实验报告_不同因素对酶的影响

1、专业：洲尹大曝实验报告姓名：学号：日期：地点：课程名称：生物化学实验甲指导老师:成绩：实验名称：酶的根本性质实验一一底物专一性剂、激活剂和抑制、最适温度实验类型：别离鉴定实验同组学生姓名:一、实验目的和要求必填二、实验内容和原理必填:三、主要仪器设备必填四、操作方法和实验步骤五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析必填i七、讨论、心得；I.酶的根本性质一一底物专一性j一、实验目的和要求*共1.了解酶的专一性.2.掌握验证酶的专一性的根本原理及方法.3.学会排除干扰因素,设计酶学实验.二、实验根本原理酶是一种具有催化功能的蛋白质.酶蛋白结构决定了酶的功能一一酶的高效性,酶催化的订反响酶促反响要比

2、相应的没有催化剂的反响快103-1017倍.酶催化作用的一个重要特点是具有高度的底物专一性,即一种酶只能对某一种底物或一类底物起催化作用,对其他底物无线催化反响.根据各种酶对底物的选择程度不同,它们的专一性可以分为以下几种：;1.相对专一性一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反响.2.j绝对专一性：有些酶对底物的要求非常严格只作用于一种底物,而不作用于任何其他物质.;如服酶只能催化尿素进行水解而生成二氧化碳和氨.如麦芽糖酶只作用于麦芽糖而不作用其它双;糖,淀粉酶只作用于淀粉,而不作用于纤维素.3.立体异构专一性有些酶只有作用于底物：的立体异构物中的一种,而对另一种那么全无

3、作用.如酵母中的糖酶类只作用于D-型糖而不能作;用于L-型的糖.本实验以唾液淀粉酶、蔗糖酶对淀粉、蔗糖水解反响的催化作用来观察酶的专一性.采用Benedict试剂检测反响产物.:Benedict试剂是碱性硫酸铜溶液,具有一定的氧化水平,能与复原性糖的半缩醛羟基发生;氧化复原反响,生成砖红色氧化亚铜沉淀.Na2CO+2H2O2NaOH+H2COCCuSO+2NaOHCuOHM2+NaSO复原糖CHOorC=O+2CuOH2Cu2O;砖红色或黄色+2H2O+糖的氧化产物;在分子结构上,淀粉几乎没有,而蔗糖、棉子糖企无半缩幅基,它们均无复原性,因此它们:与Benedict试剂无呈色反响.淀粉被淀粉酶

4、水解,产物为葡萄糖；蔗糖和棉子糖被蔗糖酶j水解,其产物为果糖和葡萄糖,它们都为具有自由半缩醛羟基的复原糖,与Benedict试剂共热,即产生红棕色Cu2O沉淀.本实验以此颜色反响观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉和蔗糖的水解作用.!;三、实验材料与试剂:1、实验材料蔗糖酶样品IV;新鲜唾液含唾液淀粉酶；2、实验试剂蔗糖酶液蔗,糖酶液样品IV加蒸储水适当稀释,备用；唾液淀粉酶液学生自制取0.5mL唾液至25ml量筒中,用蒸储水稀释到25ml,用棉花过滤备用.唾液稀倍数因人而异,可稀释50400倍,甚至更高；5%蔗糖(A.R.)溶液；0.5%淀粉溶液(含0.3%NaCl);Benedict试剂；四、实验器材

5、与仪器1.漏斗,2.脱脂棉花；3.恒温水浴(37C,100C);4.量筒；5.试管；6.烧杯；7.吸量管.五、实验操作方法和步骤检查试剂取3支试管,按下表操作：试剂处理23Q.族淀粉(0.3%NaCl)溶液U1)3萧蔗糖溶液(ml)3蒸储水(ml)3BenedictiJ(ml)222摇匀,置沸水浴煮沸23min记录观察结果注：1、检查目的：试剂是否有干扰因素存在.2、也可对蔗糖酶液、唾液淀粉酶液进行检查是否也有干扰因素存在,请自己设计.淀粉酶的专一性取三支试管,按下表操作：试管编号1230.5席淀粉CO.SaCl)溶液(ml)j热蔗精溶液(ral)3蒸榴水(ml)3唾液淀粉酶液(ml)111摇

