2022年单个核细胞分离-冻存及复苏

1、1、 外周血单个核细胞Ficoll别离：向Ficoll分层液离心管中参加稀释的血液样本，1500rpm，5min离心机离心；i用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中，将所得的单个核细胞悬液用5倍体积的Hanks液或RPMI-1640洗涤2次，1500rpm，5min；用细胞计数仪或血球计数板计数细胞，调整细胞至所需浓度；淋巴细胞浓度浓度细胞数/mL=四个大方格内细胞数/4×1042、 细胞冻存：1配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的冻存培养液； 2 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞那么

2、直接将细胞移至15ml离心管中、； 3离心1000rpm，5min； 4去除胰蛋白酶及旧的培养液，参加适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml1×107/ml； 5 将细胞分装入冻存管中，每管11.5 ml； 6在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/min；到-100时，那么可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20冰箱2h ，然后放入-80冰箱中过夜，取

3、出冻存管，移入液氮容器内。 3、细胞复苏： 1从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2从37水浴中取出冻存管，翻开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3离心， 1000rpm，5min； 4弃去上清液，参加含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养； 5次日更换一次培养液，继续培养。4、考前须知：1从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2将冻存管放

4、入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3冻存和复苏最好用新配制的培养液。4细胞分层液应避光4下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用，防止细菌污染。5稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞售货量，但是如果要保存血浆成分作为其他实验用时，那么不能稀释血液，以免影响血浆成分。5、所需材料：1仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱4、-20、-80、倒置相差显微镜、 培养箱、液氮冰箱 2玻璃器皿：吸管弯头、直头、培养瓶、玻璃瓶250ml、100ml、废液缸 3塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、 移液管10ml、15ml离心管、 冻存管12ml 其他物品：微量加样枪、 红血球计数板、记号笔 、医用橡皮膏、移液枪 5试剂:D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗青霉素、链霉素、胰蛋白酶0.08% 、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO分析纯或无色新鲜甘油内容总结1外周血单个核细胞Ficoll别离：向Ficoll分层液离心管中参加稀释的血液样本，1500rpm，5min离心机离心2外周血单个核细胞Ficoll别离：向Ficoll分层液离心管中参加