锌对铁胁迫下小麦幼苗根抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性的影响

1、目 录摘要.21 前言.22 材料方法.42.1 植物材料的培养.42.2 酶活检测.42.2.1 APX活性的检测.42.2.2 GR活性的检测.42.2.3 蛋白含量的检测.52.3 数据分析.53 实验结果.53. 1铁锌复合胁迫对APX活性的影响.53. 2铁锌复合胁迫对GR活性的影响.54讨论.6参考文献.7锌对铁胁迫下小麦幼苗根抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性的影响XXX（西北师范大学 生命科学学院，甘肃，兰州，730070）摘要：本文以“西旱三号”小麦幼苗为材料，探究了不同浓度Zn (50 µmol · L-1、250 µmol ·

2、L-1及2 mmol · L-1)对300 µmol · L-1Fe胁迫下小麦幼苗根中APX和GR活性的变化。实验发现，单独Fe胁迫诱导了小麦幼苗根系中APX活性的升高和GR活性的降低。与单独Fe处理相比，50 µmol · L-1 Zn的加入降低了小麦根APX活性，而250 µmol · L-1和2 mmol · L-1Zn的加入明显增加了该酶的活性；不同浓度Zn的使用均明显增加了单独Fe处理下小麦幼苗根GR的活性。结果表明，Zn的加入诱导Fe胁迫下小麦幼苗根中APX和GR活性的升高，有助于缓解Fe对植物根的毒害

3、作用。关键词：锌；铁；小麦；APX；GREffect of Zn on ascorbate peroxidase and glutathione reductase activities in wheat seedling roots under Fe stressXXX（College of Life Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, Gansu, China）Abstract：The study aimed to investigate the effects of different Zinc(Zn) concen

4、trations (50 µmol · L-1、250 µmol · L-1 and 2 mmol · L-1) on the activies of APX and GR in Xihan wheat seedlings exposed to 300 µmol · L-1 iron(Fe) treatment. The results showed that single Fe stress induced the increase of APX activity and the decrease of GR activi

5、ty in wheat seedling rootsCompared with the single Fe stress, the addition of 50 µmol · L-1 Zn reduced APX activity, while 250 µmol · L-1和2 mmol · L-1Zn applied enhanced the activity of this enzyme in wheat roots. The application of different Zn concentrations significantly

6、elevated GR activity in single Fe-treated seedling roots. The results suggested that the application of zinc induced the increases of APX and GR activities in Fe-treated wheat roots, which contributed to alleviating the toxic of Fe to plant roots.Keywords：zinc；iron；wheat；APX；GR1 前言随着工农业的发展，污水灌溉、农药、除

7、草剂等的使用，大量重金属如铜（Cu）、锌（Zn）、铁（Fe）、镉（Cd）等被带入到环境中，引起环境的污染。锌是兼具营养和毒害双重效应的重金属元素，其一方面具有重要的生理功能和营养作用，在高等植物体内主要作为某些酶的专一性组份或作为某些酶的激活剂参与代谢的各种生化过程，影响DNA、RNA聚合酶进而影响核酸和蛋白质的合成，维持和稳定生物膜功能的完整性。另一方面，高浓度情况下则抑制种子萌发、植物的生长、干物质积累，降低光合色素含量和破坏光合作用等生理活动，并最终导致植物死亡1。铁是植物必需的微量元素，在植物体的光合作用、呼吸作用、固氮作用、蛋白质和核酸的合成等生理代谢过程的电子传递或酶促反应中发挥着

8、重要作用。虽然在地壳中铁元素丰度很高，但由于受土壤溶液中pH值和氧分压的影响，几乎都是以难溶于水的Fe3+形式存在，特别在石灰性土壤中（Ph7.48.5）中，植物常表现出缺铁症状。而在热带低洼地区或酸性土壤中，Fe2+又往往过量积累，使植物受到铁毒胁迫，严重影响产量2。环境胁迫如低温、高温、干旱、重金属以及盐胁迫等都会影响植物生长代谢，使植物体内发生一系列生理生化反应，同时ROS作为副产物大量生成，如果不被及时清除，ROS将会对植物造成严重的伤害3。重金属逆境胁迫可诱导植物细胞内活性氧浓度的增加而导致氧化胁迫，因而植物的抗逆性的形成往往与抗氧化酶系统活性的增强相关。抗坏血酸-谷胱甘肽循环（as

9、corbate-glutathione cycle）4在有效去除活性氧和维持细胞内谷胱甘肽稳态中具有重要作用，其由三个相互依赖的氧化还原对组成，即抗坏血酸/脱氢抗坏血酸，还原型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽GSH/GSSG，以及NADPH/NADP。谷胱甘肽水平可感知环境的变化，且激发一种上行调节机制，从而保证抗坏血酸，谷胱甘肽及NADPH库在环境胁迫下紧密的共同调节作用。其中，抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶，又是维生素C代谢的主要酶类。H2O2是植物叶绿体中光合电子传递链和某些酶反应的天然