6、匀,置水浴保温lOminBen已diet试剂(ral)222摇匀,直沸水浴煮2和行记录观察结果注：可增加一组唾液淀粉酶液经100c加热3min处理后的样品对照组.蔗糖酶的专一性取三支试管,按下表操作：试管编号123试剂处理'-j0,疆淀粉(0.3%NaCl)溶液加D3弱蔗糖溶液(ml)3蒸瑞水(ml)3蔗格爵溶液(ml)111摇匀,置水浴保湿LU而nBEnEdict试剂加1)22摇匀,置沸水浴点2加in记录观察结果注：可增加一组蔗糖酶液经100c加热3min处理后的样品对照组六、结果分析讨论各试管观察结果依次是：(一)：1号蓝绿色,2号蓝色,3号蓝色Benedict试剂是碱性硫酸铜溶液

7、,具有一定的氧化水平,能与复原性糖的半缩醛羟基发生氧化复原反响,生成砖红色氧化亚铜沉淀.3只试管都为蓝色说明几只试管中都没有果糖和葡萄糖,说明在不加酶时,淀粉和蔗糖不易水解.试剂无干扰因素的存在.1号试管是蓝绿色可能是由于有少局部的淀粉水解二：1号土黄色,2号黄绿色,3号蓝色参加唾液淀粉酶,1号试管底物是淀粉,所以很容易水解成葡萄糖,与Benedict试剂共热,即产生红棕色CsO沉淀.所以1号颜色变化比拟大.2号可能是由于蔗糖在37c恒温水浴中也有少局部水解,所以颜色变化,但变化不明显.总的来看可以看出唾液淀粉酶只对淀粉有催化活性,不能催化蔗糖水解,具有对淀粉的底物专一性.3号是对照.三：1号

8、蓝色,2号红棕色,3号蓝色参加蔗糖酶,2号试管底物是蔗糖,所以很容易水解成果糖和葡萄糖,与Benedict试剂共热,即产生红棕色C&O沉淀.所以2号颜色变化比拟大.1号可能是由于淀粉在37c恒温水浴中也有局部水解,所以有颜色变化,但变化不明显.从这三支试管看出蔗糖酶只对蔗糖的水解有催化作用,对淀粉无催化作用,具有对蔗糖的底物专一性.3号是对照.七、思考题1.观察酶专一性实验为什么要设计这3组实验？每组各有何意义？蒸储水有何用？第一组作为整个实验的空白对照组,检测Benedict试剂对实验结果的颜色有何影响,排除干扰因素的存在.第二组作为检测淀粉酶的专一性实验组,第三组作为检测蔗糖酶的专

9、一性的实验组.蒸播水作为每一个组中的空白对照,与组内其余两组进行对照.2.将酶液煮沸10min后,重做二、三的操作,观察有何结果？各试管都为蓝色,由于酶在煮沸过程中已经变性,失去催化活性,故不能催化各自对应底物的水解反响.3.在此实验中,为什么要用0.5%淀粉0.3%NaCl溶液？0.3%NaCl的作用是什么？0.3%NaCl中的Cl-是作为激活剂激活唾液淀粉酶的活性,使实验结果不至于由于唾液淀粉酶的活性缺乏而导致不同.八、考前须知1.试管要干净,所有试剂加量准确,加好试剂后要摇匀.2.使用试剂时不要人为造成试剂间的互相污染；试剂用好瓶盖要立即盖好,预防试剂间的互相污染.以免实验结果的错误.n

10、.影响酶活性的因素一一激活剂和抑制剂一、实验目的和要求1.了解激活剂和抑制剂对酶促反响速度的影响.2.学习检定激活剂和抑制剂影响酶促反响速度的原理和方法.二、实验根本原理在酶促反响过程中,酶的活性常受某些物质的影响,有些物质能使酶的活性增加,称为激活剂；某些物质它们并不引起酶蛋白变性,但能使酶分子上的某些必需基团主要是指酶活性中心上的一些基团发生变化,因而引起酶活力下降,甚至丧失,致使酶反响速度降低,称为酶的抑制剂.酶的激活剂种类：1、一些简单的无机离子,如Mg2+Cl-等；2、一些中等大小的有机分子,如抗坏血酸等也是激活剂,它们对某些含疏基的酶具有激活作用；3、有些酶的催化作用易受某些抑制剂

11、的影响,因而能除去抑制剂的物质也可称为激活剂,如EDTA能除去重金属,因而能解除重金属对酶的抑制作用.4、具有蛋白质性质的大分子物质,这些激活剂是指可对某些无活性的酶原起作用的酶.酶的抑制剂有许多种：如重金属离子Ag+、Hg2+、Pb2+、Cu2+等、CO氯化物、H2s碎化物、氟化物、生物碱、有机磷农药等都是抑制剂.少量的激活剂或抑制剂就能影响酶的活性,而且常具有特异性.值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的,各种激活剂对酶的作用是不同的.本实验利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同颜色反响,定性观察唾液淀粉酶在酶促反响中激活或抑制现象.淀粉经酶促水解为葡萄糖的不同阶段的产物与碘作用的颜色反响如

