第四章 DNA复制损伤与修复

1、lDNADNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。长链大分子，是遗传信息的携带者。l生物体的遗传信息就贮存在生物体的遗传信息就贮存在DNADNA的四的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。种脱氧核糖核酸的排列顺序中。 lDNADNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNADNA的复制、转录和翻译过程就构成了的复制、转录和翻译过程就构成了遗遗传学的中心法则传学的中心法则。 l在在RNA

2、RNA病毒中，其遗传信息贮存在病毒中，其遗传信息贮存在RNARNA分分子中。因此，在这些生物体中，遗传信子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是息的流向是RNARNA通过复制，将遗传信息由通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给息传递给DNADNA，再由，再由DNADNA通过转录和翻译通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就丰富了丰富了中心法则的内容中心法则的内容。 DNA dependent DNA polymeraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDR

3、PRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDP 复制（复制（DDDPDDDP） 转录（转录（DDRPDDRP） 翻译翻译 DNA RNA DNA RNA 蛋白质蛋白质 反转录（反转录（RDDPRDDP） RNA RNA 复制（复制（RDRPRDRP） lA gene is expressed in two stepsA gene is expressed in two stepsTranscription: RNA synthesisTranscription: RNA synthesisTranslation

4、: Protein synthesisTranslation: Protein synthesisDNADNA复制的基本过程：复制的基本过程：l复制的起始复制的起始 (initiation)lDNA链的延伸链的延伸 (elongation)l复制的终止复制的终止 (termination)一、一、DNADNA复制的半保留性复制的半保留性 lDNADNA在复制时，以亲代在复制时，以亲代DNADNA的每一股作模的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代板，合成完全相同的两个双链子代DNADNA，每个子代每个子代DNADNA中都含有一股亲代中都含有一股亲代DNADNA链，链，这种现象称为这种现象称为

5、DNADNA的半保留复制的半保留复制(semi-(semi-conservative replication)conservative replication)。 l DNADNA以半保留方式进行复制，是在以半保留方式进行复制，是在19581958年由年由M. M. Meselson Meselson 和和 F. Stahl F. Stahl 所完成的实验所证明。该实验所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含首先将大肠杆菌在含1515N N的培养基中培养约十五代，使的培养基中培养约十五代，使其其DNADNA中的碱基氮均转变为中的碱基氮均转变为1515N N。将大肠杆菌移至只含。将大肠杆菌移

6、至只含1414N N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNADNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：，作密度梯度离心，可得到下列结果： 二、复制起点的结构特征二、复制起点的结构特征lDNADNA在复制时，需在特定的位点起始，这在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。即复制起始点（复制子）。3个连续的13bp序列，富含AT反向重复出现四次9bp序列酵母自主复制序列在原核生物中，复制起始点通常为一个，在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个

7、。而在真核生物中则为多个。 三、三、RNARNA引物引物 参与参与DNADNA复制的复制的DNADNA聚合酶，必须以一段具有聚合酶，必须以一段具有3 3端自由羟基（端自由羟基（3 3-OH-OH）的）的RNARNA作为引物作为引物(primer) (primer) ，才能开始聚合子代，才能开始聚合子代DNADNA链。链。RNARNA引物的大小，通常为引物的大小，通常为1 11010个核苷酸。个核苷酸。RNARNA引物的碱基顺序，与其模板引物的碱基顺序，与其模板DNADNA的碱基的碱基顺序相配对。顺序相配对。 四、双向复制四、双向复制 DNADNA复制时，以复制起始点为中心，向复制时，以复制起始

8、点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。也可进行单向复制（如滚环复制）。 五、五、DNADNA的半不连续复制的半不连续复制l由于由于DNADNA聚合酶只能以聚合酶只能以5353方向聚方向聚合合子代子代DNADNA链链，即，即模板模板DNADNA链链的方向必的方向必须为须为3535。因此，分别以两条亲代。因此，分别以两条亲代DNADNA链作为模板聚合子代链作为模板聚合子代DNADNA链时的方链时的方式是不同的。式是不同的。l以以3535方向的亲代方向的亲代DNADNA链作模板的子链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其

