实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)

1、实验四 逆转录 PCR (RT-PCR)【实验目的】1了解用逆转录PCF法获取目的基因的原理。2 学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。【实验原理】聚合酶链式反响PCR过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板， 是一个指数增长的过程， 使其成为检测核酸和克隆基因 的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106倍。RT-PCF将以RNA为模 板的 cDNAcomplement DNA合成即 RNA的反转录RT, reversetranscription，同 cDNA的 PCR 结合在一起的技术，提供了一种基

2、因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于 cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子， 只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究， 因 此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中 RNA病 毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA序列。RT-PCF比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原 位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCF的根本原理图。首先是在逆转录酶的作用下从 RNA合成cDNA,即总RNA中的mRNA 在体外被反向转录合成DNA

3、拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板 mRNA,称之为互补DNA cDNA然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸dNTF为材料， 在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。在RT时，有3种引物可选择表4.1)。用1和2方法，理论上是扩增的所有的 cDNA,还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用3方法，先要去：查它的序列，并用oligo等软件设计引物。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法 RT-PCR:匕较常见，在使用一个样品检测或克 隆多个基因的mRNA时比拟有用。在两步法RT-PCR,每一步都在最正确条件下进行。cDNA的合成 首先在

4、逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反响产物进行PCR而一步法RT-PC具有其它优点表, cDNA合成和扩增反响在同一管中进行，不需要翻开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高 的灵敏度，最低可以到达总 RNA因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法 RT-PCR 一般使 用基因特异性引物(GSP起始cDNA的合成。由图不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火， 产生短的，局部长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转 录酶不能复制的终止位点的 RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA,需要按经验

5、确定每个 RNA 样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为 50到250ng每20卩l反响体系。因为使用随 机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA所以模板一般选用poly(A)+RNAOligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3端所发现的poly(A)尾杂交。 因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2%,所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少 得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建 议每20卩l反响体系使用卩g oligo(dT> oligo(dT)

6、12-18适用于多数RT-PCR基因特异性引物GSP对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或 oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物 的规那么同样适用于逆转录反响 GSP的设计。GSP可以同与mRNA 3最末端退火的扩增引物序列相同， 或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有适 当的接头Linker,接头可以是在PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经 PCRT增后再克隆 入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链

7、 cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA 尾巴,退火后形成重组质粒，并转化到宿主菌中进行扩增。本实验是要从小鼠肝脏组织中获取 Fas配体基因，Fas配体FasL是一分子量约为40u的II型跨 膜糖蛋白，属TNF家族成员。活化的T细胞可表达Fas和FasL并通过Fas/FasL系统介导细胞凋亡作 用，保持机体免疫系统的自稳态。近年研究发现在局部癌细胞中FasL表达增强，并与肿瘤的复发转移有关。我们采用RT-PCR方法克隆FasL全长cDNA并构建其表达载体，可以为进一步研究 FasL的功 能提供条件。在上下游引物的5'端分别加上了限制酶切位点及其保护碱基即 Hind III和B

8、amH， 以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆到原核表达载体pGFPUv上附录图。为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法别离和纯化目的蛋白，我们改造了 pGFPUv在其上加了 6X His标签。表4.1RT-PCR|物选择的履那么随机可物(Random Pmers)适用于长的或具有发卡结枸的适用于rKNA>niRNA>tRNA 等所有RNA的威隸反响。主姜用干单一模板的EPCR反氛Oligo dT(Oligo- dT AdaptorPrimer)适用于具有Polfca屋巴的RNA姑于纱亦套结合至I Polka屋 巴上所次对RNA样品的质量耍求较託即使有少量降解也会 使全长fDX

9、H合成量大大减少-基因特异性引物(Gene SpeciHc Primer 5 GSP)与模板席列互补的引糊适用于目的序列的情况o表12一步法和两步法RT-PCR的比較两步法一步法性始第 HScDNAjSttffl；起始第一®合威棲用：O昭咚刁：随机六聚体0P引韧GSP刖物优点优点试活扩增酶同诬转录酶预先泯合扩壇酶的选怪转管步骤少，-械少污渠可能性困难RT-PCR的优化能力蔦灵SS度可通过选用不同特性的DNA聚合酶和改变反响条件 提高扩壇的特异性忠实性适用于大量祥品分折适用于在里个样品中检测或克隆务伍因的mJ还二适用于定重PCR一试剂1. 总 RNA或 mRNA酶抑制蛋白RNase I

