淀粉酶固定化实验方案

1、实验三、-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测一、实验背景：酶：生物体内活细胞产生的具有催化作用的有机物。 在21世纪，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域： ·果汁制作（果胶酶分解细胞壁，促进果汁生成。） ·加酶洗衣粉（某些酶对污渍的作用一般碱性物质更大） ·根据体内酶活性变化检测疾病（淀粉酶的活性大小可体现胰脏、肾脏的功能） 固定化酶：将水溶性酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。直接使用酶缺点固定化酶优点通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间地储存和使用；

2、（更能耐受温度、PH的变化）溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本固定化酶可以被反复使用，更经济，更利于生产反应后会混在产物中，可能影响产品质量(难分离）酶既能与反应物接触，又能与产物分离纯化 固定化酶载体应具备以下要求大体上有：1)在酶催化反应过程的惰性：载体应不与底物、产物及介质发生反应。2)有良好的渗透性：制备成柱子后，能使底物和产物能快速通过减少吸附。3)有生物亲和性和相容性，有利于酶活力发挥和稳定。4)有较高酶负载量，载体表面能提供多个活性位点利于酶分子偶联。二、实验原理：一般酶的固定化方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。1、一般酶固定化的传统：吸附法、共价偶联法、

3、交联法、包埋法。吸附法利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，酶生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素

4、，工业生产6-氨基青霉烷酸。结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。交联法依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，使酶分子和多功能试剂之

5、间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：( 1) 单独与酶作用；( 2) 酶吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体，再连接酶。交联剂的种类很多，最常用的是戊二醛，其他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。交联法的优点是酶与载体结合牢固，稳定性较高；缺点是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易造成酶失活。各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理化学方法分类物理吸附化学共价键结合物理离子键结合化学键连接物理包埋制备难易易难易较

6、难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶2、 淀粉酶催化反应：淀粉酶：淀粉酶是指一类能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)的糖苷键的酶之总称。淀粉酶包括：淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、麦芽寡糖生成酶等水解酶类和葡萄糖苷转移酶、环状糊精葡萄糖苷转移酶等。淀粉酶是一种内切酶，它随机地从分子内部切开14糖苷键(水解中间的14键比分子末端的14键概率大)，遇到分支点的16键不能切，但能跨越分支点而切开内部的14糖苷键，由于产物的还原性末端葡萄糖残基上的C1碳原子呈构

7、型(光学)，故称这种酶为淀粉酶。淀粉酶的水解反应：淀粉在淀粉酶的作用下很快被切割成分子较小的糊精、低聚糖、麦芽糖、葡萄糖等，引起粘度下降，对碘呈色反应为篮紫红无色，又叫液化酶。淀粉酶的水解产物：水解直链淀粉，首先将淀粉降解为寡糖、麦芽三糖和麦芽糖，然后将寡糖、麦芽三糖进一步降解为麦芽糖和葡萄糖；水解支链淀粉，由于不能水解-1.6糖苷键，产物除麦芽糖、少量葡萄糖外，还有带-1.6键的小分子极限糊精。糊精:分子式为(C6H10O5)nH2O，为白色或类白色的无定形粉末；无臭，味微甜。在沸水中易溶，在乙醇或乙醚中不溶。直链淀粉显蓝色，据认为这是由于葡萄糖单位形成六圈以上螺旋所致。其分子量约1万-20

8、0万,250-260个葡萄糖分子,以 (1 4)糖苷键聚合而成.呈螺旋结构。一个螺旋圈所含葡萄糖基数称为聚合度或重合度,当淀粉形成螺旋时,碘分子进入其中,糖的羟基成为供电子体,碘分子成为受电子体,形成络合物.而支链淀粉除了 (1 4)糖苷键构成糖链以外,在支点处存在 (1 6)糖苷键,分子量较高.遇碘显紫红色.遇碘显紫红色。淀粉水解时一般先生成淀粉糊精（遇碘呈蓝色），进而生成红糊精（遇碘显红色），再生成无色糊精（遇碘不显色）及麦芽糖，最终生成葡萄糖。糖元遇碘显红色。总结一下：当链长小于6个葡萄糖时,不能形成一个螺旋圈.当聚合度为20左右时,碘遇淀粉显红色当聚合度为2060时,碘遇淀粉显紫红色当

9、聚合度大于60时,碘遇淀粉显蓝色） -淀粉酶 淀粉酶 糖化淀粉酶淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖遇碘显蓝色 遇碘显红色（淀粉遇碘显色原理：淀粉、糊精等与碘结合为淀粉/糊精-碘包合物显色。分子结构不同，结合方式不同，颜色不同。）3. 石英砂的吸附作用 石英砂吸附酶的物理吸附也称范德华吸附，它是由吸附质和吸附剂分子间作用力所引起，此力也称作范德华力。由于范德华力存在于任何两分子间，所以物理吸附可以发生在任何固体表面上。吸附剂表面的分子由于作用力没有平衡而保留有自由的力场来吸引吸附质，由于它是分子间的吸力所引起的吸附，所以结合力较弱，吸附热较小，吸附和解吸速度也都较快。被吸附物质也较容易解吸出来，所以物理

