年获得年获得Nobel化学奖；化学奖；u1980年，年，Paul Berg（因（因DNA重组技术得奖）在大重组技术得奖）在大肠杆菌中表达了人胰岛素

26、。肠杆菌中表达了人胰岛素。1889年德国医学家年德国医学家Oskar Minkowski和和Josef von Mering发现切除胰腺的狗发现切除胰腺的狗出现了与人类糖尿病一样出现了与人类糖尿病一样的疾病，从而最早提出胰的疾病，从而最早提出胰腺和糖尿病发病有关。腺和糖尿病发病有关。 班廷、贝斯特和史上首次接班廷、贝斯特和史上首次接受胰岛素注射的糖尿病狗受胰岛素注射的糖尿病狗胰岛素的问世给糖尿病胰岛素的问世给糖尿病人尤其是人尤其是I I型糖尿病患型糖尿病患者带来了曙光者带来了曙光商业化胰岛素问世商业化胰岛素问世1921年胰岛素发现年胰岛素发现Frederick G.Banting (医生医生)

27、 获获1923年年诺贝尔医学奖诺贝尔医学奖 J.J.RMacleod(生理学家生理学家) 获获1923年年诺贝尔生理学奖诺贝尔生理学奖Charies HBest (学生助理学生助理) James BCollip (化学家化学家)1923年诺贝尔奖授予胰岛素的发现者年诺贝尔奖授予胰岛素的发现者为纪念四位科学家为糖尿病治疗做出的杰出贡献为纪念四位科学家为糖尿病治疗做出的杰出贡献将班廷医生的生日（将班廷医生的生日（11月月14日）定为世界糖尿病日日）定为世界糖尿病日1921年年 从狗的胰脏提取了胰岛素并用于临床从狗的胰脏提取了胰岛素并用于临床 Frederick Sanger (1918- ) is

28、 a British molecular biologist who was working on problems related to the determination of the structure of proteins. His studies resulted in the determination of the structure of insulin in 1953; for this discovery he received Nobel Prize in Chemistry in 1958. In 1965, he developed the chain termin

29、ation method, also known as the Sanger method. He later received another Nobel Prize in Chemistry in 1980 for contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids. In 1992, the Sanger Centre in Cambridge, named after Frederick Sanger, was founded by the Wellcome Trust and th

30、e British Medical Research Council, the purpose of which is stated on their website as “to provide a major focus in the UK for mapping and sequencing the human genome, and genomes of other organisms. 两获诺贝尔奖两获诺贝尔奖（仅（仅4人），人），唯一两获诺贝唯一两获诺贝尔化学奖。尔化学奖。ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE*A,*A+B, *A+B+C+D+E*

31、A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论：结论：A B C D E氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪Edman降解法降解法 Sanger法法 1958年设计年设计获获1972年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖Stanford MooreWilliam SteinPehr Victor EdmanEdman was born in Stockholm, Sweden. In 1935 he started studying medicine at Karolinska Institutet, where he became interested in basic rese

32、arch and received a bachelor in medicine in 1938. His research was interrupted by the outbreak of World War II, where he was drafted to serve in the Swedish army. He returned to the Karolinska Institutet where he earned his doctoral degree under advice from Professor Erik Jorpes in 1946. In 1950 he

33、published his first paper using the method later known as Edman degradation, to determine the sequence of a protein. To his death he continued to work to improve the method to be able to determine longer stretches with smaller amounts of sample.In 1967 he successfully developed an automated protein

34、sequencer, called the sequenator, with his assistant Geoffrey Begg.u氨基酸分析仪是进行氨基酸分离、氨基酸分析仪是进行氨基酸分离、衍生和检测的自动化分析系统，广衍生和检测的自动化分析系统，广泛用于制药、食品、饲料、农业、泛用于制药、食品、饲料、农业、育种、医学研究、临床诊断和地质育种、医学研究、临床诊断和地质考察等领域。考察等领域。 u原理：阳离子交换分离、柱后茚三原理：阳离子交换分离、柱后茚三酮衍生、可见光光度法测定。酮衍生、可见光光度法测定。 1. 样品必需纯（样品必需纯（purity 97%以上）；以上）；2. 测定蛋白质

