还原型谷胱甘肽对培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响

1、还原型谷胱甘肽对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响                 作者：王进，王一彪，杨海英，赵丽丽，孔春妍【摘要】  目的  研究还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤的影响。方法  建立心肌细胞A/R损伤模型，随机分为组：A组，正常对照组；B组，单纯缺氧/复氧(A/R低氧2h，复氧1h)组；C、D、E组为还原型谷胱甘肽处理组，加入还原型谷胱甘肽(GSH)分别使其终浓度为

2、40、80、160 mg/L，后A/R。于复氧后测定各组培养液中乳酸脱氢酶(LDH)变化及细胞内丙二醛(MDA)含量和细胞存活率。结果  与正常组相比，单纯低氧/复氧组LDH漏出量、MDA水平显著升高(P<0.01)，细胞存活率显著降低(P<0.01)。与缺氧/复氧组比较，各谷胱甘肽处理组上述变化明显减轻(P<0.05)。结论  还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞A/R损伤具有保护作用，并具有浓度依赖性。    【关键词】  还原型谷胱甘肽  心肌细胞  缺氧  复氧  &

3、#160; The effects of reduced glutathione sodium on anoxia/reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes    【Abstract】  Objective  To study the effects of reduced glutathione sodium(GSH)  on  anoxia /reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes.Meth

4、ods  A/R model of myocardial cells of neonatal rats was established. The cells of neonatal rats  were randomly divided into five groups: control group(A): without any treatment; A/R group(B):2-hour anoxia followed by 1-hour reoxygenation; GSH conditioned group(C):adding GSH into culture me

5、dium till the final concentration of 40mg/L then A/R; GSH conditioned group (D):adding GSH into culture medium till the final concentration of 80mg/L then A/R; GSH conditioned group (E):adding GSH into culture medium till the final concentration of 160mg/L then A/R. The activity of lactate dehydroge

6、nase(LDH)，the contents of cellular  melondadehyde(MDA) and the rate of cell viability of each group were evaluated after reoxyenation.Results  Compared with group A，the A/R group showed a great increase in levels of LDH，MDA and a decrease in the rate of cell viability(P<0.01). Compared

7、with group B，the GSH conditioned groups significantly attenuated these changes(P<0.05).Conclusion  GSH could be a protective effect on A/R injury of neonatal rat cardiomyocytes in a concentration dependent manner.    【Key words】 reduced glutathione sodium cardiomyocytes anoxia

8、 reoxygenation    1  与方法    1.1    1.2  乳鼠心肌细胞培养  无菌取出生13天大鼠乳鼠心脏，剪碎后用0.25胰酶消化45次，取除第1次以外的上清，用含15胎牛血清的高糖DMEM 中止消化，离心取心肌细胞沉淀，加入培养液，集中混匀制成悬液，应用差速贴壁法分离纯化心肌细胞，以5×105/ml的培养密度接种于孔培养板中， 在CO培养箱中培养，48h后换液。    1.3  实验分组及操作程序&#

9、160; 试验分为组，每组重复孔，A组为正常对照组（培养板置培养箱中持续孵育3h结束实验）；B组为单纯缺氧复氧组（A/R  缺氧2h，复氧1h）：将培养板置于充有99.氮气的缺氧孵育器中37密闭培养2h，再以5氧气二氧化碳进行复氧1h；C组，D组，E组为古拉定处理组，加入古拉定使其终浓度分别为40、80、160mg/L。各组缺氧前、复氧前均给。    1.4  实验检测指标  (1)计数细胞搏动：在倒置显微镜观察并计数心肌细胞搏动的频率及节律。(2)细胞存活率计数：采用台盼蓝排斥法检测，各组取少许细胞混悬液，0.4%台盼蓝混匀2min