12、下：淀粉紫色糊精一缸色棚t一无色糊精.麦芽糖-葡萄糖I?II豆蓝色显紫色显红色不显色不虚色不显色嚏色碘色嚏色_JI仍为多精无复原性有复原性本实验中,Cl-为唾液淀粉酶的激活剂；Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂.利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同的呈色反响,定性观察唾液淀粉酶在酶促反响中激活和抑制现象.淀粉+碘蓝色淀粉+淀粉酶三三一水解产物+碘颜色变化怔用一W间水解的程度是通过水解混合物遇碘溶液所呈现的颜色之变化来判断的.三、实验材料与试剂1、实验材料新鲜唾液2、实验试剂唾液淀粉酶学生自制取唾液1ml至25ml量筒中,用蒸储水稀释至25ml,用棉花过滤备用.唾液稀释倍数因人而异,可稀释50400

13、倍,甚至更高.0.1%淀粉溶液1.0%氯化钠溶液1.0%硫酸铜溶液1.0%硫酸钠溶液碘化钾-碘液四、实验器材与仪器1 .试管及t管架2.量筒3.漏斗4.脱脂棉花5.点滴板6.吸量管7.恒温水浴37C五、实验操作方法和步骤取试管4支,按下表操作：-试管编号试剂处理12340.居淀箱溶液ml33331%硫战铜溶液ml11%氯化钠溶液ml11%硫酸舶溶液ml1燕憎水ml1唾液淀粉醯ml1111混匀.37七恒洛水浴,保温1航逐膜化钾-碘液滴11I1记录观察结果注意：找出准确的保温时间,是本实验是实验能否成功的关键步骤之一,唾液淀粉酶液浓度可根据个人情况而定,通过37c水浴溶保温计时,反响时间最好在81

14、5min以内,只有确定准确的保温时间才能进行实验.2参加酶液后,务必充分摇匀,保证酶与全部淀粉液接触的3碘化钾-碘液不要过早地加到点滴板上,以免碘反响才能得到理想的颜色梯度变化结果.液挥发,影响显色效果.六、结果分析讨论1号试管为蓝紫色,2号为浅黄色,3号为褐色,4号为浅褐色.试管1中颜色最深,说明CuSO4可以抑制淀粉酶的活性；试管2中颜色最浅,基本呈碘色,故淀粉酶活性最高,说明NaCl可以激活淀粉酶的活性；试管3、4中颜色根本一致,且深浅居于试管1、2之间,淀粉酶活性一般,说明Na+、SO42-对淀粉酶活性都没有影响.故总体上看,可以得出Cl-是唾液淀粉酶的激活剂,Cu2+是唾液淀粉酶的抑

15、制剂.七、思考题1.激活剂可分哪几类？本实验中NaCl、硫酸铜是属于哪种类型？激活剂可分为：简单无机离子、中等大小有机分子、能除去抑制剂的物质、具有蛋白质性质的大分子物质等.NaCl属于简单无机离子；CuSO属于重金属抑制剂.2 .本实验中,1,2,3,4管各有何用意？为什么要设计第3管和第4管？1管可观察抑制剂对反响影响的现象,2管可观察激活剂对反响影响的现象,第3管可以将1管中的Na+和2管中的SO2-对反响的影响去除,4管作为空白对照.3 .抑制剂与变性剂有何不同？试举例说明.抑制剂只改变酶的催化活性,并不使蛋白质变性,其影响是可逆的；变性剂破坏了蛋白质的高级结构,使蛋白质变性,并且多数

16、变性剂的影响是不可逆的.如：Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂,但如果将Cu2+去除淀粉酶的活性又可以变为正常水平.八、考前须知1.试管要干净,所有试剂加量准确,加好试剂后要摇匀.2.使用试剂时不要人为造成试剂间的互相污染,以免实验结果的错误.3.试剂用好瓶盖要立即盖好,预防试剂间的互相污染.4.两种淀粉不要弄错.5.激活剂抑制剂实验中,注意运用点滴板显色板来限制保温时间；如1,2,3,4管颜色反响无明显差异,可能是唾流淀粉酶活力太高或太低,假设酶活性太高可将酶稀释后重做；假设酶活性太低,可延长保温时间或增加酶的浓度.m.影响酶活性的因素一一温度,最适温度测定、实验目的和要求1. 了解温度对酶活力的