10、产物，是具有毒害作用的活性氧5。APX 可以快速清除细胞中产生的过量的H2O2，使细胞免受活性氧毒害6。APX 在植物生长发育和逆境胁迫响应等生理过程中都发挥着非常重要的作用。谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase GR）是一种黄素蛋白氧化还原酶，它在真核生物和原核生物中都有发现，对植物来说，它在氧化胁迫反应中对清除活性氧起关键作用。谷胱甘肽水平的高低与植物对各种生物异源物质及生物与非生物环境胁迫的忍耐密切相关7。GR参与植物逆境响应代谢途径，通过改变酶活性水平及基因转录水平，降低植物体内ROS含量，从而保护植物不受氧化胁迫的危害，得以在逆境中存活8。小麦作为世界上最主要的

11、粮食之一，对重金属元素又具有一定的富集和生物转化作用9，而目前，重金属污染越来越严重，因而重金属元素对小麦的影响将越来越值得人们关注。本实验探究不同浓度Zn对单独Fe胁迫下小麦幼苗根中APX和GR活性的影响。试图探明锌与铁胁迫下小麦幼苗的抗逆机理，为深入了解和认识小麦抗重金属污染的生理生化机制提供依据。2 材料与方法2.1 植物材料的培养供试小麦“西旱3号”购自甘肃省农业科学院。挑选籽粒均匀、饱满的种子用0.1% HgCl2表面消毒10 min，流水冲洗10 h后暗中萌发24 h。种子发芽后将其整齐排列于大小一致的培养皿中，并置于24 ± 2，12 h/12 h（光照/黑暗）和300

12、 mol · m-2 · s-1条件的光照培养箱中培养，期间分别用含有300 µmol · L-1 FeCl3（Fe）、50 µmol · L-1 ZnCl2（Zn）+ 300 µmol · L-1 Fe、250 µmol · L-1 Zn + 300 µmol · L-1 Fe和2 mmol · L-1 Zn + 300 µmol · L-1 Fe的1/4 Hoagland营养液胁迫处理小麦幼苗，同时设置1/4 Hoagland营养液为对照，每

13、种处理3个重复，隔天更换处理液，待幼苗生长6 d后取材测定各个生理指标。2.2 酶活检测2.2.1 APX活性的检测APX活性检测依据Nakano和Asada10的方法，稍有修改。将小麦根置于50 mmol · L-1 PBS缓冲液（pH 7.0，内含1 mmol · L-1 EDTA-Na2 和 1 mmol · L-1 ASA）中冰浴研磨，13，000 g离心20 min后，取适量上清液加入到50 mmol · L-1 PBS（pH 7.0）和0.5 mmol · L-1 ASA混合液中，于25水浴5 min后，加入0.05%（v/v）H2

14、O2启动反应，在290 nm处以15 s为时间间隔作1 min扫描。酶活单位均为U · mg-1 protein。2.2.2 GR活性的检测小麦根组织置于50 mmol · L-1 Tris-HCl（pH 7.5）、0.1 mmol · L-1 EDTA-Na2和0.1% （w/v）PVP中冰浴研磨，然后于13, 000 g 离心30 min并收集上清液。参考Schaedle和Bassham11的方法测定谷胱甘肽还原酶（GR）的活性。将适量上清加入到50 mmol · L-1 Tris-HCl（pH 7.5, 内含3 mmol · L-1 Mg

15、Cl2 0.5 mmol · L-1 GSSG和0.15 mmol · L-1 NADPH)中，25水浴5 min后，于340 nm处以30 s为时间间隔扫描3 min，以每分钟吸光值变化0.1为一个酶活单位, 酶活单位均为U · mg-1 protein。2.2.3 蛋白含量的检测蛋白含量的检测参照Bradford12的方法，在波长595nm处测定光吸收值，并以牛血清白蛋白为标准计算蛋白含量。2.3 数据分析采用SPSS17.0软件数据进行统计和分析，采用Excel2007软件完成数据整理与制图，结果用平均值±标准误差表示，P<0.05表示有显著

16、性差异。3 实验结果3.1 不同浓度Zn对Fe胁迫下小麦幼苗根APX活性的影响 图1 不同浓度Zn对Fe胁迫下小麦幼苗根APX活性的影响Fig.1 Effect of zinc on APX activity in wheat seedlings root under iron treatment图中不同小写字母表示各处理间差异显著（P<0.05）.Different lowercase indicate significant difference at 0.05 level (the same as below) 由图1可知，在300 µmol · L-1的Fe处