10、，按白细胞计数法在光镜下计数蓝染细胞。台盼蓝摄取率蓝染细胞（蓝染细胞未蓝染细胞）×100%。(3)LDH及MDA活性及含量测定：实验结束后按试剂盒说明测定。    1.5  学方法  数据以均数±标准差(x±s)    2  结果    2.1  古拉定对缺氧/复氧心肌细胞搏动的影响  正常培养对照组心肌细胞搏动相对恒定，节律规则；A/R组心肌细胞搏动频率减慢，搏动幅度减弱，节律不齐，有部分停搏，与对照组相比，差异有非常显著性

11、（P<0.01)；各古拉定处理组明显逆转A/R 损伤造成的搏动频率和节律异常，与A/R 组比较差异有显著性（P<0.05)。    2.2  古拉定对心肌细胞缺氧/复氧损伤LDH及MDA的影响  结果表明，A/R心肌损伤是十分明显的，而古拉定能明显减轻这种损伤，古拉定处理组各观察指标均差异有显著性，因此提示古拉定对于缺氧复氧心肌细胞损害具有保护作用，且存在量效关系，见表1。    表1  还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤LDH及MDA的影响  (x±s) 

12、;   注：B组与A组比较，P0.01；与B组比较，*P0.01；与B组比较，*P0.05    3  讨论    3.1  还原型谷胱甘肽对缺氧复氧心肌细胞损伤的影响  大量研究表明，缺血再灌注期间大量氧自由基的产生可造成细胞损伤。氧自由基导致细胞损伤主要环节为作用于细胞外基质，使胶原和透明质酸崩解，使膜磷脂结构的多聚不饱和脂肪酸过氧化而直接损伤细胞膜；肌浆网和线粒体崩溃，心肌细胞在缺氧缺糖条件下，ATP产生减少，代谢障碍，代谢产物堆积，使膜稳定性降低，溶酶体释放，导致生物损伤、变性

13、，使LDH释放在培养基中，同时再给氧时氧自由基增加，细胞膜受攻击，细胞膜损伤。细胞内LDH进一步增加，故LDH释放量是观测缺血再灌注损伤重要指标。脂质过氧化产物丙二醛(MDA)，其含量变化可作为评定自由基生成及对膜脂质双层结构破坏的指标。本实验从培养的未成熟鼠心肌细胞入手，排除了在体和离体灌注模型中神经、体液因素及其他混杂细胞因素的影响，直接利用还原型谷胱甘肽处理培养的未成熟鼠心肌细胞，结果发现还原型谷胱甘肽各浓度组均可降低缺氧复氧损伤造成的心肌细胞死亡率，减少细胞内LDH漏出，减少细胞内MDA生成，且存在量效关系，表明还原型谷胱甘肽对未成熟鼠心肌细胞有保护作用。  

14、60; 3.2  还原型谷胱甘肽对缺氧复氧心肌细胞损伤的保护机制  还原型谷胱甘肽(GSH)对清除自由基有重要作用，它是机体内一种重要的抗氧化剂，它能有效清除氧化产生的自由基，维持细胞内的稳定，并在使暴露于氧化环境的组织免受自由基损害方面起重要作用4。GSH在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的作用下对有机过氧化物(ROOH)和无机过氧化物(H2O2)起重要清除作用，其还可以起维生素C还原剂的作用，使维生素C成为还原型而不断清除超氧自由基。近期有研究表明5，GSH可维持线粒体内膜巯基基团的还原状态。当GSH含量下降，内源性自由基攻击线粒体蛋白巯基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影响线粒体氧化代谢的3个关键酶及传递链中酶的活性，NADH减少，ATP产生减少。另一方面，导致膜蛋白巯基氧化交联，构型改变，线粒体膜渗透性转运通道打开，钙释放增加，胞浆钙上升，激活细胞膜PLA2和中性蛋白水解酶(CANP)，导致细胞膜的损伤或死亡。本实验表明补充外源性GSH，对保护细胞膜的功能可能具有重要意义，对临床各种疾患造成的心肌细胞缺氧复氧损伤有保护作用。