17、影响；2.学习测定最适温度的原理和方法；二、实验根本原理酶的催化反响受温度影响很大,每一种酶所催化的反响,在一定条件下,仅在某一温度范围内表现出最大的活力,即反响速度最大时的温度,这个温度称为该酶促反响的最适温度,高于或低于最适温度时,反响速度逐渐下降.因此,酶促反响与温度的关系,用酶活力对温度作图,通常具有钟罩形曲线特征.温度与酶活力的关系测定是选择一定的条件,把底物浓度、酶浓度、反响时间、pH等固定在最适状态下,然后在一系列不同温度条件下,进行反响初速度测定,以酶反响初速度对温度作图,可以得一个钟罩形的曲线,即为温度一酶活性曲线,在某温度有一酶活力最大值,这个温度即为最适温度.实验利用唾液

18、淀粉酶为试验对象,在0c65c之间选择不同的温度,进行酶活力测定.根据淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同,遇碘呈现颜色的变化来判断酶活力的大小及最适温度.实验采用蔗糖酶为试验对象,在室温至75c之间选择不同温度进行酶活力测定.蔗糖酶的活力常以其反响产物复原糖葡萄糖的生成量来表示.测定复原糖的方法很多,本实验选才13,5-二硝基水扬酸法测定复原糖量.在碱性条件下,3,5-二硝水杨酸与复原糖溶液共热后被复原成红色氨基化合物,并在一定浓度范围内,复原糖的量与反响溶液所呈棕红色物质颜色的深浅程度成正比.因此,可以用分光光度法测定酶促反响后生成的复原糖量,从而测定蔗糖水解的速度和酶活力.三、实验材料与试剂

19、1、实验材料蔗糖酶液样品IV加蒸储水适当稀释,备用；新鲜唾液.2、实验试剂0.2mol/L醋酸缓冲液pH4.65%蔗糖A.R.溶液W/V3,5一二硝基水扬酸简称DNS试剂0.5%淀粉溶液含0.3%NaClKI-I2溶液四、实验器材与仪器1 .试管及试管架,2.恒温水浴,3.吸量管,4.滴管,5.点滴板,6.分光光度计,7.制冰机.五、实验操作方法和步骤一、温度对唾液淀粉酶活力的影响1.观察温度对酶活动的影响：取5支试管,按下表操作.管号试剂2345口.乔痛除液0,twl22222温度CC沐浴约也室温375Q65各保温Emin唾液,酶ml1L11I将恼管内溶液混匀后,置各相应温度,保温"

20、;IDgIKT4费酒11111记录颜色变化注意：找出准确的保温时间,是本实验是实验能否成功的关键步骤之一,唾液淀粉酶液浓度可根据个人情况而定,通过37c水浴溶保温计时,反响时间最好在815min以内,只有确定准确的保温时间才能进行实验.2参加酶液后,务必充分摇匀,保证酶与全部淀粉液接触的反响才能得到理想的颜色梯度变化结果.3碘化钾-碘液不要过早地加到点滴板上,以免碘液挥发,影响显色效果.各管保温时间要相同.2、绘制温度-酶活力曲线图,以反响温度为横坐标,反应液颜色的深浅程度代表酶活力的大小为纵坐标.绘制温度酶活力曲线钟罩形,确定唾液淀粉酶的最适温度.二、温度对蔗糖酶活力的影响1、蔗糖酶最适温度

21、的测定取试管7支进行编号,0号管为空白对照,以蒸储水代替酶液,17号顺序为测定管,向各管参加0.2mol/L醋酸缓冲液pH4.61ml,2%蔗糖溶液0.5ml,然后将各编号管依次放入相应温度见下表的恒温水浴或恒温箱中,预热2min,再逐管准确计时参加0.5ml经适当稀释的蔗糖酶液,迅速混匀；精确反响10min后,参加1ml3,5-二硝基水杨酸DNS试剂,立即混匀,放入沸水浴中加热5min.取出用流水冷却至室温后,向各管参加5ml蒸播水,充分混匀.以0号管作空白对照A520值为零,在分光光度计上于520nm波长处测定各管的A520值,并作好记录.2、绘制温度一一酶的活力曲线图以反响温度为横坐标,相应的A520表示反响初速度为纵坐标,绘制出温度一酶活力A520值曲线图,从而可以测出蔗糖酶在本实验条件下的最适温度.号试剂条件_012345反响温度【伫献剂室温室温375065T5曜睢冲液(pH4.S)(ml)111111别蔗糖溶液510.50.50.550.50.5预热3min稀释酶液样品MW0,50.50.50.50.50.5反响时间min1010101010