测定植物抗寒性的方法

1、我国植物种类繁多，分布区域广，在晚秋和早春时期发生的冻害和冷害两种低温危害，常常给越冬作物和果木造成严重伤害。冻害由0c以下低温造成，冷害由0c以上低温引起，冷害对植物的伤害程度，除取决于低温外，还取决于低温维持时间的长短。植物抗寒性的强弱决定其生长季节，因此蔬菜作物利用抗寒品种，可以将露地栽培提前，提早供应市场；而选育抗寒性强的果树品种，不仅是寒带果树育种者的主攻方向，而且也是温带甚至热带果树育种者重要育种目标之一。本实验重点学习实验室间接鉴定果树抗寒性的方法和步骤。一、试材及用具1.试材及处理：植物枝条或花朵，将采回的枝条剪成40cm左右的长度，用自来水冲洗数遍（洗掉泥土、灰尘、虫卵），再

2、用蒸储水冲洗三次，然后用吸水纸吸干水分，最后将枝条末端进行蜡封。将每个品种蜡封后的枝条分成相等的6份，其中一份作为对照，其余每份作为一个低温处理，放于冰箱中（0c4C）保存备用。每次处理时，各取参试品种的一份枝条放于超低温冰箱或程控冰箱内进行低温处理，处理温度梯度为：CK（0C）,-20C,-25C,-30C,-35C,-40C。降温速度为4C/h,达到目的处理温度后维持12h,然后逐步升温，升温速度亦为4C/h。花朵的处理温度梯度为：CK（0C）,-1C,-3C,-5C,-6C,-7C,-8Co2.仪器烘箱，发芽箱，培养皿，标牌，电导仪，具塞刻度试管（20ml）,恒温水浴锅，温度计，玻璃棒，

3、天平，研钵，石英砂，高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（4000lx）,容量瓶（250ml、25ml）,聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳槽，刻度吸管（10ml、5ml）,离心管等。二、内容说明植物的抗寒性鉴定可分为田间鉴定和实验室间接鉴定两种方法。1 .田间鉴定田间自然鉴定就是在冻害发生期（早春及晚秋）对受冻的田间植株一定器官、组织以一定的标准进行评价、比较，然后根据冻害情况评价抗寒性。陈学森等（2001）对山东省春季倒春寒”发生后，受害的核果类果树的花器官的抗寒性进行了调查，选出了当地花期抗寒性较强的红荷包、红丰等杏品种，证明种间的抗寒力大小顺序是：桃杏李大樱桃。赵玉田（1993）对不同

4、生态型玉米的抗寒性进行了田间鉴定，测定的项目包括3个抗冷指标：相对出苗率（）（RER）:印00%第：期杷苗率刖苗指数（EI）：.（我出马数（播用大数）乙由苗总数fJOd）幼苗干物重（SDW）,取地上部三叶期10株幼苗，烘至恒重。三个抗冷特性以总指数值（TIV）表示，即占各自等级顺序之和。其值反应了低温下种子出苗生长和干物质积累能力。田间鉴定能最直接的反映不同品种在同一条件下的抗寒性差异。该法直接、简单，可进行大范围、大群体的评价，但受地域、品种数量的限制，只能比较少数几个同一地段的品种之间的抗寒力差异，不能对他们的抗寒能力进行量化。2 .实验室间接鉴定实验室间接鉴定，就是根据作物某些生理生化指

5、标及物理指标间接推断供试材料的抗寒性。物理指标Lyons和Raison（1970）证明植物低温发生时，生物膜首先发生膜脂的物相变化，膜的外形和厚度发生变化，膜上产生龟裂，因而膜的透性增大，电解质大量外渗。抗寒性强的品种细胞膜透性增大程度轻，抗寒性差的品种与之相反。因此，测量电解质外渗量变化可以比较植物的抗寒性。在黑穗醋栗、梨、冻猴桃（ShaoliLu,1990）等许多种果树的不同器官，如花、枝、叶等都有相似结论。另外，通过电导率值配以Logistic方程，可以求出半致死温度，确定植物的临界致死温度。常用差示温度分析来测量深过冷。以DTA法测定，一般植物在零下几度即散热结冰，称为高温散热。经过低