35、的分子量；测定蛋白质的分子量；3. 测定蛋白质由几个亚基组成；测定蛋白质由几个亚基组成；4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。分子量计算每种氨基酸的个数。5. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。含量。 (1)、肽链（亚基）的拆开和分离、肽链（亚基）的拆开和分离 (2)、测定蛋白质分子中多肽链的数目、测定蛋白质分子中多肽链的数目 (3)、二硫键的断裂、二硫键的断裂 (4)、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比氨基酸成分的分子比 (5)、N端、端、C端的测

36、定端的测定 (6)、多肽链断裂、多肽链断裂 (7)、测定每个肽段的氨基酸顺序、测定每个肽段的氨基酸顺序 (8)、确定肽段在多肽链中的次序、确定肽段在多肽链中的次序 (9)、确定原多肽链中二硫键的位置、确定原多肽链中二硫键的位置测定每条测定每条多肽链的多肽链的氨基酸组氨基酸组成，并计成，并计算出氨基算出氨基酸成分的酸成分的分子比。分子比。u由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。先进行拆分。u几条多肽链借助非共价键连接在一起，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用烯醇

37、化酶为二聚体。可用8 mol/L尿素或尿素或6 mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚亚基基)。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量（可计算出摩尔数与蛋白质分子量（可计算出摩尔数之间的关系，即可确定多肽链的数之间的关系，即可确定多肽链的数目。目。常用常用6 mol/L HCl或或4 mol/L H2SO4在在105-110条件下进行水解，反应时间约条件下进行水解，反应时间约20小小时。时。优点是不容易引起水解产物的消旋化。优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是缺点是Trp被沸酸完全破坏；被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如含有羟

38、基的氨基酸如Ser或或Thr有一小部有一小部分被分解；分被分解；Asn和和Gln侧链的酰胺基被水侧链的酰胺基被水解成了羧基。解成了羧基。一般用一般用5 mol/L NaOH煮沸煮沸10-20小时。小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是该法的优点是Trp在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。u目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。

39、）已有十多种。u应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。生消旋化。水解的产物为较小的肽段。u内切酶：胰蛋白酶、胰凝乳（糜）蛋白酶、内切酶：胰蛋白酶、胰凝乳（糜）蛋白酶、u 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶u外切酶：羧肽酶和氨肽酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶颌下腺蛋白酶颌下腺蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶金黄色葡萄球金黄色葡萄球菌菌V8V8蛋白酶蛋白酶Asp-N-内切酶内切酶胃蛋白酶胃蛋白酶溴化氰溴化氰NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1uR1=Lys（K）和）

40、和Arg（R）u专一性较强，水解速度快专一性较强，水解速度快uR2=Pro（抑制）（抑制）水解位点水解位点(K和和R的的C端）端）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1uR2Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、 Leu（L）及其它疏水性）及其它疏水性AA水解速度较水解速度较快快 uR1=Pro（抑制）（抑制）upH2水解位点（芳香族氨基酸的水解位点（芳香族氨基酸的N端）端）NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1水解位点（芳香族氨基酸的水解位点（芳香族氨基酸的C端）端）uR1=Phe（F）、）、 Trp（W）T

41、yr（Y）等疏水性）等疏水性AAuLeu、Met和和His稍慢稍慢uR2=Pro（抑制）（抑制） upH8-9NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1uR2=Phe（F）、）、 Trp（W）、）、 Tyr（Y）、）、Leu（L）、）、Ile（I）、）、Met（M）、）、Val（V）及其它疏水性强的）及其它疏水性强的AA水解速度较快。水解速度较快。R2= Pro或或Gly，不水解，不水解R1或或R3=Pro，抑制水解，抑制水解水解位点（芳香族氨基酸等疏水性氨基酸的水解位点（芳香族氨基酸等疏水性氨基酸的N端）端）化学法化学法: : （1 1）BrCN-MetBrCN-Met

42、的的C C端端CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCNCH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯 （2）NH2OH（羟胺）断裂：（羟胺）断裂： 较专一性断裂较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键之间的肽键 Asn-Leu及及Asn-Ala键也能部分断裂键也能部分断裂 (3) NTCB (2-硝基硝基-5-硫氰苯甲酸硫氰苯甲酸) 裂解裂解 位点：位点： 专一裂解专一裂解 Cys 产率：产率： 90%多肽链末端氨基酸分为两类：多肽链末端氨基酸分为两类

