大豆磷脂酰胆碱分离、纯化和检测方法

1、粮食与油脂2003年第2期大豆磷脂酰胆碱分离、纯化和检测方法Separtaion.Purification and Determination of Soy PhoshaUdylchO¨ne汪勇,王兴国1,欧仕益1,唐书泽1,张宁(1暨南大学,广州510632;2江南大学食品学院,无锡214036摘要:综连走豆磷啮酰胆碱分离提纯,包括低级醇萃取.柱层析分离和超临界流体革取等方法。同时也介绍磷脂酰胆碱检测方法,主要是准确度高的高效液相色谱法和新兴的核磁共振法。关键词:磷脂酰胆碱:磷脂HPLC提纯;检测方法中图分类号:TQ645.9+6文献标识码:A文章编号:10089578(20030

2、2o006030前言磷脂酰胆碱(Phosphatidyl choline.简称PC俗称卵磷脂,它是生命活动基础物匝,广泛存在于动植物和人的细胞骥和卵细胞中。它不仅为人体发育提供必需的磷元素,而且还是胆碱和必需脂肪酸的主要来源.胆碱对人脑发育生长及维持脑正常功能是不可缺少物质。磷脂酰胆碱由于对维持细胞膜生理活性和机体正常代谢起到关键作用,被誉为。细胞保护神”。另外,由于其具有良好乳化作用,能降低血巾胆同醇含量:许多研究还表明,磷脂酰胆碱具有保护肝脏和健脑益智作用。目前在美国,磷脂是一种销量排名第三的保健食品,而磷脂酰胆碱是磷脂中晟重要一个组分。在食品工业中.磷脂酰胆碱是一种眭能优越o w型乳化剂

3、,在饮料、冰激凌、人造奶油、糖果、巧克力、焙烤食品、肉制品等领域育着广泛应用。在医药领域中,磷脂酰胆碱被用作注射乳剂乳化剂和脂质体类型的转移剂l“。磷脂酰胆碱一般来源于大豆或卵黄中,而大豆磷脂较卵黄磷脂含有更多不饱和脂肪酸,更符台保健的理念,且来源广泛。由于磷脂酰胆碱具有良好保健功能和广泛应用前景,国内外不少学者对磷脂酰胆碱进行深入细致研究,许多有关分离、提纯PC方法层出不穷,同时也出现不少检测PC纯度手段。1磷脂酰胆碱结构和性质磷脂酰胆碱山甘油基、脂肪酸基团、磷酸基和胆碱构成,其结掏式见图1。O8O CH,一OCR.0I一R:一COCH OlCH2一OPOCHf。CH2NICH3tCH CH

4、图I磷脂酰胆碱结构式其中R一、R:为脂肪酸基团,常见脂肪酸有棕搁酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等。磷脂酰胆碱纯品为自色蜡状固体.低温下可结晶,不溶于丙酮.乙酸乙酯。可溶于甲醇、乙醇,乙醚和氯仿。磷脂酰胆碱暴露在空气中存易氧化.色泽变深揭【4】。收稿日期:200212092磷脂酰胆碱分离和提纯一般用来提纯磷脂酰胆碱的原料是大豆磷脂,因大豆磷脂含有30%左右PC,并且大豆磷脂产量占世界磷脂总产量90%,主要来源于植物油加工业。就提纯PC的原料而言.可分为两类,一类是大豆浓缩磷脂.它含有30%-40%大豆油.60%70%大豆磷脂;另一类是大豆粉末磷脂,它是大豆浓缩磷脂脱油后产品.含有9

5、5%以上大豆磷jill4。也有用蛋黄粉提取磷脂酰胆碱【“.限于篇幅,本文就不再论述。就分离提纯方法而言,有低级醇(乙醇萃取分离法、层析法和超临界二氧化碳萃取法。低级醇萃取分离的主要理论依据是:大豆磷脂中PC极性较强,易溶解于极性乙醇等低级醇中,而大豆磷脂中另外两个重要组分磷脂酰乙醇胺(简称PE.含量28%左右和磷脂酰肌醇(简称PI,含量25%左右极性较弱,在乙醇等低级醇中溶解度较低。利用它们溶解度的差异达到分离提纯PC目的。层析法分离原理是根据大豆磷脂中各个组分和吸附剂结台能力的差异来达到洗脱分离提纯目的。超临界流体萃取磷脂需加入夹带剂以改变流体极性,达到溶解萃取磷脂酰胆碱目的。2.1乙醇萃取