6、温锻炼的抗寒木本植物，在连续降温过程中，可见到有多次散热，第一次在零下几度，主要是细胞外结冰，最后一次散热可达-20-45C的低温以下，叫低温散热。在低温散热前一霎那的温度，即深过冷温度，用LTE温度表示。深过冷低温散热时，可出现细胞内结冰而使组织死亡。日本京都大学S.K.Kang（1998）等对苹果、桃、梨、柿子和葡萄5种落叶果树通过温度分析测定了两种散热HTE和LTE,发现柿子与葡萄仅有LTE,所有树种的低温散热温度与花芽的半致死温度一致。生理生化指标主要包括超氧物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖含量等方法。三、方

7、法步骤（一）质膜透性测定电导法近年来的研究表明，在低温伤害尤其冷害中，膜系统常常是最先受到伤害的部位，寒害能使脂膜受损伤，透性加大，细胞内离子（主要是K+离子）外渗量增多，电导率加大。因此可以用电导仪测定溶液的电导率，求算电解质渗出率（或称伤害率）。伤害率愈高则愈不抗寒，反之则愈抗寒。1 .电解质渗出率的测定取处理和对照样品各0.5g,放入试管中，力口10ml去离子水，置25c下10h。用玻璃棒搅拌均匀，然后用电导仪测电导值分别为T1和C1。再将试管放入沸水中10min,待其冷却至25c时，测得处理和对照得电导值为T2和C2,按下式计算电解质渗出率和伤害度：电解质渗出率（%'浸泡沌电导

8、率值,煮海后电导率仅伤害度（%）x100%处理电导率值T1一对，电导率值C1处理煮沸后电导率值T2一对照煮沸后电导率佗C22 .绝对电解质渗出量的测定有时为了求得电解质的绝对渗出量，需要用分析纯的KCl配成不同浓度的标准液（0.01-10mmol/L）,在25c下测定其电导率值，并绘制电导率（WS/cm）一浓度（mg/ml）标准曲线。由标准曲线查知样品的外渗电导率值相当于KCl的浓度，再折算每克材料的绝对外渗量（mg/g）,即绝对电解质渗出量（mg/g）,即绝对电解质渗出量（mg/g）=AXB/W式中，A根据样品电导率值，从标准曲线中查出的与KCl相当浓度（mg/ml）;B浸泡液的体积（ml）

9、;W一样品鲜重（g）。2.注意事项（1）在电导测定中一般应用去离子水，若制备困难可用普通蒸储水代替，但在测定中设一空白试管，测定样品时要同时测定其空白电导值，按下式计算相对电导度:相对电廿度（L）5-空白电导值与一空白电导值（2）CO2在水中的溶解度较高，在测定电导时要防止高CO2气源和口中呼出的CO2进入试管，以免影响结果的稳定性。（3）温度对溶液电导影响很大，故S1与S2必须在相同温度下测定。（二）超氧物歧化酶（SOD）测定超氧物歧化酶（SOD）是一种清除超氧阴离子自由基的酶，普遍存在于植物体内。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四陛（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可氧化物质存

10、在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四陛还原为蓝色的甲月簪，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基从而抑制了甲月簪的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。750科mol/L氮蓝四陛（NBT）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存。100mol/LEDTA-Na2溶液：称取0.037

11、21gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。20科mol/L核黄素溶液：称取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存。2 .酶液提取称取处理和对照样品各0.5g,加入5ml磷酸缓冲液，冰浴研磨提取，然后15000rpm离心10min,所提上清液为酶液。3 .显色反应3ml反应液为0.05mol/L磷酸缓冲液1.5ml,750umol.L-1NBT溶液、130mmol/L甲硫氨酸（MET）溶液、100umol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）液、20umol/L核黄素各0.3ml,蒸储水0.25ml和0.05ml酶提取液（对照管加蒸储水）。混匀后将1支对照管置暗处，其它各

12、管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时间延长）。4 .SOD活性测定与计算反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的光吸收，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性=%乂；XfFX%SOD比活力=0OD总活性蛋白质浓度式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；ACK一照光对照管的光吸收值；AE一样品管的光吸收值；V样液总体积（cm3）;Vt一测定时样品用量（cm3）;W样重（g）;蛋白质浓度单位为：mg蛋白/g样重。研究表明，当遭受低温胁迫时，引

13、起SOD活性的下降，下降的百分率与品种抗冷性呈负相关，故能反应品种间抗冷能力的高低。（三）过氧化氢酶（CAT）活性的测定低温胁迫下，细胞内易产生H2O2破坏膜系统的稳定，而过氧化氢酶（CAT）能把H2O2分解为H2O和。2,从而清除出。2维护膜的稳定性。研究表明，抗寒性强的品种有较高的过氧化氢酶活性，且随温度下降，以抗寒性强的品种下降幅度小，与抗寒性呈显著性相关。CAT酶活性大小可用一定时间内分解的H2O2量来表示。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高镒酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2,即可求出被CAT分解的H2O2量：5H：O2KM11O4-4H

