侦测食品中之微生物

1、DetectingMOinFoodsAims1. Tounderstandthetraditionalmethodsandrapidmethodsfordetectingmicroorganismsinfoods2. Tounderstandtheprinciples,advantages,limits,andapplicationforeachdetectingmethod3. Tounderstandtheissuesofthemetabolicallyinjuredmicroorganisms(MO)andtheviablebutnon-cultivableMO(VBNC)Outline

2、1. Homogenizationmethods2. Standardplatecount(SPC)3. Spiralplatecount4. Membranefiltrationmethods5. Microscopeplatecount6. Petrifilm7. MPN8. Directmicroscopiccount9. Dyereductiontest10. DetectingMOonsurfaces11. Metabolicallyinjuredmicroorganisms12. Viablebutnon-cultivablemicroorganisms(VBNC)13. Phis

3、ical,chemical,molecular,andimmunologicalmethods§均皆法（HomogenizationmethodsWaringBlendorvs.StomacherWaringBlendor泛使用方法（除了有刺、尖之食品外），彳翦占:1 .免於清洗、被菌操作2 .正常操作日寺内（三2min）不生熟，不影警菌数3 .噪音低4 .均液易吩藏5 .不曾引起食品戢（余田胞）之高度破碎，容易吸取檬品，而且,降低来自食品成份之干援（尤其在非SPC侦测法）§襟型平板法StandardPlateCount(SPC),活菌数1 .舒数:25250cfu(或30

4、300cfu)2 .假U:(1)各培餐皿中之菌落源自罩一菌H。(2)所提供之修件(管叠、温度等)足以使食物中所有菌生房,而is生菌落。3 .方法：(1) 混稀法(pourplatecount)(2) 抹法(spreadplatecount,surfaceplatecountIt抹法侵缺黑占(典混稀法比敕)(a)瓢都害(b)有利好氧菌快速生辰(c)容易(d)可自勤化操作(e)菌落易分离隹§螺旋平板法(Spiralplatecount)1 .所用培叠基、平板、稀释液、吸管均敕少2 .快速，5060plate/h3 .易受食物SK粒阻塞5.费用高§膜滤法(Membranefilt

5、rationmethods)遹用於水、歆料、或空氟等菌数低者可能需!0滤，以去除食物SK粒，或添加酵素、介面活性剜等以利遇演1 .直接螯光遇滤法(DirectEpifluorescentFilterTechnique,DEFT)留於滤膜上之菌株，以螯光染剜，如acridineorange染色，再以操作:Foodhomogenate5Pmnylonfilterfiltrate,+2mlTritonX-100&0.5mlTrypsin0.6pmNucleoporepolycarbonatefilterfilterstainedwithacrineorangecount2 .Microcol

6、ony-DEFTMicrocolonymethod:FiltrationSampefilterplate,incubatefor36hmicroscopiccountMicrocolony-DEFTmethod:Samplefilterplate,andincubatedacridineorangestain(nucleoporemembrane)fluorescencemicroscopiccount3.疏水性格膜遇滤法(HydrophobicGridMembraneFiltration,HGMF)(1)1600waxgrid/membrane(2)减少稀释操作(3)已有分析项目totalc

7、oliformsfecalcoliformsSalmonellaeE.coliO157:H7§悬询散菌落tHfeiC(Microscopecolonycounts0.1mlsample+2mlnutrientagarmixspreadovera4cnmareaonaglassslideincubated38hinawarmmoistchamberairdried,flame-fixed,stainforcountwithmicroscope.§Petrifilm1 .符培餐基It敷於雉所横成之薄膜上2 .揣带储存方便3 .可用於表面微生物分析§最可能菌数法Most

8、ProbableNumber(MPN).活菌数1.3-tubeor5-tube2. atleast3seriousdilutionsareused3. monitoredbyturbidity,colorchange,orgasproduction4. estimateddata,lessprecisethanagarplatingmethods5. usedforlowcellcounts§染剜逮原法(DyeReductionTestS,活菌数1 .原理：菌f1具reductase富菌醴代翡寸日寺，故使培餐液逮原所需日寺菌数成反比。2 .逮原指示剜：methyleneblue：他好

9、色建成瓢色resazurin：二段式，(1)优1!一紫粉缸，不因O2存在而又建成盛；(2)优粉缸燮瓢色，可因O2存在又氧化成粉缸。3 特性(1)比SPC快(2) 估测直(3) 非所有MO.iS原能力(速度)相同(4) 指示剜可能封部分MO.有抑制作用(5) 食品本身可能亦含逮原利J或酵素而干援§直接横DirectMicroscopicCounts(DMC),活、死菌1 .操作(1)取0.01ml均5(液平均壅抹於1cm2面稹之载玻片上(2)固定(40-50C)、乾燥(3)染色(4)油II下2 .彳f!黑占(1)快速；(2)曾罩；(3)不需其他;(4)觐看菌醴形状；(5)檬品量趣少。3