6、分离法谷克仁等(6用85%-95%乙醇对大豆脱油磷脂萃取提纯,20-40.24倍溶剂,萃取次数为13次,最高得到PC古量为52I%大豆磷脂.比原料中PC含量提高两倍。另外.谷克仁【7还对大豆浓缩磷脂进行乙醇分离,提纯磷脂酰胆碱.但得到PC含量在40%以下。吕维忠等【8先用溶剂比2:1乙醇在60萃取大豆浓缩磷脂6次.得到上清液合并。合并液脱除乙醇后得到富含油和磷脂酰胆碱的磷脂,再用溶剂比为8:l丙酮在45萃取磷脂5次以去除其中油脂.达到提纯PC 目的,得到产品中乙醇可溶物为92%。方嘉坚93等先用丙酮脱除大豆浓菲磷脂中油脂.然后用乙醇分提脱油磷脂,分提最佳温度为70,时间l5分钟.此条件下得率最

7、高,但没有测定产品纯度。李卫等【10】用大豆水化油脚为原料,先浓缩干燥得到浓缩磷脂,再用23倍丙酮萃取35次除去浓缩磷脂中油。得到粉末磷脂甩乙醇分提后得到富含PC和部分PE的乙醇革取液,再甩zn¨、Mf+、F一+等金属离子沉淀乙醇萃取液中PE.达到进一步2003年第2期粮食与油脂7提纯PC作用,得到产品PC含量在85%“上。曹幛等、i1用乙醇、正而醇和异丙醇对大豆粉末磷脂进行节取.考察试验参数对砖脂酰胆碱萃取选择性影响。结果表明,低温(一7、低乙醇浓度t85%低料液比【l:5J冉利于提高产品中PC与PE的比值.也就是提高PC含量。据美国专利,介绍.用95%乙醇.溶剂比为25:1,在3

8、5萃取大豆浓缩磷脂,PC溶解于上清液中,蒸发浓缩后得刨PC含量43%,PEl2%,油2L%的磷脂混合物。先用丙酮去除浓缩磷脂中油,再用95%乙醇萃取可将PC等量提高到52%。2.2层析法层析法是在萃取法基础上进一步提纯PC。余佐圆:1二先用乙醇提纯PC,后用丙酮去油.得到PC粗品。再用PC粗品和硅胶混合.上住。用q5%乙醇和氯仿一甲醇溶剂梯度洗脱,定量收集,得到PC纯品与德周产品用薄层色谱分析比较纯度。曹标等【14】用三氧化二铝为固定相,95%乙醇为洗脱液分离提纯大豆粉末磷脂中PC。先用95%乙醇在40。C苹取粉末磷脂中PC,得到上清液,上柱。后用95%乙醇洗脱。结果发现收集前45倍桂体积的洗

9、脱液,得到产品PC含量和收率都大十90%,且洗脱液无毒副作用。徐晨等【I“离心薄层色谱法制备大豆PC,色谱固定相为硅胶GF254,洗脱液为氯仿一甲醇一水(100:20:3体积比,流速为5rain ml。得到产品用液相色谱和标准样品进行比较,结果表明得到产品为PC纯品,并对产品进行薄层色谱双向睫开以验证其纯度。但这种方法处理量很小。在美国专利【l_中曾用硅胶做固定相提纯PC.浓缩磷睹经丙酮脱油后,再用95%乙醇苹取,得到上清液,蒸发后制得PC含量为52%样品。取110克此样品溶解在40克95%乙醇中.上拄。再用95%乙醇洗脱,得到洗脱液4L,收集后3L洗脱液,蒸发可得到PC含量86%产品,得率为