14、2SO4->50：-2KHSO4-SH:O+2MnSO+1 .试剂配制10%H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液（pH=7.8）;0.1mol/L高镒酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.160g,用新煮沸冷却蒸储水配制成1000ml,用0.1mol/L草酸标定；0.1mol/LH2O2:取30%H2O2溶液5.68ml,稀释至1000ml,用标准0.1mol/LKMnO4溶液在酸性条件下标定。2 .酶液提取取剪碎的样品2.5g加入磷酸缓冲液（pH7.8）少量，研磨成匀浆，转移到25ml容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000Xg离心10min,上清液

15、为酶粗提液。3 .酶液滴定取50ml三角瓶4个（两个测定，两个对照），测定加入酶液2.5ml,对照为煮死酶液2.5ml;再加入2.5ml0.1mol/LH2O2,同时计算时间，于30c恒温水浴中反应10min,立即加入10%H2SO42.5ml。然后用0.1mol/LKMnO4滴定，至出现粉红色（30min内不消失）为终点。4.结果计算酶活性用每克鲜重样品在10min内分解H2O2毫克数表示。A-BY-V酶活性(mgH,OygFW)=A对照KMnO4滴定ml数;B酶反应后KMnO4滴定ml数;V酶提取液总量（ml）;a反应所用酶液量（ml）；W样重（g）。5.注意事项所用KMnO4溶液及H2O

16、2溶液使用前要经过标定，0.1mol/LH2O2要新配制。（四）过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析1.过氧化物酶（POD）活性测定在过氧化物酶催化下，过氧化氢分解成水和原子氧，原子氧能氧化联苯胺产生一种蓝色的化学物质，该蓝色化合物在波长580nm处有一最大吸收峰。蓝色物质的生成速度（dx/dt）与反应系统中过氧化氢分解速率呈正相关。因此，用分光光度计测出蓝色物质密度的变化（单位时间内反应液中光密度的变化），可以表示过氧化物酶的活性。（1）试剂配制0.1MpH8.5Tris-HCl缓冲液：称取1.211gTris-HCl溶于80ml蒸储水，力口36.5%HCl0.42ml,用NaOH调pH

17、至8.5,定容至100ml。0.1M过氧化氢：1ml30%的过氧化氢稀释到100ml。0.005M联苯胺醋酸醋酸钠缓冲液：在200ml容量瓶中，先加入2/3的蒸储水及2.3ml冰乙酸和184mg联苯胺。在5060C水浴中加热溶解，然后加入5.45g无水醋酸钠。待完全溶解后，冷却，加水定容到刻度线。（2）酶液提取将样品剪碎，称取1g,加入酶提取液（0.1MpH8.5TrisHCl缓冲?5ml和少量石英砂，在研钵中磨碎。然后再次加入5ml酶提取液稀释。转入离心管在1500rpmmin-1的速度下离心15min。上清液贮于冰箱中待用。（3）酶活性测定测定前，将酶液稀释300500倍。吸1ml酶液，加

18、入2ml联苯胺醋酸醋酸钠缓冲剂，在2832c水浴中保温35分钟。测定时，加入1ml0.1M过氧化氢，立即摇匀，并转入比色皿中，用分光光度计在波长580nm下测定光密度的变化。从加入过氧化氢起计时，每15s读数一次。（4）酶活性的计算过氧化氢与酶液接触后，立即产生蓝色物质，分光光度计上光密度读数不断上升，但随反应时间延长，光密度变化减小。在开始反应的4560s种之内，光密度呈直线上升。取第1545s之间的光密度变化，按下式计算样品中过氧化物酶活性。E_AOD545x2其总稀释倍数WOOE表示酶活性，单位为zT>.D./mgF.W./Min。研究表明，抗寒性强的品种POD活性高于抗寒性差的品

19、种，且随温度下降变幅较缓。2.化物酶(POD)同工酶分析用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术分离POD同工酶。(1)贮液的配制A. 30%Acr0.8%Bis贮液：称取30gAcr和0.8gBis,用50ml重蒸水加热溶解，将溶液用定性滤纸过滤到100ml容量瓶内，定容后盛于棕色瓶中，于0-4C冰箱中保存。B. 1MTris-HCl缓冲?夜(pH值8.8):称取121.14gTris用重蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中，用浓盐酸调pH值至8.8,最终加水定容至1000ml,然后用滤纸过滤，盛于棕色瓶中，放入04c冰箱保存。C. 1MTris-HCl缓冲?夜(pH6.8):称12.114gTris用