10、 .缺黑占(1)死、活不分；(2)彳堇遹用於高菌含量檬品；(3)觐察者易疲劳；(4)菌醴可能成困，分散不均，或有些不易染色。现已有方法显分死、活菌HHowardMoldCount1911年由B.J.Howard分析蕃茄裂品中徽菌，另外，械械徽Geotrichumcandidum亦相似，均利用有凹梢载玻片，在US微下，食品中所含徽菌菌总算需有者方能操作，且易疲察§表面微生物椀Tit生物I!表加工械械、器皿、工作台1 .Swab/Swab-RinseMethod最早、最廉泛使用者以棉花棒(潟)It抹固定面稹之物I1表面，再符之放入含瓢菌水之管内，均ST,稀释，平板法若配合ATP分析法，逞

11、抹彳爰，可迅速得知余吉果，常用於清洗效果之押估用。2 .接斶平板法（Contactplate以特殊曼重皿，蹲入15.5-16.5ml之培叠基，筐生击起洋菜培餐基表面，符之覆盖於欲测物面，加盖培餐，菌落数。回收率不高，有人云僮0.1%,即若测得10cfu/cm2,H除含量悬104cfu/cm2。亦有人宣解|示回收率低於抹法（Swabmethocd）,敕遹用於低污染物表面。3 .窗t法（Spraygun）以高屋水冲洗物I!表面，再分析洗液中菌数。封肉品表面菌数分析，此法侵於壅抹法。§代It性受住之微生物（Metabolicallyinjuredorganisms微生物受次死璟境侵害，影警

12、其代就寸（但未死亡），故在逗撵性培餐基上瓢法生是，但可在非逗撵性培餐基生是，故可符檬品分别逗撵性及非逗撵性培餐基分析之，二者之差，即InjuredMO.。食品病原菌之检测管制，常悬不得检出，品由於曾凄藏、或加热等虑理，可能含有受之病原菌（未死），故通常需符檬品均ST液放在遹富非逗撵性培餐液中短暂日寺（14h）,使受菌彳复原，再以逗撵性培餐基分析之。由部分研究K示，培餐液中含丙酮酸或催化等有助於受菌彳复原，此二物ST之功能均悬分解遇氧化物，故推测受菌可能缺乏去除遇氧化物之能力。MO.代翡扑生害可能彝生在系田胞膜（脂ST）、核醵H、DNA、或某些酵素。§不能培餐的活菌（Viablebut

13、non-cultivableorganisms,VBN。VBNC典代就寸害性菌不同，彳爰者可於非逗撵性培餐基修VBNC首被赞现於海洋弧菌，富海水温度被降至5C,弧菌成悬VBNC状Ii。此日寺，platecount者很低，但由以acridineorange之法（可显分死、活），菌数郤非常高。常温度升高，VBNC即可恢彳复原来状熊，虑於VBNC之病菌，仍具致病力，僮毒性敕低。§物理、化分子及免疫分析法A.物理方法1 .11阻抗或厚11度法(Impedance/ConductanceMethod(1)原理：微生物生辰日寺，要利用(分解)璟境中成份，因此改建璟境(培餐液)中霜阻抗博雷度。(2

14、)固定倭器，有其侦测之索敏度。(3)倭器感鹰出11阻抗蹲11度燮化所需日寺fW(Detectiontime)典菌H数成反比。(4)由已知菌数檬品迤行襟型曲之制言丁，再用以分析未知菌数。(5) Vitek公司之Bactometer测K阻抗；Malthus公司郎侦测醇H度。2 .流1O田胞法(flowcytometry)原用危勤物系田胞测定，现可用於酵母菌tf嘎L若配合螯光抗可测特定余田菌。B.化方法1. Thermostablenuclease(1)金黄葡萄球菌具coagulase及therostablenuclease,二者相皆U性高，故藉由食品中Thermostablenuclease活性高

15、低，得知S.aureus多少。然部分enterococcus亦具nuclease活性，且少部分thernostablenuclease(4.3%)。(2)分析thermostablenuclease!代表S.aureus生彘况之僵黑占：(a)耐热性，即使菌11因热死亡，nuclease仍在，而S.aureus所H之踢毒素亦JS热安定性。(b)侦测比踢毒素快。(c)比踢毒素早崖生。(d)不需浸缩即可侦测，踢毒素需浸缩。(e)二者均悬都安定性。2. LimuluslysateforendotoxinsG(一)之outermembrane之lipopolysaccharideLPS)endotoxi