43、：N-端氨基酸端氨基酸(amino-terminal)和和C-端氨基酸端氨基酸(carboxyl-terminal) 。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端端氨基酸分析法。氨基酸分析法。N末端：末端：1、Sanger法法2、Edman法法3、DNS-Cl4、酶降解法、酶降解法C末端：末端：1、肼解法、肼解法2、酶降解法、酶降解法3、硼氢化锂法、硼氢化锂法几条多肽链通过二硫键交联在一起，几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在可在8 mol/L尿素或尿素或6 mol/L盐酸胍存在盐酸胍存在下，用过量的下，用过量的-巯基乙醇处理，使二巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯

44、基，然后用烷基化试剂硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。化。1、过甲酸、过甲酸performic acid氧化，巯基被氧化氧化，巯基被氧化为为 CH2SO3H2、还原氧（烷）化、还原氧（烷）化 巯基乙醇，巯基乙醇，DTT 碘乙酸等碘乙酸等 S-CH2-COOH3、亚硫酸分解、亚硫酸分解Sulfitolysis R1-S-S-R2 HSO3- R1-S-SO3H + R2-S-SO3H-OOCCHCH2SHNH3+CH2OCClOICH2CNH2O-OOC CHCH2SNH3+OCCH2OCH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+

45、苯乙酰氯苯乙酰氯/ /碘乙酰胺碘乙酰胺1、Cys受空气氧化而形成受空气氧化而形成Cys-Cys2、Cys和和Cys-Cys会发生交换反应会发生交换反应3、分析氨基酸组成时，、分析氨基酸组成时，Cys容易受修饰而容易受修饰而 不利于定量不利于定量4、S-S键使蛋白酶难于作用键使蛋白酶难于作用5、Edman反应中不能形成稳定的反应中不能形成稳定的PTH-AA6、多条肽链以、多条肽链以S-S键相连，拥有两个以键相连，拥有两个以 上上N末端，无法用末端，无法用Edman法测序法测序可采用两种或多种不同的断裂方法可采用两种或多种不同的断裂方法( (如酶解、如酶解、化学断裂等）将多肽样品断裂成两套或多套肽

46、化学断裂等）将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。段或肽碎片，并将其分离开来。pH 8-9H+瑞典人瑞典人, 1916.4.14-1977.3.191946-47年在美国留学时想到改进年在美国留学时想到改进1930 年年Abderhalden & Brockmann发明的发明的 PITC试剂的反应试剂的反应, 50年发明年发明Edman degradation反应反应. Acta Chem Scand 4:283 (1950) 1957年移居墨尔本年移居墨尔本, 远离国际学术中心开始远离国际学术中心开始 过隐居生活过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每年研制

47、的自动化仪器可以达到每小时一个氨基酸的速度小时一个氨基酸的速度; 他坚持不申请专利他坚持不申请专利, 给了美给了美国公司得以随便开发仪器的方便。国公司得以随便开发仪器的方便。1972年到德国，年到德国，1977年因脑瘤过世。年因脑瘤过世。由于由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测降解产物需要在紫外域进行检测, 只有只有HPLC和相应的紫外检测手段进步后才得到普及；和相应的紫外检测手段进步后才得到普及；60年代后期年代后期Moore & Stein利用该反应测定了利用该反应测定了RNase的的一级结构一级结构, 遗憾的是遗憾的是Edman没有和他们分享没有和他们分享Nobel化化学奖

48、。学奖。DABITC：有色：有色Edman试剂试剂在在Edman试剂上加发色基团试剂上加发色基团pH 9CF3COOH/无水无水DABITC: 4-N,N-二甲氨基偶氮二甲氨基偶氮苯苯4乙内酰硫脲乙内酰硫脲PTH-AAN(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸Dansyl chloride 利用外切蛋白水解酶利用外切蛋白水解酶 (exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从将肽链的氨基酸从N端端 (氨肽酶，氨肽酶，aminopeptidase)或或C端端 (羧肽

49、酶，羧肽酶，carboxypeptidase) 一个一个接一个游离出来，接一个游离出来， 在不同时间取样在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。顺序。氨肽酶氨肽酶底物及专一性底物及专一性 (NH2-A-B)酶来源酶来源亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶（LAP）A=Leu作用最快，其次是其它作用最快，其次是其它非极性非极性aa；B=Pro时时A不能释放；不能释放；反应需反应需Mn2+、Mg2+猪肾猪肾人肝亮氨酸氨肽人肝亮氨酸氨肽酶（酶（HLA）人肝人肝氨肽酶氨肽酶M一般一般aa、碱性、碱性aa和和Pro猪