20、重蒸水溶解后倒入100ml容量瓶中，用浓盐酸调pH值至6.8,最终加水定容至100ml,然后用滤纸过滤，盛于棕色瓶中，放入04c冰箱保存。D.电极缓冲液：称取141.1g甘氨酸和30gTris用重蒸水加热溶解后倒入1000ml容量瓶中，加水定容至1000mlo用时稀释20倍，调pH值至8.3。E.1%过硫酸钱溶液：称0.5g过硫酸俊溶于50ml重蒸水中，放入04c冰箱，可保存一周。F.澳酚蓝溶液：称0.2g澳酚兰溶于100ml重蒸水中，配成0.2%。(2)凝胶板的制备分离胶的制备分离胶浓度多为7%,按照表5-3进行配制。先用刻度吸管准确地吸取30%Acr-0.8%Bis和1MTris-HCl(

21、pH8.8)于抽滤瓶中，用电动吸引器减压抽气，除去溶液中气泡，抽气毕，再加入1%过硫酸钱溶液和TEMED,摇匀后，小心地将凝胶加入凝胶板模具内，上面加一水层，在2530c的地方进行聚胶，约1h。表53分离胶的配制t7液不同配置及微股正度断需贮液imO20ml30ml*TQ.-"/010%5%10%3(iAcr0.8%Bis324.56.5496.S97IMTtiHClpHS.S16.315.013.024.322.419.51%过傩酸费0.50.50.54008OSTEMED(u11202020404040TEMED（四甲基乙二胺）也可用DMPN（二甲氨基丙晴）或TEOA（三乙醇胺）

22、替代。隔层胶的配制按表5-4进行隔层胶的配制，用刻度吸管准确吸取30%Acr-0.8%Bis和1MTris-HCl（pH6.8）于抽滤瓶中，用电动吸引器减压抽气，与此同时，吸去分离胶上层的水层，抽气毕，加入1%过硫酸钱溶液和TEMED,立即灌注隔层胶（凝胶板需要迅速加入蔗子），其中加一水层，约1h可聚合好。表54隔层胶的配制贮液不同配量及凝胶浓度所需仁液mb10ml20ml3%4%3%4%30°oAcrO.S°oBis1.0132.02.6IMTns-HCIpH6.S10132.02.61重蒸水7.77I15.41421%凡硫酸被03030E0.6TEMED(为15.153

23、030TEMED（四甲基乙二胺）也可用DMPN（二甲氨基丙晴）或TEOA（三乙醇胺）替代。（3）加样装置好垂直板电泳槽，用1%热琼脂封好缝隙。样品制备：每克鲜样加3.0ml0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH=7.0）,研磨，用纱布粗过滤,滤液离心：4000r/min,（0±2）C,取上清液作供试酶液。用10伏/厘米预电泳三分钟后，用微量进样器吸取样品液分别每管加入50微升。(4)电泳加样毕，注电极缓冲液入上、下电泳槽，在上槽中加入一滴澳酚蓝。接通电源，上槽为负极，下槽为正极。调节电流为2毫安/厘米(2毫安/管)，在冰箱内进行。待澳酚蓝迁移至下端约0.51cm处停止电泳，约2h。(5)

24、染色将脱下的凝胶，用去离子水冲洗凝胶板后，放入长方型白瓷盘中染色。A.染色贮液配制0.2M醋酸钠溶液：称2.8g醋酸钠溶于100ml重蒸水中。5mM硫酸镒溶液：称取0.168g硫酸镒，溶于200ml重蒸水中。联苯胺溶液：称0.5g联苯胺，溶于10%冰醋酸250ml中。愈创木酚溶液：称1.35g愈创木酚，溶于250m110%醋酸中。以上四种溶液放冰箱中长期备用。0.12%H2O2:凝胶洗出后才加。随配随用。B.染色配比：:20:2:5:8:5C.染色将配好的染色液倒入白瓷盘内凝胶板上，37c保温30min,酶带呈紫红色。取出漂洗后，7%醋酸中保存。过氧化物酶同工酶显色23d更为清楚，在暗室用透光