10、50%。2.3超临界流体萃取法超临界流体萃取是近三十年发展兴起新技术,尤其是超临界二氧化碳(scc02l萃取在食品领域应用,使产品更趋向绿色无污染。不少研究学者试图用超临界流体萃取技术提纯PC,单纯的超临界二氧化碳是不溶解磷脂的,但如果在二氧化碳中加入夹带剂乙醇,就可改变超临界二氧化碳溶解特性,使其对磷脂中PC有更好选择性,从而达到分离提纯目的。曹栋等¨6】用超临界二氧化碳并以乙醇为夹带剂对粉末大豆磷脂进行萃取,结果发现这种方法可富集PC,PC由原料中282%,上升到产品中761%。得到结论是要想进一步提高PC 含量,萃取温度应在45左右:压力在25Mpa.且提高压力有利于纯度的提高

11、,夹带剂浓度在15%左右,得到产品PC含量较高。LcylaTeberikler等【l7】用SC-C02,以乙醇为夹带剂萃取大豆睨油磷脂。操作参数为:萃取压力为172Mpa207 Mpa,萃取温度为6080,乙醇浓度为10%125%。萃取压力、乙醇浓度增加有利于PC浓度提高,而温度升高不利于PC纯嚏提高。在萃取温度60、压力207Mpa,10%乙醇、90%SC-CO:混台溶剂萃取大豆脱油磷脂时,萃取物中PC含量高达95%。3磷脂酰胆碱测定方法3.1TLC法20世纪90年代以前,国外分析测定PC含量方法中.TLC 法是一种较为普遍和准确分析手段。但随着HPLC普及,最近10年中TLC法在周外已较少

12、采用,取而代之的是更少受人为因素影响的高效液相色谱和核磁共振检测方法。但上述两种设备价格昂贵,对于国内许多科研机构和企业来说,普及尚有很大困难,所以较为廉价TLC法,仍然有一定价值。不论是TLC (薄层色谱J还是HPLC(高效液相色谱分析磷脂的组成,都是利用正相的硅胶对磷脂各部分进行吸附,再用展开剂(流动相对吸附的样品洗脱解吸。根据各组成部分极性的差异达到分离检测目的。TLC叉分为单向和双向两种.一般单向展开可很好分离磷脂一些主要成分:但仍有一些成分保留值(PO接近,这时就需选择另一种展开剂再一次展开分开这些成分,做进一步成分分析。AOCS Official Method Ja786ll Sl

13、是一种双向展开的方法,用的展开剂A为氯仿甲醇一7N氨水(65:30:4.v/v,v.展开剂B为氯仿一甲醇醋酸一水(170:25:25:6.v/V/V/V;磷脂样品展开后用碘显色,再刮下各显色部分.用高氯酸和硝酸分别消化至无色,在310nm处比色,得到结果用标准曲线定量。马辰等”甩氯仿一甲醇一冰醋酸一丙酮一水(45:25:7:4:2. v”jv7v,v配制展开剂,对磷脂进行展开,不仅可很好分开7种主要磷脂.而且Ps、PI在薄层上也能较好分离。再用钼酸和硫酸肼喷涂,挥干溶剂后用硫酸甲醇(10%显色,在700nm处扫描测定各组成含量。徐桂云20】等用展开剂A:氯仿一甲醇一冰醋酸一丙酮一水(35:25

14、:5:14:2.v/v/v/v/v和展开剂B:正己烷一乙醚(4:1.V/V对大豆磷脂进行双向展开,用磷钼酸乙醇溶液(510%. w/v和Dittmer试剂显色,在检测波长650nm参比波长400nm 下扫描,测定PC含量。3.2HPLC法检测HPLC是一种快速准确检测PC含量方法,一般的柱固定相为硅胶,流动相种类多为正己烷一异丙醇一水或乙腈一甲醇一水;但其中各自的比例,不同研究者之间差别很大。虽脂质缺乏特征吸收,但由于不饱和基团和官能团如:碳碳双键、羰基、磷酸基团、氨基等存在.其在200rim214ilm下有强吸收。所以较为广泛应用检测器是紫外.但也有用荧光、离子火焰、折光指数和光散射等检测器

