生化分离技术总结

1、生化分离技术总结A. 蛋白质相关氨基酸混合物的分析分离：为了测定蛋白质的氨基酸组成或从蛋白质水解液中支取氨基酸，需要对氨基酸混合物进行分离分析工作。(考点不是很多)层析即色层分析也即色谱。主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小1. 分配柱层析：层析柱中的填充物或称支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质， 如纤维素、淀粉、硅胶等。其实质就是流动相把各成分从固定相中连续提取出来， 并向下移动，结果分配系数大的成分移动速度大，分配系数小的成分移动速度小， 因而彼此分离。2. 纸层析：以滤纸为载体用来代替层析柱，利用纸上吸附的水为固定相，与水不 想混合的有机溶剂为流动相从纸上流过，达到液 -液连续萃取的目的

2、，使物质得 到纯化或分离。3. 离子交换层析：以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上 的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。4. 薄层层析：快速分离和定性分析少量物质的一种重要实验技术， 属固-液吸附色 谱，兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品的分离，另一方面在 制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，可用来精制样品，适用于挥发性较小 或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。5. 气液层析6. 高效液相层析：高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等

3、流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测， 从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等 学科领域中重要的分离分析技术。蛋白质相关研究方法1. 蛋白质相对分子量的测定(1) 渗透压法测定相对分子质量(2) 沉降分析法测定相对分子质量(3) 凝胶过滤法测定相对分子质量(4) SDS-PAGE法测定相对分子质量2. 蛋白质的分离纯化蛋白质混合物纯化方法性质方法规模大小和体积离心大或小凝胶过滤一般小的透析、超滤*股小的电荷岛子交换匿折大或小1离子交换聚焦-般小的极性一 1»小的等电聚焦般小的疏水世廣硫水层析IK小的-股大的离子强度変化

4、一般小的介电常数变化一般大的特殊结合位点或 结构位点亲和层折一般小的Die hgand 层折大或小亲和洗脱'大戒小免疫吸附般小的共价层析一般小的3. 蛋白质的沉淀：主要是通过引起水化层和电势的变化，使蛋白质发生沉淀.(1) 盐析法(首推，不易引起蛋白质变性)：向蛋白质溶液中加入大量的中性 盐,使其脱去水化层而聚集沉淀.一般不引起蛋白质变性，出去盐后，可复 溶.(2) 有机溶剂沉淀法：加入一定量的极性有机溶剂，使其脱去水化层以及降低 介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉 淀.(3) 重金属沉淀法：当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易于与重 金属结合成不

5、溶性盐而沉淀。(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法：如鞣酸(单宁酸)、苦味酸、钨酸等。(5) 加热变性沉淀法：几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。4. 常考：(整理资料上)等电点沉淀凝胶过滤层析B. 糖类相关糖链的结构分析1. 步骤2. 方法a. 化学方法：（1）高碘酸氧化（2）甲基化分析（3）寡糖顺序降解b. 酶学方法：糖苷酶c. 仪器测定方法：红外光谱IR、激光拉曼光谱、质谱 MS核磁共振NMR FAB-MS FAB快速原子轰击，是一项测定寡糖乃至复杂糖一级结构的有用方 法。C. 脂类相关A.脂质的有机溶剂提取：非极性脂质（三酰甘油、蜡、色素）用乙醚、氯 仿或苯等从组织中提取；膜脂（磷脂、糖

6、脂、固醇）用极性有机溶剂如乙醇 或甲醇提取。B脂质的色谱分离：高效液相色谱（HPLC和薄层层析（TLC），二者分辨 率较咼。C.分析：专一性水解及其产物的气液色谱（GLC或薄层层析（TLC）相结 合的技术常用来测定一个脂的结构。 用质谱分析来确定烃链长度和双键的位D. 核酸相关核酸的分离.提纯和定量测定L DNA的分离核蛋白DNP染色体DNA+组蛋白破碎细胞-i浓盐溶液抽提一-0. 14mol/L盐溶液使DNP沉淀 有机溶剂法：氯仿和酚是蛋白质变性剂，使蛋白质沉淀而与核酸分开； 苯酚抽提，去番白，用乙醛和乙醇沉淀得到纯DNA用氯仿-辛醇(或异丙醇)抽提，方法同苯酚.离心后分为两相：上层水相含D

7、NA冬中层为蛋白质，下层有 机相含变性蛋白质. 蛋白酶水解法：制备大分子DNA,比较温和，常用蛋白酶水 解后苯酚提取细胞悬液2倍体积SDS (1%)f广谱蛋白聲降解蛋白底-苯酚抽提去蛋白RNAase去除RNA2. RNA的分离(1)为防止RNA的降解要注意 器皿要经过特殊处理如高温.焦碳酸二乙酯处理等 加入强变性剂和RNAase抑制剂分离方法 酸性脈盐/苯酚/氯仿抽提 脈盐氯化艳密度梯度离心 分离po 1 y (A) +mRNA常用寡聚胸腺喀唉:核昔酸 (oligo (dT)亲和层析法。3. 测定方法(1) 定磷法样品灰化：浓硫酸或过氯酸处理生成无机磷，在酸性条件下 正磷酸与相酸作用生成磷韬酸

8、，还原剂还原成相蓝，一定范 围内A価与磷含量成正比，计算核酸含量(2) 定糖法RNA戊糖糠醉+地衣酚+三氯化铁绿色A670DNA脱氧戊糖宛基酮醛+二苯朕蓝色鼠盯紫外吸收法：a260核酸的超速离心1、核酸密度的测定氯化艳在离心场中形成线性密/ 当DNA样品的沉降速度与扩散孩区带漂浮于密度楼度的一定位一2、测定DNA中G-C的含量G-C对多的DNA浮力密度大；G-I G-C百分含量与浮力密度呈正H3、溶液中核酸的构象DMA开环冕域 型UWAp = 0 lx15-；盪軒矗软花抱囱度梯廢鮮喜心后J»K D7&及鲁科亲质的分粘4. 用于核酸的制备应用決化乙锭-氯化铠密度梯度平衡超离心，

9、很客易将不同 构象的DNA, RNA和蛋白质分开核酸的凝胶电泳1.琼脂糖凝胶(1)影响迁移率的因素分子大小与分子量的对数成反比胶浓度反比构象：超螺旋最快线性次之开环最慢电压温度核酸的凝胶电泳1. 琼脂糖凝胶电泳 染色：荧光染料渙化乙锭插 入碱基对，紫外光照，橙色 荧光。(3) 分子量测定：加标准分子量 对照(4) 样品回收：切胶条透析袋，电泳，倒置方向，丢弃胶条, 苯酚提取乙醇沉淀.2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳孔径小分析小于一千对碱基不含RNA酶重要名词解释1. PCR聚合酶链式反应，DNA勺体外扩增技术，包括高温变性、低温裂解、适温延伸三个步骤（利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变

10、成单链，低温（经常是 60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。基于 聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。）2. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺 凝胶为网状结构，具有分子筛效应。电泳过程中，依据蛋白质的分子量将其 分离开来。3. Western-blot :免疫印迹，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，用抗体作为探针检测 蛋白质的技术。4. Southern blot :进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射 固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色， 从而检测特定DNA分子的含量。5. Northern blot :是一种通过检测RNA勺表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特