16、nLimuluspolyphemous之amoebocyte(血球系田胞)裂解物蛋白封endotoxin趣敏感(活化)，使得lysate呈H状，早期分析法乃俱测可使lysate成gel之最大食品稀释度(即悬力titer),悬半定量法。近来，彝展出呈色法，加入(如gly(ala)-arg-p-nitroalanine(pNA),富檬品中有LPS,可使coagulase活化,其可符pNA水解,31生p-nitroalanine,测405nm吸光值。EndotoxinFactorCFactorC*IFactorB'FactorB*IProclottingenzyme-Clottingenzy

17、me*:活化状Ii(coagulase)(coagulase*)I_Coagulogen-CoagulinOHCoagulaseCHsOCONHCH2CH30coNHCHCOGlyArgOHNNA:p-nitroalanine3. ATP测定活余田胞均有ATP且系田胞内ATP含量恒定，以菌量而言，含量10181017mole/cell,符菌H内之ATP萃取出来,分析其ATP含量，即接代表菌数多寡。利用螯火蠹彝光械制，来分析ATP:Mg2+LH2+E+ATPELH2-AMP+PPELH2AMP+O2E+L=O+CO2+AMP+LightLH2：luciferinE:luciferaseL=O：o

18、xyluciferinPP:pyrophosphate此法非常快速，可用在工清洗效率押估之快速侦测用。若鹰用在食品上，需克服来自食品之ATP干援，可利用高隹心、遇滤等物理方除去食品SK粒，或添加酵素apyrase逗撵性地破壤食品ATP。4. 螯光性及彝光性基之鹰用常用基ST：4-methlumbelliferyl-3-D-glucuronide(MUG)4-methlumbelliferyl-B-D-galactoside(MUGal)4-bromo-4-chloro-3-Indolyl-3-D-glucuronide(X-Gluc)o-nitrophenyl-B-D-galactopyran

19、oside(ONPG)5-bromo-4-chloro-3-Indoxyl-3-D-glucuronide(BCIG)L-alanine-P-nitroanilied(LAPN)其中以MUG之螯光性基Si最常用，其可被B-D-glucuronidase(GUD)水解，释放出具螯光之4-methyl-umbelliferygroup,E.coli具有GUD,故可用於E.coliBit,>MUG加入大H悍菌群分析用之遑!撵性培餐基中，如lauryltryptosebroth(LTB),有E.coli者，曾jS生螯光，107cell之E.colijS生之GUD才足别侦测至UMUG余吉果。ONP

20、G亦同檬利用，盔B-D-galactosidase水解彳爰，31生黄色(420nm吸光)，用已侦测Coliforms。若NPG及MUG同日寺常作唯一管餐基ST,coliforms呈黄色菌落，黄色菌落同日寺有螯光者悬E.coli。5. Lux基因之光Lux基因mtluciferase之合成，符luxgenelW殖到噬菌在噬菌醴本身，因缺彝光所需之成分，瓢法彝光，利用噬菌H封余田菌言己主之事一性，其基因迤入余田菌彳爰，彝光。可用以分析特定余田菌（病原菌）。C核酸探斜/PCR尊找微生物特有的核酸片段，符之襟示，此即悬核酸探金十。富此probe碰到奥其互未甫序列，11r条吉合（or亲隹交,hybrid

21、ization）,由probe之襟示物，我。号可侦测之。典型分析法：Jg测cell一抽取DNA-内切水解ft泳一奉尊至NCmembrane7加probe行hybridization清洗一值侦测敏感度：104105,若低於此，檬品先enrichment,使少量菌增殖，再侦测之。另外，彝展菌落亲隹交法（colonyhybridization）,乃檬品均St逗撵性培餐基培餐，其上菌落至membrane上，在加reagent,使菌溶裂（lysis）,使DNA露出,成军股，力口probelOU之。近年来，伴随PCR（polymerasechainreaction之放大技循:，使食品中存在之少数菌之DNA

22、,在人悬操控璟境下迤行Primer,DNApolymerase,dATP,dGTP,dCTP,dGTP矍股T罩股矍股一垂股旗裂遇多次循璟(2050cycles),可使罩一DNA分子增至107DNA分子，如此，檬品中即使僮1彳固cell,也可以测到。1 .核酸探金十的僵黑占和缺黑占(1)核酸探金十的侵黑占：(a)核酸探金十不必罩高隹、触化菌株，可省不少的日寺典成本。(b)核酸探金十可以快速定、典之亲隹交的菌株。(c)特昇性高，其受微生物其基因突建或系田胞内的控制影警敕少。(d)封於有械溶剜、亶的容忍度而言，DNA的稳定度比蛋白H悬高。(e)索敏度高。核酸探金十的缺黑占：(a)利用32P-labe