9、代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为子代链的聚合方向为5353，这一条，这一条链被称为链被称为前导链前导链(leading strand)(leading strand)。而。而以以5353方向的亲代方向的亲代DNADNA链为模板的子链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是合方向也是5353，这条链被称为，这条链被称为滞滞后链后链(lagging strand)(lagging strand)。l由于亲代由于亲代DNADNA双链在复制时是逐步解开的，双链在复制时是逐步解开的，因此，滞后链的合成也是一段一段的。因此，滞后链的合成也

10、是一段一段的。DNADNA在复制时，由滞后链所形成的一些子在复制时，由滞后链所形成的一些子代代DNADNA短链称为短链称为冈崎片段冈崎片段(Okazaki (Okazaki fragment)fragment)。l冈崎片段的大小，在原核生物中约为冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000100020002000个核苷酸，而在真核生物中个核苷酸，而在真核生物中约为约为100100个核苷酸。个核苷酸。 半不连续复制半不连续复制 Semi-discontinuous replication 冈崎片段冈崎片段Okazaki fragmentLeading strandLagging strandRepl

11、ication fork前导链的连续复制前导链的连续复制和和滞后链的不连续复制滞后链的不连续复制在生物界是有在生物界是有普遍性的，因而称之为普遍性的，因而称之为DNA的半不连续复制的半不连续复制。（1）以原来的DNA母链为模板（template），复制产生新的子链。（2）作为模板的双链DNA分子需要解链以暴露隐藏在双螺旋结构核心的碱基序列，然后才能作为模板。（3）复制的方式是半保留（semi-conservative）。（4）需要引物,一般是长度为615nt的短RNA，少数为蛋白质。（5）复制的方向总是53（6）复制起始于特定的区域，但终止的位置通常不固定。原核生物和真核生物的DNA复制起始区

12、数目不同，前者只有一个，而后者则有多个（7）一般为双向复制（8）半不连续性（9）具有高度的忠实性在细胞中，双螺旋在细胞中，双螺旋DNADNA复制是复制是DNADNA聚合聚合酶催化的酶促反应过程。但酶催化的酶促反应过程。但DNADNA聚合酶只聚合酶只能延长已有的能延长已有的DNADNA或或RNARNA引物链，不能从引物链，不能从头起始头起始DNADNA链的合成；而且在链的合成；而且在DNADNA复制中复制中形成特殊的复制叉（或生长叉）结构区形成特殊的复制叉（或生长叉）结构区内，内，DNADNA双螺旋中的两条链缠绕在一起，双螺旋中的两条链缠绕在一起，要拷贝每一条链都必须将双螺旋要拷贝每一条链都必须

13、将双螺旋DNADNA解旋解旋（unwindingunwinding），并释放或吸收由此产生），并释放或吸收由此产生的扭力，这就要求双螺旋和超螺旋的解的扭力，这就要求双螺旋和超螺旋的解旋与重新形成，旋与重新形成，DNADNA聚合酶不能完成这一过聚合酶不能完成这一过程；在不连续合成中形成短的冈崎片段程；在不连续合成中形成短的冈崎片段（Okazaki fragmentOkazaki fragment）的连接也是）的连接也是DNADNA聚合聚合酶无法完成的。实际上，在复制叉处进行酶无法完成的。实际上，在复制叉处进行复杂的复杂的DNADNA复制过程中，需要许多相关的酶复制过程中，需要许多相关的酶和蛋白因

14、子参与。主要有：和蛋白因子参与。主要有： DNADNA聚合酶聚合酶； DNADNA解旋酶解旋酶； 使使DNADNA双股链在复制叉双股链在复制叉解开的解开的解链酶解链酶； 在在DNADNA复制前防止解开复制前防止解开的的DNADNA单链局部退火的单链局部退火的DNADNA结合蛋白结合蛋白； 合合成成RNARNA引物的引物的引发酶引发酶； 除去除去RNARNA引物的酶；引物的酶； 使冈崎片段使冈崎片段共价连接的共价连接的DNADNA连接酶连接酶等重要的酶与等重要的酶与蛋白因子。蛋白因子。（一）（一） DNADNA聚合酶聚合酶种类和生理功能：种类和生理功能：l在原核生物中，目前发现的在原核生物中，目