10、nhibitor: 40 U/mL3. dNTP混合物(各10 mM)4.oligo(dT)12-18: 2.5 mol/L5.10*逆转录合成缓冲液10 RT buffer：250 mmol/L Tris-HCI (pH8.3)375 mmol/L KCl 15 mmol/L MgCI2 逆转录酶5u/ L7. 基因特异性5和3引物各20 mol/L8. Tap DNA聚合酶 5u/ L9.10*PCR缓冲液：500mmol/L KC, 100mmol/L Tris?C,在 25°C下，1.0% Triton X-100 15mmol/L MgCI2。二器材1PCR仪，2PCR管,

11、3微量移液器【操作方法】一逆转录：1建立RT反响体系:总RNA或对服RNA0.5-1 rigdNT?混合物2 LoligoiT124S1J1L10>RT缓;梆如AMV逆诺录酶IpLRNase Inhibitor0.5DEPC水如至20 pLTotal volume20 pL2涡旋混匀，42C反响1小时，95C加热5分钟，然后置于冰上。二PCR扩增：1建立PCR反响体系:上步逆转录反响得到的10L基因特异性亍和歹引物各ILdNIP混合初1110叩CR缓;械5TiqDNAM 合醸0.5 1LDEPC水力咗50iiLTotal volumeSOuL2将上述反响体系涡旋混匀，按以下程序运行循环:

12、step变性5 minstep2变性1 minstcp3性曲secstcp472延伸step5芒辽温肓lOminstepC保存H过夜step2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。三取10-20uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下的 PCR产物-20C保存。【考前须知与提示】1. 逆转录反响过程，需建立无 RNAase环境，以防止RNA的降解。2. 成功的逆转录反响决定于高质量的模板 RNA高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或 SDS此外，RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是 RNA中沾染的基因组DNA。使用较 好的RNA别离方法，如T

13、rizol Reage nt会减少RNA制备物中沾染的基因组 DNA。因此在进行PCR反 应时应该对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照反响，以确定扩增出来的片段是来自基因组DNA还是cDNAo在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。的起始模板可是总RNA或mRNA都可以检测到扩增结果如以下列图。另外，别离mRNA会导致样 品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有基因时，使用 mRNA会增加检测的灵敏度。4 / 64. 在逆转录反响中经常参加RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的长度和产量。RNA酶抑制蛋白要在第一链合成反响中，在缓冲液和复原剂如 DTT存

14、在的条件下参加，因为cDNA合成前的过程会使抑 制剂变性，从而释放结合的可以降解 RNA的RNase RNA酶抑制蛋白仅防止RNase A，B，C对RNA 的降解，并不能防止皮肤上的 RNase因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心试验者的手上Rnase对样品的污染。5. 较高的保温温度有助于 RNA二级结构的翻开，增加了反响的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65C保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构， 从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构， 即使热变性后也是如此。对这些困难模板 的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶，女如: Inv

15、itrogen公司的ThermoScript逆转录酶，使逆转录反响置于较高温度下进行以改善扩增。而且适当提高逆转录保温温度，可增加RT-PCR勺特异性。6. 建立反响体系时，加完其它反响物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后将全部反响物涡旋混 匀；上PCR仪前加矿物油封盖或设热盖。反响的循环数一般25-30次就足够了，过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。复性温度的 计算，一般是在引物的Tm值上下浮动，Tm =2 : A+T+4 G+C。适当提高复性温度可提高 PCRT增 的特异性。8.不管是反转录反响还是 PCF反响都应先调制试剂的 Master Mix 包括RNase Fr

16、ee dH2O缓冲液、dNTP Mixture等，然后分装到每个反响管中。这样可使所取的试剂的体积更准确，减少试剂的损失，防止 重复分取同一试剂，同时也可以减少实验操作造成的误差。而且分装试剂时务必用新Tip，以防止样品间的污染。、RNase Inhibitor、Taq等酶类，要轻轻地混匀，防止起泡。分取之前要轻轻地离心收集到反响管底部， 因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶类务必在实验前从-20C取出，使用后立即放回-20C保存。10.最正确的PCR条件，因PCRT增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先做 Control反响， 以确定最正确的PCR条件。为延长PCR仪的使用寿命，应尽可能缩短PCR仪4C保存的时间，尽量防 止4 °C过夜的情况。-1500bplOOObp800bp一 50flbp® 4.2 RT-PCK琼脂稲瀧除电泳示意團Lane 1:总RNA的RT-PCR产物人细胞调亡因子 TF15基因Lane 2: mRN