分子发光分析法

1、第一页，共99页。第二页，共99页。较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量量受激受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量第三页，共99页。荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法第四页，共99页。 采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低24个数量级个数量级激发激发发射荧光发射荧光强强强强第五页，共99页。第六页，共99页。第七页，共99页。电子基态电子基态第一电子激发态第一电子激发态转动能极跃迁转动能极跃迁振动能级跃

2、迁振动能级跃迁电子能级跃迁电子能级跃迁第八页，共99页。 、n第九页，共99页。第十页，共99页。S0S1 S0T1 第十一页，共99页。S0S2S1T1第十二页，共99页。第十三页，共99页。 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁辐射跃迁(发发光光)和和无辐射跃迁无辐射跃迁等方式失去能量；等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的

3、几率大，发光强发光强度相对大。度相对大。第十四页，共99页。当当两个电子能级两个电子能级非常靠近以至其振动能级有非常靠近以至其振动能级有重叠重叠时，时，S2 S1、T2-T1速率极大，速率极大， 10-14 10-12s 完成。完成。无论分子被激发到哪个激发单重态，均通过内转换和振动弛无论分子被激发到哪个激发单重态，均通过内转换和振动弛豫，跃回豫，跃回第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级。第十五页，共99页。第十六页，共99页。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃第十七页，共99页

4、。（ 多为多为 S1 S0跃迁跃迁），第十八页，共99页。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光图图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃第十九页，共99页。第二十页，共99页。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 磷光磷光图图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图分子荧光、磷光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃VR第二十一页，共99页。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射

5、射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫第二十二页，共99页。I固定固定固定测量波长为荧光（或磷光）最大固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长发射波长 ，然后改变激发波长，然后改变激发波长，根据激发光波长，根据激发光波长对荧光（磷对荧光（磷光）强度光）强度I作图得作图得 激发光谱曲线激发光谱曲线。 激发：激发：excitated发射：发射：emission 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大第二十三页，共99页。激发光谱曲线：激发光谱曲线： 吸收曲线：吸收曲线： 两者在性质上是不同的两者在性质上是不同的I固定

6、固定第二十四页，共99页。I固定固定固定激发光波长固定激发光波长由于不同物质具有不同的特征发射由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质鉴别荧光物质第二十五页，共99页。吸收峰荧光峰磷光峰第二十六页，共99页。第二十七页，共99页。 a. Stokes a. Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发射光谱的波长比激发光谱的长，发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。 b. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 不管激发波长如何，分子受

7、激后可到达不同能层的激发态，不管激发波长如何，分子受激后可到达不同能层的激发态，但通过去活化（内转换和振动弛豫），电子都是从第一电子激发但通过去活化（内转换和振动弛豫），电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。 c. . 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。）成镜像对称关系。 第二十八页，共99页。第二十九页，共99页。 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似。能级分布

8、类似。激发：基态激发：基态第一激发态各振动能级，振动能级越第一激发态各振动能级，振动能级越 高，能级差越大，波长就越短。高，能级差越大，波长就越短。发射荧光：从第一激发态的最低振动能级发射荧光：从第一激发态的最低振动能级基态的各基态的各 振动能级，基态的振动能级越高，其能量振动能级，基态的振动能级越高，其能量 差越小，波长就越长。差越小，波长就越长。吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越高，波吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越高，波长越长。互为镜像长越长。互为镜像第三十页，共99页。 基态上的零基态上的零振动能级与第一振动能级与第一激发态的振动能激发态的振动能级之间的跃迁几级之

9、间的跃迁几率最大，相反跃率最大，相反跃迁也然迁也然。 第三十一页，共99页。第三十二页，共99页。发荧光的分子数发荧光的分子数激发态分子总数激发态分子总数第三十三页，共99页。ifffKKK第三十四页，共99页。总之，总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。第三十五页，共99页。 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400苯苯萘萘蒽蒽 350菲菲线状环结构比非线状结构线状环结构比非线状结构的荧光波长长的荧光波长长第三十六页，共99页。 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光荧光

