ConditionalReprogrammingcell(CRC)

1、Conditional Reprogramming cell(CRC)茵冠生物 技术部 谢亮 内内 容容CRC的研究应用CRC、ESC和IPSC区别与比较CRC技术的特点CRC细胞的制备操作CRC技术细胞基简介当前实验室利用CRC培养细胞存在的问题一、CRC技术基本简介1、背景 美国乔治城大学医学院细胞重编程中心实验室主任华人教授刘学锋，于2012年发现及命名的细胞技术，揭示了分化细胞能够在一定条件获得干细胞样特性，使细胞永生化，具有转化医学、个性化医学和活的生物银行的未来的前景，将会为肿瘤个体化诊疗、临床研究以及抗癌药物研发带来具大的影响。该技术已在NIH、哈佛大学、耶鲁大学、杜克大学、斯坦

2、福大学、麻省总医院、Mayo医学中心、Novartis等近百所世界一流大学和研究所研究与应用，并且不断在PLOS ONE、STEM CELL、RESEARCHGate等著名期刊网站进行研究报道。2、定义 在体外细胞培养物中，通过添加rock 抑制剂（Y-27632)，和辐射处过的饲养层细胞（一般为成纤维细胞），在不改变基因型的情况下使已分化的细胞再次获得干细胞样特性，使细胞永生化，具有无限增殖功能，当条件去除时，干细胞重新转变成初始分化细胞，表现出专一性分化潜能。 Y-27632:丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族的小分子特异性抑制剂，作用：调节细胞骨架的重构，激活转录因子，促进细胞增殖。3、两个条件

3、1）ROCK 抑制剂 - Y-27632ROCK抑制剂l 均为小分子有机化合物。l 作用于催化结构域的 ATP 结合位点，有松弛平滑肌的作用。l ROCK抑制剂有几十种，但目前上市使用有：Y- 27632 、法苏地尔、 羟基法苏地尔。ROCK抑制剂化学结构Y-27632化学结构2）饲养层细胞定义：指一些特定细胞(如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞)，经有丝分裂阻断剂(常用丝裂霉素)处理后所得的细胞单层。饲养层细胞大部分使用MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)。作用：模拟体内环境，提供实验细胞更好的营养及促进细胞间的联系；饲养层细胞不分裂不增殖而仍保持代谢活性，是细胞培养，尤其是

4、胚胎干细胞培养常用的生长增殖促进剂和分化抑制剂。二、CRC的制备操作1、实验前准备工作 1）试剂 增殖培养基、Y-27632试剂、分化培养基、胰蛋白酶 2） 设备与耗材 移液管、T75培养瓶、离心管、孔板、移液枪、生物安全柜、CO2培养箱、 倒置显微镜 3） 细胞 子宫颈上皮细胞、辐射处理过的小鼠j2成纤维上皮细胞2、制备操作（子宫颈上皮细胞为例） 手术得到目标细胞； 细胞分离后，加入辐射处理过的鼠成纤维饲养 层细胞的F培养基中（含10G Y-27632)； 细胞每3-4天进行传代，快速扩增； 胰蛋白酶消化处理，收集； 细胞纯化，去除饲养层细胞，获得较纯的目标细胞 传代：CRCs（4.2*10

5、5,T75培养瓶）与新鲜辐 射的成纤维饲养层细胞按1：10接种，培 养3 天；或CRCs（2.1*105,T75培养瓶） 与新鲜辐射的成纤 维饲养层细胞按1：20 接种， 培养4天；3、质控检测细菌真菌支原体内毒素细胞活率及细胞倍增次数核型分析（检测是否发生基因型改变或者致瘤）细胞表面抗原诱导分化 三、CRC的特点l 操作简单，快速，少量的细胞可大量增殖（可低于4-6个细胞）l 谱系定向，专一性分化，初始细胞重编程为干细胞样细胞后，只能分化为该初始细胞l 可逆性，分化细胞与干细胞样细胞可相互转化l 基因型稳定，不会发生基因型改变，并且不具有致瘤性l 高表达整合素6、1, Np63, CD44,

6、 hTERT, 核-环蛋白；低表达 Sox2（胚胎干细胞关键蛋白）, Oct4（干细胞因子）, and Nanog（胚胎干细胞关键蛋白），后者在胚胎干细胞及诱导多能干细胞ips 中高表达。CRC细胞表面抗原表达情况定量分析四、CRC、ESC和IPSC区别与比较ESCIPSCCRC细胞来源卵细胞和精细胞结合形成受精卵，受精卵细胞分裂，形成早期的胚胎，从而分离出来的一类细胞通过加入基因操纵成体细胞生成的细胞，具有分化能力，能够转变成新的成体细胞类型特定来源的细胞，给予某些条件使其具有该特定来源的干细胞特性，然后使得该干细胞扩增。当细胞扩增达到一定数量，撤除条件，使细胞逆转为原分化的细胞功能发育成新

7、个体，或各组织器官分化成各类型细胞及形成各组织器官定向分化为原初始细胞是否发生基因型改变不改变改变不改变分化后是否可逆不可逆不可逆可逆优缺点优点ESC细胞能够应用于各种疑难杂症，克隆完整个休、器官组织，细胞治疗使用的是成体细胞，无伦理学问题，并且自体细胞无排斥反应操作简单，起始细胞量少，周期短，基因型不发生改变，不具有致瘤性，并且谱系定向，可选择性培养我们需要的细胞缺点存在伦理问题，不易获得，并且具有致瘤性成功率低，具有致瘤性，并且难于控制这些分化形成的细胞类型只能单一性分化，不能分化为形成类型细胞或者发育成完整个体五、CRC的研究应用1、CRC在肿瘤中的应用 肿瘤细胞利用CRC技术，在体外培

8、养扩增，得到大量的肿瘤细胞，用于各种肿瘤药物药敏试验、生产肿瘤疫苗、研究基因水平的调控机制及个性化的肿瘤临床治疗。2、CRC在组织修复中的应用 利用CRC技术，提供3-D组织或者器官模型，分化的细胞变成干细胞样后在模型构架上进行扩增，最后形成该模型的组织或者器官，进而移植体内，可对组织或者器官进行修复。3、CRC在疾病中的应用 在糖尿病患者身上，取得胰腺中少量剩余的胰岛细胞，利用CRC技术进行体外扩增，达到一定细胞数量后移植回胰脏，从而胰脏再次获得分泌胰岛素的功能。 还可用于治疗因肝酶缺乏引起的许多贮积病，在这些情况下，取出少部分肝细胞，插入正常基因进行修复细胞基因表达情况，然后细胞进行扩增，

9、最后细胞移植回患者体内，从而使肝酶引起的疾病得到治疗。六、当前实验室培养CRC细胞存在的问题例：利用CRC技术培养淋巴细胞方案: 1）采购Y-27632、DMEM/F12等重要试剂； 2）培养小鼠成纤维饲养层细胞，并且电离辐射处理； 3）采集外周血，分离单个核细胞，加入辐射处理的饲养层细胞表面，并 且添加培养基及Y-27632Y试剂，CO2培养箱中培养； 4）培养过程中观察细胞形成，多次传代，细胞增殖达到一定量后，收 集，流式检测表面抗原及诱导分化，检测细胞表型及分化情况；存在的问题： 1）培养CRC细胞的同时需要培养小鼠成纤维细胞，并且电离辐射阻断细胞分裂， 操作繁琐；因辐射处理阻断小鼠成纤维细胞分裂，细胞