17、理时，APX的活性略高于对照组。与单独Fe胁迫相比，50 µmol · L-1 Zn的加入导致APX活性的降低；而250 µmol · L-1和2 mmol · L-1Zn的使用明显增高了单独Fe胁迫下APX的活性，并且与铁单独胁迫时相比分别升高约55%和42%。3.2 不同浓度Zn对Fe胁迫下小麦幼苗根GR活性的影响图2 不同浓度Zn对Fe胁迫下小麦幼苗根GR活性的影响Fig.2 Effect of zinc on GR activity in wheat seedlings root under iron treatment由图2可以看出，

18、与未处理的小麦相比，单独Fe处理明显抑制了小麦幼苗根中GR的活性。与单独Fe处理相比，不同浓度Zn(50 µmol · L-1、250 µmol · L-1及2 mmol · L-1)的使用均明显增加了小麦根GR活性。其中250 µmol · L-1Zn + Fe处理下的根GR活性最高，与单独Fe胁迫相比升高了约181%。4讨论植物在受到重金属胁迫时，其体内的活性氧浓度会随之增加，因而所受的重金属胁迫主要是活性氧造成的氧化胁迫，而抗坏血酸-谷胱甘肽循环在有效去除活性氧和维持细胞内谷胱甘肽稳态中具有重要作用。谷胱甘肽-抗坏血酸

19、循环主要存在于植物叶绿体，其作用是除去光反应中产生的大量过氧化氢。质体谷胱甘肽-抗坏血酸循环中四种酶也具高的活性和广泛作用。可见，谷胱甘肽-抗坏血酸循环是光合细胞器中主要的过氧化氢代谢途径13，在植物线粒体中也存在一完整的类似于叶绿体中的抗坏血酸-谷胱甘肽循环14。有关其对非生物逆境胁迫的响应，近几十年来有不少学者进行研究且取得了一定的进展。Hu等15研究两种不同基因型的多年生黑麦草（Lolium perenne L.）对不同浓度盐胁迫的响应，用250 mmol/L的浓度分别处理盐耐受型和敏感型的黑麦草植株12d。结果表明，盐耐受型的植物在处理4d后，叶片中SOD和APX的活性都非常高。有研究

20、表明，低浓度AI处理下，Scuot和“扬麦9号”根系还原型抗坏血酸含量有所升高，表明Al敏感品种根系在较轻Al胁迫下抗坏血酸介导的抗氧化能力增加。而在高浓度Al处理下，Scuot和“扬麦9号”根系还原型抗坏血酸含量有不同程度的降低，同时根系质外体APX活性显著降低16。这些都说明在非生物逆境胁迫下，APX活性增加对植物抵抗不良环境起着积极的作用17。而 APX 被认为是植物中清除过氧化氢非常重要的一种过氧化物酶。APX主要存在于叶绿体内，依赖于抗坏血酸将叶绿体内H2O2转化为水，并产生脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸在DHAR与GR作用下重新转化为抗坏血酸，这就是植物体内一条重要的活性氧清除途径18

21、。本实验中，在铁单独胁迫时，APX的活性略高于对照组。与单独Fe胁迫相比，50 µmol · L-1 Zn的加入导致APX活性的降低；而250 µmol · L-1和2 mmol · L-1Zn的使用却明显导致了APX活性的增高，与铁单独胁迫时相比分别升高约55%和42%，这可能是由于250 µmol · L-1和2 mmol · L-1浓度的锌在一定程度上缓解了铁的胁迫作用。多种逆境条件均能诱导GR酶活性发生不同的变化。且GR酶活性的变化随物种品种逆境条件的不同而不同。在抗性品种中，GR酶活性增加，且始终维持较敏

22、感型植物中较高的酶活性，而在胁迫敏感型植物中GR酶活性则减小19。在植物已发现的抗氧化剂中，抗坏血酸含量最为丰富14，其维持细胞的氧化还原态。植物中的抗坏血酸浓度在10300 mmol的范围内。在对西红柿叶的研究中也得到了相似的结论，低浓度Zn的添加缓解并增加了Cd胁迫下SOD、CAT、APX和GR的活性20。另有研究表明，在Zn胁迫处理下，田菁21和番茄22体内抗氧化酶SOD和APX活性均升高。本实验中，单独Fe处理时GR的活性低于对照组，明显抑制了小麦幼苗根中GR的活性。与单独Fe处理相比，不同浓度Zn(50 µmol · L-1、250 µmol ·

23、; L-1及2 mmol · L-1)的使用均明显增加了小麦根GR活性。其中250 µmol · L-1Zn + Fe处理下的根GR活性最高，与单独Fe胁迫相比升高了约181%。植物重金属伤害及抗性机理十分复杂，其耐性性状可能是由多个基因控制的。前人认为抗氧化酶活性的维持和提高是作物耐受铁锌胁迫的物质基础之一23,24。本实验仅从APX和GR活性方面分析了小麦幼苗根对抗逆性的原因，但其深入的毒害机制还需从细胞、分子水平上作进一步研究。参考文献：1 刘家忠，龚明植物抗氧化系统研究进展J云南师范大学学报，1999，19(6):1-112 POTTERS G，HOREM

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