23、led核酸探金十，其府=14天(b)核酸探金十不能探知食品中已存在的毒素。(3)核酸探金十的一般特性：(a)TargetnucleicacidElWW(Wolcott,1991)遑!撵Targetnucleicacid可由下列四方面著手：(i)genomicDNA,物槿曾含随某些特殊的基因片段，故其特昇性甚高。(ii)messengerRNA(mRNA),在生物H内mRNA的量比genomicDNA高出很多，所以比敕容易被倚耽(iii)悬rRNA,造是最有用的核酸探金十来源，它同畤具有用genomicDNA和mRNA探斜的黑占。最彳爰核酸探金十的来可由plasmidDNA所3蔓得，菌31生毒素

24、的基因可能在plasmidDNA上，故可藉此作核酸探金十。(b)探金十的大小探斜的大小可优10nucleotidebaseSM.W.3,300)至10,000base(M.W.3,300,000),然而最常Ji的核酸探斜在14至40base之J。核酸探金十可依其核酸探金十的片段晨度展分成短探金十和探金十。短K探金十，其余隹交的度比敕快，但是事一性敕差且很重隹被label上去。核酸探金十的label核酸探斜label的方法有(Veldetal.,1986a. radioactiveprobeb. biotin-avidinsystemc. mercurationofnucleicacidprob

25、ed. chemicalmodificationofDNAprobee. detectionofUV-radiatedDNAbysepificantibodyf. sulfonatedDNAprobeD.免疫分析利用抗H-抗原事一性余吉合特性，俱阳瞌田菌、毒素或其他污染物抗H-抗原余吉合之侦测：(1)襟示法螯光免疫分析一需螯光K微或螯光分光光度放射性免疫分析一敕昂贵，且有安全及半衰期冏题酵素免疫分析一If泛使用，有多槿分析模式（2）沈殿法抗I1有2彳固抗原余吉合位置，而抗原若悬大分子者，常可奥多彳固抗I1分子余吉合，如此，多彳固抗H、抗原分子余吉合成大分子而不可溶，沈U之。免疫散分析即JS此。

26、免疫IMS散分析(Ouchterlonytest)（3）凝集法符抗H（或抗原）coating在微小Si（粒表面，用已侦测抗原（或抗H）,富奥被侦测物SO吉合，造成微小SK粒崖生凝集现象。所用微小SK粒，早期使用缸血球，但易破，现探用latexbeadIg/1gIgAg由於免疫分析法其索敏度之限制（103105）,菌数太低者,需enrichment,使菌11增殖，在加抗11分析之。另外，抗H事一程度，悬皆封筵所在，否即易有交叉反鹰。目前在食品系统，以EIA及Latexbead之凝集法，最廉泛被使用，而Oxoid所赞展出之Salmonella1-2TestI!於免疫沈激分析法。非逗择性培夷基逗挥性

27、踣羲基食品均ST液，若含Salmonella,其可在其内生H、游勤（含鞭毛），由至非逗撵性培餐管内，而彳爰者加入Salmonella之鞭毛抗碰到Salmonella鞭毛抗原，31生沈平板计数食品A均督液(10-1)(10'3)(10M)(105)(104)速罐稀释PourplateSurfaceplate取0.】mL均皙液取1mL均液37，培泰48小暗Coliforms（三管式MPN）食品>均液(10")建端稀释至少取三置稀释度，每稀释度各接槿於三支核酵管(LST)若崖就者，再接置於BGLB做最彼硅燃PrtrifilmConstructionofSMPetrifilmP

28、latesShrimpPerthCodWhiting45-1234512345炉胪炉炉工中炉炉oJDaoa0a0*040*/Hmo11I11-111t*11-111I1LIIILXXMMXKWXXXK冥KMKXMXX起，.3,5d.oJ.4OOQ22Q12082*Ba91401miODS.LL2.L2.L&5.L5.8.门户产产色产户户p声*L*44_x-1Jr?1OQOooooofrfr-ooooooooofl1iI1111111111111111XKKXXXXXKXKXX箕X,xx宜X99278221403216124,o-£u-tB-2-o14-3-2faT*IL-n-

29、5ngP叫propyM*FilmAdhesjvowrttiTriphenylTwHuecbkvKle(TTC>ColdSolubleGal相iii”StnddrdmtribodsnulriftnlmixodwrlhguargumAdhaswePolyMhyf»nflCoaledPap«cpnniedw4h«firidTabic?2CumparijiondftheStandardPlaLeCountMethod°ndihtI加LriElmMethodforViableCellCcuntaorShrimp,Perch,Cod,andWhitingCol

30、ony-A»rmin$units/gmstandardplateSealbodSamplecauntPetririlmSMSampledwervmuBsagMiinL*ma<hcrfor1minin曲rilediluenLViableeetl翻uM4网eremndracoirdiinSMjmdjELrdrnvthpdIncuheXionlimewas4ghn.al32-U.AU»amptenwertduneinduplicfite.CorrvlHtioncwfficitnlb«lweeakLhetwomMhod4语rFIGURE5-LSpecialcountingg