15、前发现的DNADNA聚合酶有聚合酶有五种，分别命名为五种，分别命名为DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol），），DNADNA聚合聚合酶酶（polpol），）， DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol）前三种酶）前三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与与DNADNA复制的主要是复制的主要是polpol和和polpol。 polpol最有可能参与DNA的修复。lpolpol为单一肽链的大分子蛋白质为单一肽链的大分子蛋白质, ,可被可被特异的蛋白酶水解为两个片段

16、，其中的特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为大片段称为Klenow fragmentKlenow fragment，具有，具有5353聚合酶聚合酶活性和活性和3535外切酶外切酶的活的活性。性。 lpol pol 由十种亚基组成，其中由十种亚基组成，其中亚基具亚基具有有5353聚合聚合DNADNA的酶活性，因而具有的酶活性，因而具有复制复制DNADNA的功能；而的功能；而亚基具有亚基具有3535外切酶的活性，因而与外切酶的活性，因而与DNADNA复制的校正功复制的校正功能有关。能有关。 lDNA聚合酶和是在1999年才被发现的，它涉及DNA的错误倾向修复(errorprone repa

17、ir)。当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，使修复缺乏准确性（accuracy)，因而出现高突变率。高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。 原核生物中的三种原核生物中的三种DNADNA聚合酶聚合酶 pol pol pol pol pol pol 5 533聚合酶活性聚合酶活性 + + + + + + 5 533外切酶活性外切酶活性 + + - - - - 3 355外切酶活性外切酶活性 + + + + + + 生理功能生理功能 去除引物去除引物, ,填补缺口填补缺口 未知未知 DNA DNA 复制复制 修复损伤修复损伤 校正错误校正错误 校正错

18、误校正错误 l在真核生物中，目前发现在真核生物中，目前发现1515种种DNADNA聚合酶，聚合酶，但最重要的是最早发现的五种，分别命但最重要的是最早发现的五种，分别命名为名为DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合聚合酶酶（polpol），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol）。）。l其中，参与染色体其中，参与染色体DNADNA复制的是复制的是polpol（延长滞后链）和（延长滞后链）和polpol（延长前导链），（延长前导链），参与线粒体参与线粒体DNADNA复制的

19、是复制的是polpol，polpol与与DNADNA损伤修复、校读和填补缺口有关，损伤修复、校读和填补缺口有关，polpol只在其他聚合酶无活性时才发挥作只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。用。 性质DNApolDNApolDNApolDNApolDNApol亚细胞定位细胞核细胞核线粒体基质细胞核细胞核引发酶活性有无无无无亚基数目414354内在的进行性中等低高低高在PCNA存在时的进行性中等低高高高3-外切酶活性无无有有有5-外切酶活性无无无无无生物功能细胞核DNA复制细胞核DNA修复线粒体DNA复制细胞核DNA复制细胞核DNA复制和修复分裂细胞核抗原（proliferating cell n

20、uclear antigen，PCNA）为聚合酶的辅助蛋白，可提高聚合酶的进行性（二）（二）DNADNA复制的保真性：复制的保真性：l为了保证遗传的稳定，为了保证遗传的稳定，DNADNA的复制必须具的复制必须具有高保真性。有高保真性。DNADNA复制时的保真性主要与复制时的保真性主要与下列因素有关：下列因素有关： 1 1遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律； 2 2DNADNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；聚合酶在复制时对碱基的正确选择； 3 3对复制过程中出现的错误及时进行校对复制过程中出现的错误及时进行校正。正。 天然DNA的负超螺旋虽然有利于DNA的解旋，但随着复制的进行，复

21、制叉前方亲代DNA中仍积累巨大的张力，因此复制中需要DNA解旋酶去除解链酶的解链产生的扭曲张力。 大肠杆菌中的DNA解旋酶（gyrase）又称拓扑异构酶（topoisomerase ），由四个亚基组成四聚体22，而真核的呈二聚体。DNA解旋酶的作用机制如图所示。Topoisomerase rapidly remove the positive supercoils accumulate in front of the replication fork.DNA解旋酶每作用一次产生两个负超螺旋，因此可以消除复制叉向前移动所产生的正超螺旋，并且复制完的两个子代DNA双链的分离也需要DNA解旋酶的催化

