实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项

1、实验室分子生物学实验根本操作标准及考前须知一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体50 ng/小用灭菌水稀释4倍12.5 ng/pl后分装成10 d或 20 p;连接酶solution I按5 p分装；dNTP10 mM 分装成 50 pl； 无菌水分装成 1 ml ；注意：1所有分装都必须用已灭菌的管。 2所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。 3工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回 原处，以免耽误他人使用。 4当你发现你使用的是最后一管盒公用物品时，请马上告知负责 人购置，以免耽误使用。 5感受态， 氨苄青霉素和 IPTG 由研究生轮流负责制备。 每人负责六个 月。其

2、他试剂那么由第一位使用新包装的同学分装。由于分子实验工具酶比拟容 易失活，必须在冰上进行分装。二、常见抗生素及 IPTG 的配置以氨苄青霉素为例：1. 准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 m水系滤器、注 射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。3 .称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，参加灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。4.用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活 塞，把溶液经滤膜推至 100 ml 的离心管中。注意：动作要缓和，使滤出

3、液出口正对着离心管，还要防止染菌。5把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。6把做好标记的盛有氨苄青霉素的 EP管于-20C保存。注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时， 请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。表1常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨卞青霉素ampicillin100 mg/ml50 卩 g/mH 100 卩 g/ml卡那霉素kanamycin10 mg/ml10 卩 g/mH 50 卩 g/ml氯霉素chloramphenicol25 mg/ml卩 g/mH2

4、5 卩 g/ml链霉素streptomycin50 mg/ml10 卩 g/mH 50 卩/ml四环素tetracyyline10 mg/ml10 卩 g/mH 50 卩 g/mlIPTG1 M-0.6 mM三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见?分子克隆?四、总 DNA 的提取具体步骤参考试剂盒说明书。 注意：革兰氏阳性菌 DNA 提取时需要加溶菌酶五、基因扩增1. 引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成jinansangon 。2引物配制：合成后的引物先离心至管底，然后按说明书用无菌水稀释至10-50 pM ,分装至无菌EP管中，做好标记一

5、定要标记浓度！后，于-20 度保存备用。3. PCR反响体系配制：将所需各组分在冰浴中化开后，进行PCR反响体系配制。反响体系及反响参数按不同聚合酶的说明书进行，以tran sge n的easyTaq酶扩增1kb基因序列为例，100卩I反响体系为：10X buffer 10 I，卩 dNTP (10 mM) 2如引物各2 p 10-50 pM，模板1 p根据浓度加减体 积，Taq酶 1 p，ddH2O 82 p注意：参加顺序为：水，buffer，dNTP， 引物，模板，酶。涡旋混匀，分装至四-五管，瞬时离心。注意：假设反响时间较长在反响混合液的上层加10-20 p的矿物油防止样品在PCR的过程

6、中蒸发。4. 将管放入PCR仪中，在PCR仪上设置好PCR反响参数，例如：94 C 5 min，94 °C 40 sec Tm 55°C 1 min，72 C 2 min, 72 C 10 min, 16 C 1 h, 一般设30个循环。待温度降至16 C后停止PCR仪，尽快取出样品，不允 许过夜。六、琼脂糖核酸电泳1. 电泳缓冲液的配制：电泳缓冲液一般为 TAE或TBE，其配制方法参见 表2,先配制50X母液放于4度冰箱中，电泳时稀释100倍使用。2. 将制胶模具和梳子冲洗干净，架好梳子；3. 根据欲别离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶 表 3：准确

7、称量琼脂糖干粉，参加到配胶用的三角烧瓶内，定量参加电泳缓 冲液；4放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化 一般沸三次即好 ,冷却片刻，倒入 制胶模具中，待其凝固；a室温下 30-45 分钟后凝胶完全凝结， 小心拔出梳子， 将凝胶安放在电 泳槽内；b向电泳槽中倒入电泳缓冲液， 其量以没过胶面 1 mm 为宜，如样品孔 内有气泡，应设法除去；c在DNA样品中参加1/5-1/10体积的上样缓冲液1% SDS, 50%甘油,0.05%溴酚蓝，混匀后，用枪将样品混合液缓慢参加被浸没的凝胶 加样孔内；5 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记 DNA 样品由负极往正极泳动 靠近加样孔的一端为负 。根据胶的长度设

8、定电压，一般 5-8 V/cm， 电泳 20-40 min, 溴酚蓝跑完胶板的 3/4 左右即可；6电泳完毕，关上电源，戴上手套，将胶放入卩g/ml的溴化乙锭EB溶液中，室温下染色 5-10 min。7蒸馏水中漂洗一下， 置于紫外灯下或凝胶成像仪上观察电泳带及其位置， 并与核酸分子量标准 Marker 比拟被扩增产物的大小。如果要切胶回收， 最好在观察台上铺上塑料片观察，防止污染以及紫外灯引起 DNA 突变。 注意：溴化乙锭 E B 有剧毒，操作时应注意平安，戴手套操作。但是 要防止污染染色池和切胶板以外的区域。操作完后手套和胶分别放入垃 圾桶和回收桶。表 2. 电泳缓冲液 TAE 配方电泳缓