10、吸附在一定程度上是可逆的。如：活性炭对许多气体的吸附，被吸附的气体很容易解脱出来而不发生性质上的变化。同一物质，可能在低温下进行物理吸附而在高温下为化学吸附，或者两者同时进行。吸附作用的大小跟吸附剂的性质和表面的大小、吸附质的性质和浓度的大小、温度的高低等密切相关。如活性炭的表面积很大，吸附作用强；活性炭易吸附沸点高的气体，难吸附沸点低的气体。吸附质分子与吸附剂表面原子或分子间以物理力进行的吸附作用。这种物理力是范德瓦耳斯力，它包括色散力、静电力和诱导力。对于极性不大的吸附质和吸附剂，色散力在物理吸附中起主要作用。当极性分子与带静电荷的吸附剂表面相互作用，或因吸附质与吸附剂表面分子作用，使二者

11、的电子结构发生变化而产生偶极矩时，定向力和诱导力在物理吸附中也有重要作用。有时吸附质分子与吸附剂表面以形成氢键的形式发生物理吸附。 （总体来说）实验原理：本实验是用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成。 这里使用的是枯草杆菌的a-淀粉酶，其作用的最适pH范围：pH5.5-7.5，最是温度为50-75三、实验材料： 1、a-淀粉酶：容易购买，价格适宜。2、 石英砂：坚硬、耐磨、性能稳定、危险性低、易寻便宜，适用于a-淀粉酶的固定。3、 淀粉：在a-淀粉酶促进反应前后都可与碘液反应产生不同颜

12、色，易被碘液检测观察。四、实验器材： 物品准备表药品名称小组用量总准备用量物品名称小组用量总准备用量淀粉酶 5mg70mg层析柱1个12个石英砂 5g70g滤布1张12张淀粉 25mg400mg50ml烧杯2个24个KI-I2溶液 1ml15ml200ml烧杯1个3个蒸馏水 3000ml5ml指形管3个36个50ml量筒1个12个胶头滴管 -12个玻璃棒1个12个电子天平1个电炉1个试管支架1个4个废液桶4个实验试剂的配制方法：0.5 mmol/L KI-I2，阴凉且通风良好环境下保存。（KI的作用：碘在水中的溶解度不大，加入KI后，发生可逆反应，使碘的溶解度增大，可得到较浓的碘水同时，碘溶液

13、中的碘容易被氧化，加入碘化钾可还原，并抑制其继续氧化）五、实验步骤：1、配制可溶性淀粉溶液。用电子天平称取25mg可溶性淀粉溶于50ml沸水（可溶性淀粉先用冷水调成糊状，再加入沸水中至50ml）。将配制好的淀粉溶液放置在60的水浴锅中备用。（注意：此数据为一组实验的用量，若配全班用量乘以实验小组数即可，可由授课教师配制全班用量以节省时间。）【方案改进：淀粉溶液在70水浴锅中保温，且在水浴锅中已为学生准备好用100ml烧杯装的配制好的淀粉溶液，注意嘱咐学生要在用层析柱反应时才拿出来，勿提前拿；而之前检测石英砂固定a-淀粉酶的上清液所用淀粉于水浴锅中大烧杯中取，避免小烧杯中淀粉溶液取出来之后温度降

14、低致使反应结果不佳。】2、a-淀粉酶的固定化。在50ml烧杯中将电子天平称取的5mg a-淀粉酶溶于4ml蒸馏水中，由于酶不纯，可能有些不溶物，再加入电子天平称取的5g石英砂，不时搅拌，固定化15分钟。（注意：搅拌时用力不可太猛及搅拌时间不易过长，以免石英砂被磨细穿过滤布带入到流出液中，搅拌的速度应是缓慢的，搅拌时间过长也不易酶的固定，这里授课老师可以做示范动作让学生来体会。）【方案改进：由于实验时间不足的问题，此步骤由教师准备。】3、小心倒掉上清液后，（每次）用10-15ml的蒸馏水小心清洗石英砂2-3次，每次取其上清液0.5ml于试管中，同时滴加淀粉溶液充分混匀。再加入1-2滴KI-I2

15、溶液，若溶液变为蓝色，说明中已无游离a-淀粉酶，如果溶液为红色，继续用蒸馏水清洗，直至淀粉溶液变为蓝色为止。（检测未吸附的游离淀粉酶是否洗涤干净）4、先把滤布放入固定化酶装柱中，再装入固定有a-淀粉酶的石英砂约4ml，装柱过程中可在装有石英砂的烧杯中加入少量蒸馏水，便于石英砂流入层析柱，同时适当打开层析柱的调节装置，使多余的液体可以流出。（加入少量蒸馏水的目的是让固定好a-淀粉酶的石英砂尽量全部装进柱中，装柱时应尽量使石英砂的表面平整，这样可以使淀粉溶液充分与酶反应。流出的液体主要是加入的蒸馏水）5、将灌注了固定化酶的层析柱放在支架上，用滴管加淀粉溶液后，调节层析柱的调节装置使淀粉溶液约以0.