50、肾猪肾焦谷氨酰氨肽酶焦谷氨酰氨肽酶专一裂解焦谷氨酰专一裂解焦谷氨酰N-末端末端小牛肝小牛肝Pr-NH2 氨肽酶逐一内切氨肽酶逐一内切 游离游离aa优点优点: 可连续测定可连续测定N-端多个端多个aa；条件温和；条件温和缺点：酶反应通常是可逆的，水解不彻底；缺点：酶反应通常是可逆的，水解不彻底； 酶对末端酶对末端aa的反应性不同，而导致判断失误的反应性不同，而导致判断失误副反应副反应: C-端为端为Cys或胱氨酸时将被破坏或胱氨酸时将被破坏 Met转变为甲硫氨酸亚砜转变为甲硫氨酸亚砜 (Met-SO2)蛋白质吡啶蛋白质吡啶/ 3H2O /醋酸酐（醋酸酐（3:1:3,v/v） 蛋白质蛋白质C末端末

51、端C原子会被原子会被3H置换置换室温室温 12 h如果蛋白质分子中存在链间或链内二如果蛋白质分子中存在链间或链内二硫键，在多肽链的氨基酸顺序分析后，需硫键，在多肽链的氨基酸顺序分析后，需要对二硫键的位置加以确定。确定二硫键要对二硫键的位置加以确定。确定二硫键的位置一般采用胃蛋白酶水解的位置一般采用胃蛋白酶水解+对角线电泳对角线电泳方法。选用胃蛋白酶，是因为酶的专一性方法。选用胃蛋白酶，是因为酶的专一性较低、切点多、生成的肽段包括含有二硫较低、切点多、生成的肽段包括含有二硫键的肽段较小，便于后面的分离及鉴定；键的肽段较小，便于后面的分离及鉴定；酶的作用酶的作用pH在酸性范围（在酸性范围（2），有

52、利于防），有利于防止二硫键发生交换。止二硫键发生交换。u胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链u经电泳分离各肽段经电泳分离各肽段u用过甲酸断开二硫键，含有用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电的肽段带电性质发生变化，转向性质发生变化，转向90二次电泳，曾含二二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化硫键的肽段迁移率发生变化u然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。二硫键的位置。胃蛋白酶胃蛋白酶最适最适pH约约2，此时二硫键不断开，此时二硫键不断开专一性低、肽段短专一性低、肽段短H2N-CH-COOH CH2 S

53、 S CH2H2N-CH-COOH6HCOOOHH2N-CH-COOH CH2 SO3H H2N-CH-COOH CH2 SH2R-SH+6HCOOHR-S-S-R采用对角线电泳采用对角线电泳(Brown及及Hartlay，1966)，将水，将水解肽段点样在滤纸上，解肽段点样在滤纸上，pH6.5条件进行第一向电泳，肽条件进行第一向电泳，肽段按大小及电荷不同被分离。然后将滤纸暴露在过甲段按大小及电荷不同被分离。然后将滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使酸蒸气中，使-S-S-断裂，含二硫键的肽段被氧化成一断裂，含二硫键的肽段被氧化成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转90度，在

54、与第一度，在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。结果是大多数向完全相同的条件下进行第二向电泳。结果是大多数肽段的迁移率未变，将位于滤纸的一条对角上。而含肽段的迁移率未变，将位于滤纸的一条对角上。而含半胱氨磺酸对成对肽段比原来含二硫键的肽小并所带半胱氨磺酸对成对肽段比原来含二硫键的肽小并所带负电荷增加，结果偏离对角线。肽斑用茚三酮显色确负电荷增加，结果偏离对角线。肽斑用茚三酮显色确定。将每对含半胱氨磺酸对肽段分别取下（未用茚三定。将每对含半胱氨磺酸对肽段分别取下（未用茚三酮显色），进行氨基酸序列分析，再与多肽的氨基酸酮显色），进行氨基酸序列分析，再与多肽的氨基酸顺序比较，可推断二硫键在链间或

55、链内的位置。顺序比较，可推断二硫键在链间或链内的位置。对角线电泳技术对角线电泳技术ua) a) 混合肽段点到滤混合肽段点到滤纸。纸。ub) b) 第一向电泳，将第一向电泳，将产物分开。产物分开。uc) c) 用过甲酸将二硫用过甲酸将二硫键打断键打断ud) d) 进行第二向电泳进行第二向电泳ue) e) 偏离对角线的样偏离对角线的样品就是含二硫键的品就是含二硫键的片段片段Diagonal Electrophoresis断裂蛋白质及断裂蛋白质及测定肽段的序测定肽段的序列。首先测定列。首先测定氨基酸组成及氨基酸组成及N端氨基酸残端氨基酸残基；如有二硫基；如有二硫键，在肽链断键，在肽链断链前打开二硫链