9、冲液配方缓冲液使用液浓贮存液每升Tris-乙酸TAEX： 2 mol/L Tris-乙酸50 X 242 g Tris 碱05 mol/L EDTAml冰乙酸100 mol/L EDTA(pH 8.0)表3琼脂糖凝胶浓度与线形 DNA的最正确分辨范围琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最正确分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最正确分辨范围bp0.5%1,000 30,0000.7%800 12,0001.0%500 10,0001.2%400 7,0001.5%200 3,0002.0%50 2,000七、回收与连接1. 将切下的目的条带按照回收试剂盒说明书进行产物回收；2. 连接前先电泳确定待连接载

10、体与片段的浓度。稀释好的 T 载体浓度为12.5 ng/d，不用再确定浓度，每次用量为1血3. 连接反响体系的配制1用 Solution I 连接时，取一只分装的 Solution I 离心管含 5 dl Solution I ， 参加待连接的两个 DNA 样品：载体与片段载体与片段的 mol 比为 1： 3-5，加水补足 10 dl。2用T4连接酶5 d连接时，取一只灭菌PCR管，参加10X连接buffer 1山 待连接的两个 DNA 样品：载体与片段载体与片段的 mol 比为 1：3-5， T4连接酶1 d加水补足10血3连接至T载体时反响体系一般为：回收的PCR产物4 d solutio

11、n I 5 d,4倍稀释的pMD-18T克隆载体12.5 ng/pl1血注意：参加顺序为：水， buffer ， DNA 样品，酶4. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。5. 将离心管置于16 C孵育4 h以上或过夜。八、E. coli DH5 a和BI21感受态细胞的制备采用CaCb制备法制备E. coli DH5a感受态细胞，步骤如下：1 准备实验：1准备LB固体培养基和分装于试管2-5 ml和三角瓶100 ml丨的液体培养基。2分别配制含15%甘油的和不含甘油的0.1 M CaCl2。3准备干净培养皿、非常干净的100 ml离心管2只，1.5 ml EP管50只， 1ml和200止枪

12、尖各一盒。4将以上培养基和物品高压灭菌。2在LB平板上活化i DH5 a将活化的i DH5 a单菌落接种于成含LB培养基的 试管中，37 C摇床过夜培养。3 第二天按1%接种量接种到含100 ml LB培养基的三角瓶中，37 C摇床培养 至 OD600=0.4-0.6 约 2 h。4. 冰浴10 min，倒入灭过菌的100 ml离心管中离心，4000 rpm，10 min, 4 °C。5 去掉上清，加 20 ml 配制好的已灭菌的 0.1 M CaCl 2，将菌体打散后静置 20 min，4000 rpm离心10 min，去掉上清。6. 加 1-2 ml 灭菌的 0.1 M CaCl

13、2 (含 15%甘油)制成感受态细胞。将制好的感受 态细胞分装成50 d小份保存于-80 C冰箱。7. E. coliBl21和BL21(DE3)的制备方法同上。、，、-、八注意：1所有操作均在冰上进行； 2整个制备过程必须保证无菌操作； 3E.coli Bl21，BL21(DE3)，DH5 a菌种每学期更换一次九、转化1. 取50 fk感受态细胞于冰浴上融化。2. 参加10 k连接产物或3-5 k纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴 20 min。3. 放入42 C水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2-10 min。4. 参加ml不含抗生素的LB液体培养基，于37 °C培养1 h。5. 将培养

14、物4000 rpm离心3 min,保存约200 k上清于管中，将菌体用无菌枪尖轻 轻打散，均匀涂布于含100 k g/mAmp+的平板外表，平板于37 C先正置1-2 h， 后倒置培养12-16 h至菌落出现。十、重组子的筛选和鉴定从转化平板上挑取白色菌落，转接至含抗生素 Amp+ 100 kg/ml丨的LB液 体培养基，37 C振荡培养过夜。菌液可以用以下三种方法验证是否是阳性转化 子。注意：同时培养阴性菌落作为对照！一酚抽验证取1 ml菌液12,000 rpm离心1 min收集菌体，尽量倒干净上清后参加50 k Tris 饱和酚和50 k水，漩涡震荡5 min充分混匀。12,000 rpm

15、离心10 min后迅速取上 清进行琼脂糖凝胶电泳。二质粒酶切验证1. 按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用未插入片段的质粒作为阴 性对照，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后可根据质粒的大小初步判断质粒中是 否有插入片段，并推测质粒的浓度。2. 利用引物中设计的酶切位点或质粒上的酶切位点，对质粒进行酶切。根 据待切质粒的浓度确定要加的体积,选择适宜的限制性内切酶和配套 Buffer。3. 在离心管中参加如下成分：10 buffer 2 k待切样品 x k 一般为5 k左右酶1k10UU加灭菌水补足20 k酶的多少并不是一成不变的，关键要看待切DNA的浓度，如果浓度较低， 可以适当少加酶。不要在20止体系中参加超过2 d的酶，那样容易产生星号活 性。4、混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。5、将离心管置于37 C中温育2 h,假设待切样品为PCR产物，那么可将反响时间 适当延长。最长酶切时间要取决于是否会产生星号活性。 如果50 d体系参加1 d酶, 那么可过夜酶切一般不会出现星号活性。6、用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。注意：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比