南方医科大学肝糖原提取2015级临床医学二第3实验室

1、生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 级第二临床医学院 临床医学 组 别： 第7实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定、分离实验日期2016-12-29实验地点第7实验室 指导老师陆远芳评分教师签名批改日期1、 实验目的1、 掌握组织样品的制备方法并了解相关注意事项。2、 掌握肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和操作方法以及相关注意事项3、 掌握正确使用可调微量取液器与刻度吸管的方法。4、 正确行使溶液转移作业。5、 掌握分光光度计的正确用法。2、 实验原理1、肝糖原提取储存于肝细胞内的糖原在对肝细胞采用淹没匀浆等方法破碎细胞并在低浓

2、度的三氯醋酸环境中让肝组织中的酶被破坏、蛋白质被沉淀析出后，能稳定地保存在上清液中。以此让糖原与其他组分分离。糖原溶于热水而不溶于乙醇，故先用95%乙醇沉淀绿叶中的糖原，再溶于热水中。2、糖原的鉴定糖原水溶液为乳样光泽，遇碘变红棕色。糖原葡萄糖长链分子间引力吸附碘分子后呈现出的颜色。糖原尚可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。反应式如下：CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)22Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O2CuOH = H20 + Cu2O (红色)Cu(OH)2 = H2O

3、+ CuO (黑色)3、肝糖原定量浓酸中，糖原水解成葡萄糖，浓硫酸使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物，即5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处呈现最大吸收峰。糖含量于10100mg范围内时，溶液颜色的深浅正比于可溶性糖含量。利用此反应下的实验现象与同样处置后的已知糖含量的葡萄糖标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中稳定，故在显色之前，肝组织宜先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。3、 实验材料l 仪器：1、 普通离心机，室温-100恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为 10mg级电子天平2、 剪刀、

4、镊子、研钵3、 试管架，离心管，试管4、 刻度吸量管（2ml ,5ml），1000l微量可调取液器5、 100ml容量瓶6、 白瓷反应板l 试剂：鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）蒽酮显色剂4、 实验步骤l 肝糖原的提取加入5%CCl3COOH 1ml加入5%CCl3COOH 3ml加入蒸馏水2ml鸡肝约1.5g，剪碎 研磨至乳状研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心3min（4000r/min）取上清液加入5ml 95%乙醇，混

5、匀，静置10min离心5min（4000r/min）取沉淀沸水浴2min，溶解沉淀+50% NaOH 0.2ml+班氏试剂0.2ml(4d)+浓HCl 0.2ml 糖原溶液1ml白瓷板中 沸水浴加热15min，冷却 加碘试剂0.1ml 加碘试剂0.1ml 蒸馏水 0.1ml 糖原溶液0.1ml糖原水解液0.1ml（2d） 糖原水解液呈色对比 混匀沸水浴2min，观察变化l 注意事项：1、 提取肝糖原时：向上清液中加入等量的95%乙醇后，必须混匀。因上清液为水溶液，密度比95%乙醇大，析出液分两层。又：上清液已多于4ml，加入等量乙醇后，总量近9ml，混匀操作较困难，宜用倾倒混匀，或以玻棒搅拌混

6、匀。2、 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有相关性。葡萄糖残基20个以下时使碘呈红色，20-30个之间碘呈紫色，60个以上时碘呈蓝色。淀粉中因分支链长，呈蓝色；肝糖原分枝葡萄糖残基在20个以下（常为8-12个），吸附碘后为红棕色。3、 糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。肝糖原定量测定鸡肝 0.15 g+30% KOH 1.5ml沸水浴15min冷却，全部转入100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液取3支干净的试管，按下表操作：试剂（毫升）空白管标准管样品管蒸馏水1.0标准葡萄糖溶液1.0糖原提取液1.0蒽

7、酮溶液（0.2%）2.52.52.5混匀，沸水浴10min后冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处，用空 白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）.计算：肝糖原（g/100g肝组织）= × × × 1.11× 0.05 5、 实验现象与结果讨论鸡肝肝糖原成分的定性测定步骤简述实验现象鸡肝约1.5g，剪碎两次加入CCl3COOH研磨至乳状研磨成肝匀浆肝脏碎片研磨之后呈灰黄色，两次加入试剂后均无明显变化全部转入离心管中，离心3min（4000r/min）试剂分层：上层为透明无色液体，下层为灰黄色沉淀取上清液加入95%乙醇离心5min（4000r

8、/min）取沉淀试剂分层，上层液体无色透明，下层为白色沉淀沸水浴2min沉淀溶解鸡肝提取液在白瓷板中的对照显色反应加入糖原与碘液的一侧呈棕红色反应，对照组仍为黄色 鸡肝提取液水解后加入班氏试剂再次水浴反应加入班氏试剂溶液为蓝色，再次水浴后，溶液中产生砖红色沉淀鸡肝肝糖原的定量测定步骤简述实验现象鸡肝0.15克沸水浴获得白色悬浊液按要求配置三管对照溶液完全配置后均为黄色溶液沸水浴获得一管黄色溶液，一管深蓝色溶液，一管浅黄色溶液分光光度计测定结果见下文具体图片见下文：l 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，对照组则为黄色。糖原提取液组对照组糖原提取液组肝糖原定性实验中加入班氏试剂后的显色反应：l 加入蒽酮

9、溶液并且水浴过后的样品管、标准管、空白管（由左至右）l 将空白管在620nm处的A值设定为0，测得标准管、样品管的分光光度值如下：空白管标准管样品管100.4390.028200.4800.169300.4850.031平均值00.4680.30(其中，样品管第二组测得数据误差较大，予以舍去)肝糖原= × 0.05 × × × 1.11 0.237（g/100g）讨论：可以发现，本组在对肝糖原定性实验中都获得了较明显的反应。其中，糖原加入碘液反应之后呈现出红棕色表明鸡肝提取液中确有糖原存在。而在糖原水解后，产物加入班氏试剂反应之后有砖红色沉淀则表明鸡肝提取液水解后获得葡萄糖，此进一步验证鸡肝中存在糖原。在定量实验中，我组获得的数据偏低，可能原因如下：1、 在实验过程中，糖原在浓硫酸中水解不充分，获得样品管颜色偏浅，最终