15、的。董晓渭等【!”用HPLC测定大豆磷脂中磷脂酰胆碱含量,采用Lichrosorb sl一60硅胶色谱柱.以正己烷一异丙醇一磷酸一水(45:48:015:7.5,v v,v/v为流动相。样品用正己烷一异丙醇(1:1,v/v溶解,在紫外检测器206nm下检测.用磷酸代替醋酸盐缓冲液,得到基线很稳定。何新霞等122用HPLC分析大豆磷脂8粮食与油脂2003年第2期山F磷脂种粪繁多,其脂肪酸组成也有很大差异,磷脂必然在uv的吸收较为复杂.这给一些磷脂的定量造成困难,一些学者试图用其他检测器来得到更好分析结果。Rhee等【!二J用折光指数R1检测器替代惯用紫外检测器分析大豆磷脂中磷脂酰胆碱成分,他硐氯

16、仿甲醇一醋酸一水Ilg:14:I.1v、v v做流动相。Grieser等、二4,用梯度洗脱和火焰电离检删器测定大豆磷瞻和玉米磺瞻各组分宙量,得到图谱基线平稳,能很好地检测PC、PE、PI、甚至脂肪酸和甘油三酯的含量。在分析和检测PC含量时,用单一流动相不能把所有的磷脂分离很好.较为合理解决方案是用流动相梯度洗脱。但是当用uv检测器时,由于流动相变化,其基线势必漂移.这就影响分析结果准确性。折光指数检测器同样不能用于有梯度洗脱的HPLC分析。现应运而生一种新的检测器.这就是(蒸发光散射检测器(ESLD。它是把流动相喷入有热气流的捡洲器中.流动相蒸发,而不挥发性脂喷形成微小液滴,这些液滴散射照向光

17、电倍增器的光,引起电流变化,根据脂质量不同.电流大小也不周,从而达到检测目的。从发展眼光丰看,光散射检测器大有取代传统uv检测器态势。Meeren等【o较早使用这种检测器分析大豆磷脂.他用正己烷一异丙醇一水从578:39:32到526:42:5.4 v v、l梯度洗脱大豆磷脂,能很好分析NL(中性脂质、PE,PI、PA和PC。3.3核磁共振法按磁共振NMR技术用于磷脂分析是20世纪90年代才发展成熟新技术.它利用磷原子的”P核磁共振效应来分析各种磷瞻组吱和含量。Gfotlek C-'63用核磁共振分析乙醇分提富集PC磷脂各组分含量,磷脂用甲醇一氯仿溶解,再用EDTA溶液沉淀其中高价金属

18、离子.消除其对”P NMR干扰,核磁共振在2024MNz下对磷脂进行分析。不周类型磷脂由于化学环境不同,”P化学位移也不同.由此来确定各种不同磷日日种类,而各种磷脂古量由核磁响应信号的积分确定。施邑屏等1用”P核磁共振分析针剂大豆磷脂巾磷脂酰胆碱组分含量,他用90MHz 核磁共振光谱分析.用85%磷酸和氘代氯仿作参比。参考文献(1赵交娟,蔡同一,赵文武跨世纪的保健佳品大豆磷脂Ij】粮食与油脂,2000.(3l:18202刘小杰,袁长贵大豆磷脂的研究进展【J】中国食品添加刑.200I(41:l5-19(3刘元法.王兴周大豆磷脂的组成卅西部粮油科技,2000.2514l40一424刘兀法,王兴围大

19、豆磷脂组成与特性I川粮食与油脂,2000,(3】:11一145迟玉杰,林淑英卵黄卵磷晤提取与应ffj研究进展食品与发酵工业.200228(550536荇克仁,张君杰脱油大豆磷脂的溶剂分提中国油脂200l26(61:49507井克仁浓缩大豆磷脂的溶刺分提【川中国油脂,2002.271:3I一338吕维忠,钟振亩大豆磷脂中磷脂酰咂碱的分离工艺研究【JI韶关大学学报,2000.(4:120一124【9方嘉坚,陈龙大豆印磷脂的提纯【J】食品科学.20002113;25-2810李卫.邵友元,黄光斗高纯度大豆卵磷脂制备研究如中国(11曹拣,裘爱泳,王兴国,等低级醇对大豆磷脂中磷脂酰胆碱和13余佐圆层析法