25、照相的方法效果较好。也可用280mm波长下用光密度计扫描定量。(6)同工酶带相对迁移率计算“囱恬迁移距离ILZ-一-一_丁酚蓝迁移即离研究表明，过氧化物同工酶与植物抗寒性的关系极为密切，抗寒性强的品种的同工酶带一般比抗寒性差的品种多13条，且随着温度下降变化缓慢。(五)丙二醛含量的测定正常情况下由于植物体内活性氧的产生与清除处于平衡状态，不会导致植物伤害。但在低温MDA)是膜脂过氧化的最终分胁迫环境下，植物器官往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(解产物，常用作测定膜脂过氧化的指标。在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3,5,5-三甲恶吵2,4-二酮)，其最大吸

26、收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm,532nm处也有吸收。植物遭受低温胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的消光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100300g/gDW,根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0.5wmol/LA,直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的消光度值为

27、零。不同浓度的蔗糖(0-25mmol/L)与TBA显色反应产物在450nm的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的消光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532=-0.00198+0.088D450B.双组分分光光度计法据朗伯-比尔定律：D=kCL,当液层厚度为1cm时，k=D/C,k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的消光度之和。已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532

28、nm波长下的比吸收系数分别为85.40,7.40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0,532nm波长下的比吸收系数为155,根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式：C1(mmol/L)=11.71D450C2(mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450式中Ci为可溶性糖的浓度，C2为MDA的浓度，D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的消光度值。0.6%硫代巴比妥酸：称取硫代巴比妥酸，先加少量氢氧化钠(1mol/L)溶解，再用10%的三氯乙酸定容。1 .MDA的提取称取样品1g,加入2ml10%TCA和

29、少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000Xg离心10分钟，上清液为样品提取液。2 .显色反应和测定吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸储水)，加入2ml0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min,迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度。3 .计算含量(1)直线方程法按公式求出样品糖分在532nm处的消光度值Y532,用实测532nm的消光度值减去600nm非特异吸收的消光度值再减去Y532,其差值为测定样品中MDA-TBA反应产物在532nm的消光度值。按MDA在532nm处的毫摩尔消光系数为155换算求出提取液中MD

30、A浓度。(2)双组分分光光度计法按公式可直接求得样品提取液中MDA的浓度。用上述任一方法求得MDA的浓度，根据样品的重量计算测定样品中MDA的含量：MDAtnolgFW1NIDA浓度(/miolL)k提取液体积!ml)样品鲜3?g)如果某一品种MDA含量在低温时巨增出现的早,MDA含量变化与植物的抗寒性呈负相关,说明抗寒性较差。反之，抗寒性就强。(六)可溶性糖含量的测定可溶性糖一方面是原生质代谢可直接利用的原料，另一方面可溶性糖又增加了原生质的浓度，使冰点降低，又可缓冲细胞质过度脱水，保护细胞质胶体不致遇冷凝固，减少细胞内失水和结冰，因而提高植株的抗寒性。糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛

31、或羟甲基糠醛，生成的产物可与慈酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。糖类与慈酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm,故在此波长下进行比色。1 .试剂配制慈酮乙酸乙酯试剂：取分析纯慈酮1g,溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。2 .标准曲线的制作取20ml刻度试管11支，从010分别编号，按表55加入溶液和水。表55标准曲线的制作出n01-2375-67-89-1010ngL正祠液；ml>00.2040.6031.0水W)101.6161.41.210蔗糖量（Mg）0204060

32、SO100然后按顺序向试管中加入0.5ml慈酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min,取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。3 .可溶性糖的提取将样品剪碎混匀，称取0.100.30g,其3份。分另1J放入3支刻度试管中，加入510ml蒸储水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。4 .显色测定吸取0.5ml样品液于20ml刻度试管中（重复2次），加蒸储水1.5ml,同制作标准曲线的

33、步骤，按顺序分别加入慈酮，浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算样品中糖的含量。Cxx门可溶件触帘端（%）/a.FxlO6C标也方也求得期口晓:a吸取样品液体枳1ml）：V提取液ht（ml”口稀释倍数：W-组织-阻：igL5 .注意事项该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与已糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用意酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用意酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，

34、有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维、半纤维素等与慈酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与慈酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。三、作业思考题1 .鉴定植物抗寒性的方法有哪些？各有何优缺点？2 .干扰可溶性糖测定的主要因素有哪些？如何避免？3 .过氧化氢酶与哪些生化过程有关？4 .在进行超氧物歧化酶(SOD)活力的测定时，为什么设照光和黑暗两个对照管？影响该实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？四)游离脯氨酸