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文档简介
1、1 材料E.coli JM109菌株2 仪器、用具超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器3 试剂(1 CaCl2、LB平板(见附录;SOC培养基(见附录;SOB培养基(2 RNase A1;Buffer S1;Buffer S2;Buffer S3;Buffer W1;无水乙醇的Buffer W2a(3 1×电泳缓冲液(TAE;溴化乙锭溶液(EB有毒,小心;琼脂糖;6×加样缓冲液(4 酚;氯仿;异戊醇(5 ddH2O;10×PCR Buffer (Mg2 plus;dNTP;M13 ;M13-
2、;TaKaRa rTaq酶4 方法1. 大肠杆菌感受态细胞的制备(1 取大肠杆菌JM109保存液50l,接种于4ml LB(或SOB液体培养基中,37,300rpm 振荡培养过夜,第二天取50l 转接到新的4ml LB(或SOB液体培养基中扩大培养3h至OD6 00=0.350.4,在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中,冰浴10min。(2 4,5000rpm离心2min,去上清液。(3 加入750l预冷的0.1M CaCl2重悬菌体,冰浴30min。(4 4,5000rpm离心2min,弃上清液。(5 加入100l 冰冷的0.1M CaCl2轻轻重悬菌体,冰浴2h后,4保存备用。2
3、. 重组DNA的转化(1 将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37预热。(2 于100l感受态细胞中加入10l连接产物,冰浴30min。(3 将离心管转入42水浴,热冲击90秒,然后不要摇动离心管,迅速将其放在冰上2min。(4 在离心管中加入SOC培养基300l,枪头混匀,37、150rpm温和摇振60min。(5 将200l 转化菌液均匀地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB 平板上,37倒置培养过夜,挑选白色菌落进行鉴定。注意事项: 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作,同时注意近火无菌操作,防止感受态细胞受杂菌污染。 4
4、2热处理时很关键,转移速度要快,且温度要准确。 菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率。3.重组质粒的鉴定方案一菌落PCR(1 制备PCR混合液:(2 用经灭菌的10l枪头(不用牙签挑去白色菌落,迅速地使挑取物溶在上述混合液中。(3 盖上离心管得盖子,在沸水上温育10 min。(4 将步骤 的样品冷却至室温,离心数秒,然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。(5 按以下条件进行PCR反应:94预变性3min;然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:94变性1min,57退火1min,72 延伸1min;循环结
5、束后72再延伸5min。(6 取5l PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。方案二质粒PCR1. 碱裂解法少量制备质粒DNA(1 用离心管收集4ml在LB培养基(含Amp中培养过夜的菌液,14000rpm离心30秒,弃尽上清。(2 用250l已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。(3 加入250l Buffer S2,温和但充分地上下翻转混合4-6次,此步骤不宜超过5min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖,以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH,降低溶菌效率。(4 加入400l Buffer S3,温和地上下翻转8-10次,室温静置2min,14000rpm离心10min。*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部,应再上下翻转数次,12000g离心3min。(5 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中,将步中的混合液移入DNA-prep Tube 中,5500rpm离心1min。(6 弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中,加入500l Buffer W1, 5500rpm离心1min。(7 弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中,加入700l已加无水乙醇的Buffer W2,5500rpm离心1min
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