56、前打开二硫键；胰蛋白酶键；胰蛋白酶水解及肽段分水解及肽段分析；溴化氰水析；溴化氰水解及肽段分析；解及肽段分析；拼接整个肽段拼接整个肽段序列。序列。根据实验结果推断多肽链的序列（给出依据，根据实验结果推断多肽链的序列（给出依据，9分。分。2012考研题）：考研题）：1、酸水解，得到的氨基酸组成为、酸水解，得到的氨基酸组成为2 Ala, Arg, 2 Lys, Met, Phe, 2 Ser。2、氨肽酶、氨肽酶/羧肽酶处理得到的氨基酸为羧肽酶处理得到的氨基酸为Ala。3、胰蛋白酶水解得到四个肽段，各自的氨基酸、胰蛋白酶水解得到四个肽段，各自的氨基酸组成为（组成为（Ala、Arg）、（）、（Lys、

57、Phe、Ser）、）、（Lys）和（）和（Ala、Met、Ser）。）。4、溴化氰水解得到两个肽段，分别的氨基酸组、溴化氰水解得到两个肽段，分别的氨基酸组成为（成为（Ala、Arg、2 Lys、Met、Phe、Ser）和）和（Ala、Ser）。）。5、嗜热菌蛋白酶（、嗜热菌蛋白酶（F等疏水性氨基酸的等疏水性氨基酸的N端）端）水解得到两个片段，氨基酸组成分别为（水解得到两个片段，氨基酸组成分别为（Ala、Arg、Ser）和（）和（Ala、2 Lys、Met、Phe、Ser）。）。从（从（1）氨基酸组成看，基本上判断该肽段为九肽）氨基酸组成看，基本上判断该肽段为九肽从（从（2）可以得出该肽段的）可

58、以得出该肽段的N/C端为端为Ala从（从（2）、（）、（3）及胰蛋白酶的专一性水解位点（）及胰蛋白酶的专一性水解位点（Lys及及Arg的的C端）可以得出如下肽段：端）可以得出如下肽段：Ala-Arg (Phe/Ser)-Lys Lys (Met/Ser)-Ala从（从（4）结合（）结合（2）可以得出）可以得出C端为端为-Met-Ser-Ala-COOH从（从（5），嗜热菌蛋白酶的专一性（），嗜热菌蛋白酶的专一性（Phe的的N端）可以得端）可以得出出C端为：端为：-Phe-(Ala, 2 Lys, Met, Ser)，结合（，结合（2）、）、（3）和（）和（4）的结果，）的结果，C端端6个氨基酸

59、的顺序为个氨基酸的顺序为-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala-COOH整合（整合（2）、（）、（3）、（）、（4）、（）、（5）及）及C端推断的结果，端推断的结果，该九肽的氨基酸序列为：该九肽的氨基酸序列为：+H3N-Ala-Arg-Ser- Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala-COO-(两两端氨基及羧基可写可不写端氨基及羧基可写可不写)根据以下实验结果，分析多肽的氨基酸序列（简要依根据以下实验结果，分析多肽的氨基酸序列（简要依据，据，7分）分）1、酸水解测得的氨基酸组成为：、酸水解测得的氨基酸组成为：Ala、2Asp、Lys、Phe和和Arg；2、用、用Sanger试

60、剂处理得到试剂处理得到DNP-Ala，羧肽酶处理得到，羧肽酶处理得到Arg；3、用胰蛋白酶处理得到两个肽段，其中之一的氨基酸、用胰蛋白酶处理得到两个肽段，其中之一的氨基酸组成为：组成为：Ala、Asp和和Lys，中性条件下所带净电荷为零；，中性条件下所带净电荷为零；另一肽段的氨基酸组成为：另一肽段的氨基酸组成为：Phe、Asp、Arg，该肽段，该肽段在在280 nm有特征吸收，中性条件下带正电荷。有特征吸收，中性条件下带正电荷。4、用胰凝乳蛋白酶处理，得到两个肽段和游离的、用胰凝乳蛋白酶处理，得到两个肽段和游离的Arg，其中的一条肽段的氨基酸组成为：其中的一条肽段的氨基酸组成为：Ala、Asp、Lys、Phe；另一条肽可以