16、3ml/min(6滴/min)的流速过柱，在流出1-2ml反应液后（让塑料管中的水流出），转动关闭层析柱的调节装置，放置5min（让淀粉液充分与酶反应）。6、打开调节装置，0.3ml/min(6滴/min)的流速过柱，在流出1-2ml反应液后（1-2ml液为：装柱下面塑料管中未充分反应的淀粉液）（10滴，20滴为1ml），按以下表格在试管中加入相应试剂，观察结果。 实验记录表样品淀粉溶液流出液流出液（稀释1倍）1滴KI-I2 溶液参考结果对照+碘色对照+ +蓝色样品1 +红色样品2 + +浅红色固定后的a-淀粉酶可以重复使用，实验后用10倍柱体积蒸馏水洗涤固定化酶柱，然后放置4冰箱保存。注意事

17、项：1、a-淀粉酶的固定化过程中，用力不易过猛，搅拌时间不易过长。 2、加固定好酶的石英砂入层析柱时，勿先加液体，应直接用玻璃棒将石英砂弄入层析柱。3、在层析柱中加入溶液不要过快，防止石英砂表面不平整。我们小组对方案的改进（预实验后确定）：1. 可溶性淀粉浓度：可设置可溶性淀粉浓度梯度，确定最适淀粉浓度 溶液名称浓度（mg/mL) 配制方法 可溶性淀粉溶液15mg可溶性淀粉溶于50mL沸水25mg可溶性淀粉溶于50mL沸水35mg可溶性淀粉溶于50mL沸水（根据预实验结果，0.7mg/ml浓度太高，会使结果的颜色参杂蓝色，而0.3mg/ml浓度太低，颜色没有0.5mg/ml浓度的淀粉溶液好，故

18、仍用原方案）2.反应时间:可将第5步步骤改为流出1-2ml后，直接放置10min.（原因：简易步骤，增加酶与淀粉的反应时间） 实验对比方案：编号 方案 1 2（据预实验结果，用0.3ml/min流速过柱比不过柱好，不流动的实验组结果不理想，推测应因淀粉未与a-淀粉酶充分接触。）最终改进方案：1、由于实验时间不足的问题，步骤1、2由教师准备。 2、淀粉溶液在70水浴锅中保温，且在水浴锅中已为学生准备好用100ml烧杯装的配制好的淀粉溶液，注意嘱咐学生要在用层析柱反应时才拿出来，勿提前拿；而之前检测石英砂固定a-淀粉酶的上清液所用淀粉于水浴锅中大烧杯中取，避免小烧杯中淀粉溶液取出来之后温度降低致使

19、反应结果不佳。思考： 1. 与游离酶相比，固定化酶有哪些优缺点？（l）极易将固定化酶与底物、产物分开；（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；（3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；（4）酶反应过程能够加以严格控制；（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；（6）较游离酶更适合于多酶反应；（7）可以增加产物的收率，提高产物的质量（8）酶的使用效率提高，成本降低。2. 选择固定化方法时要注意哪些基本原则？1）必须注意维持酶的催化活性及专一性，保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能起催化反应的特点2）固定化应该有利于生产自动化、 连续化3）固定化酶应有最小的空间位阻4

20、）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用5）固定化酶应有最大的稳定性，在制备固定化酶时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应6）固定化酶应易与产物分离7）固定化酶成本要低，应为廉价的、有利于推广的产品，以便于工业使用8）充分考虑到固定化酶制备过程和应用中的安全因素3. 为什么固定化后酶的稳定性得以提高？ 定化后酶分子与载体多点连接，增加了 酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形。阻挡了不利因素对酶的侵袭。抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了自降解。4. 经过固定化后，酶的特性有哪些改变？1）酶的催化活力变化：固定化酶

21、的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变2）稳定性的影响（热稳定性、对各种有机试剂、对酶抑制剂、对不同pH、对蛋白酶、储存稳定性、操作稳定性3）最适pH变化.：由于固相化后酶蛋白电荷状态变化和受载体表面电荷的影响，使得对底物作用的pH活性曲线和最适pH都将发生变化，最适pH可能将酸性或碱性方向移动，不同酶与pH有关的变化需通过实验来确定。4）最适温度的变化（提高，少数不变或下降）5、新型酶固定化技术有哪些，各有什么优缺点？酶固定化的新技术、新方法微波/超声辅助固定化微波是一种电磁波，波长为0.1100 cm。微波加热的主要原理是介质材料的极性分子在微波高频电场的作用下反复快速取向转动而摩擦生热，是从物质内部开始，瞬时达到需要的温度。微波加热具有许多传统加热不具备的优点，