10、多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定 3，4 - 苯并苯并芘是强致癌物芘是强致癌物第三十七页，共99页。荧光素：氧桥把两荧光素：氧桥把两个环固定在一个平个环固定在一个平面上，具有平面结面上，具有平面结构，强荧光物质构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很个环固定，不能很好的共平面，为非好的共平面，为非荧光物质荧光物质第三十八页，共99页。反式：平面构型 强荧光体顺式：非平面构型 非荧光体第三十九页，共99页。第四十页，共99页。第四十一页，共99页。第四十二页，共99页。第四十三页，共99页。第四十四页，共99页。第四十五页

11、，共99页。例：例： 苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无无荧光荧光第四十六页，共99页。例：例： 苯酚苯酚有荧光有荧光无荧光无荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性第四十七页，共99页。 自吸现象自吸现象：内滤光中的一种，化合物的荧光发射光谱的短波长端与其：内滤光中的一种，化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色氨酸中的重铬酸钾；色氨酸中的重铬酸

12、钾；第四十八页，共99页。第四十九页，共99页。第五十页，共99页。M 非辐射跃迁非辐射跃迁吸收hM发射荧光 hM M+热热 碰撞猝灭碰撞猝灭第五十一页，共99页。第五十二页，共99页。第五十三页，共99页。第五十四页，共99页。第五十五页，共99页。荧光池荧光强度检测器IIA0lg将上式展开! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff第五十六页，共99页。! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff当当A0.05时，时，第五十七页，共99页。第五十八页，共99页。与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同两个单色器两个单色器检测器与激发光

13、互成直角检测器与激发光互成直角光源光源第一单色器第一单色器激发单色器激发单色器液池液池检测器检测器第二单色器第二单色器发射单色器发射单色器检测器检测器放大器及记录器放大器及记录器第五十九页，共99页。第六十页，共99页。应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源第六十一页，共99页。第六十二页，共99页。第六十三页，共99页。第六十四页，共99页。第六十五页，共99页。 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差同步扫描可分为固定波长差(ll)和固定能

14、量差及可变波长三种：和固定能量差及可变波长三种：1、固定波长差同步扫描荧光法、固定波长差同步扫描荧光法 ll l lex- l lem常数常数2、固定能量差同步扫描荧光法固定能量差同步扫描荧光法 使发射单色器与激发单色器之间保持一个恒定的波数差使发射单色器与激发单色器之间保持一个恒定的波数差3、可变波长同步扫描荧光法、可变波长同步扫描荧光法 使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描常数710)11(emexll第六十六页，共99页。 同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。，减少光谱重叠，提

15、高分辨率。 合适的合适的ll可可减少光谱重叠：减少光谱重叠：酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但发射光谱严重重叠，但ll15nm60nm60nm时，只时，只显示显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。色氨酸的特征光谱，实现分别测定。第六十七页，共99页。第六十八页，共99页。第六十九页，共99页。第七十页，共99页。磷光仪器在荧光仪磷光仪器在荧光仪样品池上增加磷光样品池上增加磷光配件：配件：低温杜瓦瓶低温杜瓦瓶和斩光片和斩光片。如右图。如右图所示。斩光片的作所示。斩光片的作用是利用其分子受用是利用其分子受激所产生的荧光与激所产生的荧光与磷光的寿命

16、不同获磷光的寿命不同获取磷光辐射取磷光辐射第七十一页，共99页。第七十二页，共99页。第七十三页，共99页。第七十四页，共99页。第七十五页，共99页。第七十六页，共99页。缺VB2会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎维生素维生素B2第七十七页，共99页。第七十八页，共99页。第七十九页，共99页。第八十页，共99页。第八十一页，共99页。第八十二页，共99页。激发态分子数发射的光子数参加反应的分子数激发态分子数参加反应的分子数发射光子的分子数frCL激发态分子的化学效率化学效率激发态分子的发光效率发光效率取决于发光所依据的化学反应本身取决于发光所依据的化学反应本身第八十三页，共99页。dtdc

17、tICLCL)(对下列化学发光反应对下列化学发光反应 A +B C* +D C + h第八十四页，共99页。Ackdtdc1nt 时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比n化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用发光总化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用发光总强度来定量分析强度来定量分析ACLCLCLcdtdtdcdtIS发光总强度ACLCLCLckdtdctI1)(第八十五页，共99页。第八十六页，共99页。NHNHOONH22NHCOOCOO*OH-COOCOONH2+hv氧化剂（氧化剂（ H2O2 ）425 nm 反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