20、分离纯化大豆卵磷脂【J1华南师范大学学报,1996.11:889014曹栋.裘爱泳,王兴国,等三氧化二铝柱层析法分离大豆磷脂中磷脂酰胆碱的研究中国油脂,2001.2616:5I-53I5绦晨,杨丽苹离心薄层色谱法提纯大豆磷脂酰胆碱的研究(J|化学试荆,2001.23(31:I39140(16】曹栋,裘噩泳,王兴国.等超临界流体分离大豆磷脂酰胆碱中同油脂,200227【3727317Leyla Teberikler,Sefa Koseoglu SlectKe extraction ofphosphatldylcholme from lecithin by supererittcaI carbon

21、dioxide ethanol mixtureJAOcs200178(2:1l5一I18(18AOCS OITlcial Method ja78619马辰,段宏瑾大豆磷脂中磷脂类成分的含量测定【JI中国中药杂志.199924(1167l一67220】徐桂云,常理丈、大豆磷瞻组成的薄层色谱分析舒析化学,i998.26(I:8I一842I董晓渭,冯学伟,等高技掖相色谱测定大豆磷脂中的磷脂酰胆碱I朋华东理工大学学报,2000.26(31:3l531722何新霞,郑孝华.等HPLC法测定大豆磷脂中卵磷脂含量食品科学,2000,21(2:57-5923J S Rhee and M G Shin Anal

22、ysis of phosphatldyIchoIInein soy lecithinsby HPLC26Thomas Glonek”P nuclear magnelic resonance phos-pholipid analysis ofanionic-enriched lecithin【J1JAOCS.199875(5l:569573(27施邑屏,黎燕斌,等”P核磁共振光谱担薄层色谱分析针剂大豆卵磷脂fJl分析化学,199¨9(7:733-736 大豆磷脂酰胆碱分离、纯化和检测方法作者:汪勇, 王兴国, 欧仕益, 唐书泽, 张宁作者单位:汪勇,欧仕益,唐书泽,张宁(暨南大学,广州

23、,510632, 王兴国(江南大学食品学院,无锡,214036刊名:粮食与油脂英文刊名:CEREALS & OILS年,卷(期:2003(2被引用次数:12次参考文献(27条1.何新霞;孝华HPLC法测定大豆磷脂中卵磷脂含量期刊论文-食品科学 2000(022.董晓渭;冯学伟高效液相色谱测定大豆磷脂中的磷脂酰胆碱期刊论文-华东理工大学学报(自然科学版 2000(033.徐桂云;常理文大豆磷脂组成的薄层色谱分析 1998(014.方嘉坚;陈龙大豆卵磷脂的提纯期刊论文-食品科学 2000(035.吕维忠;钟振声大豆磷脂中磷脂酰胆碱的分离工艺研究 1999(046.谷克仁浓缩大豆磷脂的溶剂分

24、提期刊论文-中国油脂 2002(017.谷克仁;张君杰脱油大豆磷脂的溶剂分提期刊论文-中国油脂 2001(068.迟玉杰;林淑英卵黄卵磷脂提取与应用的研究进展期刊论文-食品与发酵工业 2002(059.刘元法;王兴国大豆磷脂组成与特性 2000(0310.刘元法;王兴国大豆磷脂的组成期刊论文-西部粮油科技 2000(0411.施邑屏;黎燕斌31P核磁共振光谱及薄层色谱分析针剂大豆卵磷脂 1991(0712.Thomas Glonek31P nuclear magnetic resonance phospholipid analysis of anionic-enriched lecithin 1998(0513.Paul Van Der Meeren;Jan Vanderdeelen Simple and rapid method for high-performance liquid chromatographic separation and quantification of soybean phospholipids 198814.Merlin D Grieser;Jereme N Greske High performance liquid chromatography of