22、功能。当加入DNA解旋酶的抑制剂如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixic acid）等时均能抑制细菌DNA的合成。可见DNA解旋酶是DNA复制所必不可少的。DNA解旋酶对真核细胞有丝分裂也是非常重要，如果不解开缠绕，在任何细胞周期中姐妹染色体都将无法分离。此外，DNA解旋酶在转录、同源重组及可移动元件的转座中都起重要作用。 复制过程中，复制叉在不断前进，复制叉前方的亲代DNA就需不断解链，为使复制能够顺利进行，就必须防止DNA单链的链间或链内局部“退火”并保证其完整性与伸展性，使单链DNA处于稳定的状态。承担上述任务是DNA解链酶（D

23、NA helicase）和单链DNA结合蛋白DNA解链酶作用模型解链酶作用模型（single-strand binding protein, SSB）。 DNA解链酶是利用ATP水解获得的能量来打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称（又称解螺旋酶）。原核生物大肠杆菌为DnaB和Rep蛋白，DnaB结合于滞后链模板DNADNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋沿53方向前进，Rep蛋白结合于前导链模板沿35方向移动（见图）。真核生物病毒中大T-抗原（T-antigen, T-ag）具解开双链的功能。此外也在一些真核生物中分离纯化出多种DNA解链酶，其功能还在鉴定证实中。 图2

24、-7 DNA双螺旋的解旋DNADNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋 单链DNA结合蛋白（SSB）在细胞内行使很多涉及单链区域稳定性的功能（如同源重组）。在复制中，这包括稳定熔解起点，维持解旋酶活性，从DNA模板上去除二级结构以及抑制核酸酶活性。即SSB与DNA单链相结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。在E.coli中SSB为 四聚体，对单链DNA有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲合力。它们与DNA结合时有协同作用，即有一个SSB与DNA结合时，就会有更多的SSB迅速结合上去扩展分布整个DNA单链，将DNA包被上蛋白

25、聚合体。SSB有某些碱基组成的倾向性，但很少有顺序专一性结合，可以周而复始地循环使用，在DNA的修复和重组中都有SSB的参与。 单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白单链单链DNADNA结合蛋白（结合蛋白（single strand binding single strand binding protein, SSBprotein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（）又称螺旋反稳蛋白（HDPHDP）。）。这是一些能够与单链这是一些能够与单链DNADNA结合的蛋白质因子。结合的蛋白质因子。其作用为：其作用为： 使解开双螺旋后的使解开双螺旋后的DNADNA单链能够单链能够稳定存在，即稳定单链稳定存在，即稳

26、定单链DNADNA，便于以其为模板，便于以其为模板复制子代复制子代DNADNA； 保护单链保护单链DNADNA，避免核酸酶，避免核酸酶的降解。的降解。 已经证明，DNA的半不连续复制中，DNA聚合酶不能从头起始新的DNA链合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今为止，人们所发现的引物大多为一段RNA，其长度和序列随着基因组的种类而表现出不同，在大多数情况下为110个核苷酸（表2-3）。基因组引物长度主要的引物序列*T7T4174大肠杆菌海胆果蝇多瘤病毒动物151515大约1018大约9大约10大约9pppApCpC/ApN12 (N主要为A和C)pppApCpN3pppAp N04pppAC

27、(N) 710(p) ppA/Gp N7pppA (N) 79pppA/Gp N9末测定表5-3 DNA复制中滞后链前体片断的RNA引物 催化RNA引物（RNA primer）合成的酶叫引发酶（primerase）。引发酶识别DNA单链模板特异顺序，以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸产生3-OH，为DNA聚合酶起始生成磷酸二酯键提供条件。引物与典型的RNA（如mRNA）不同，它们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。E.coli的引发酶是一条肽链，分子量为60 000，每个细胞中有50100个分子，它是由大肠杆菌dnaG基因所编码的。该酶单独存在时是相当不活泼的，只有在与有关蛋白质

28、相互结合成为一个复合体时才有活性。这种复合体就称为引发体。机体选择RNA作为引物，其原因可能在于减少致死突变（lethal mutation）。DNA复制中，从模板拷贝最初的几个核苷酸时，由于碱基堆集力很弱，其氢键结合能力也很弱，因而碱基对的错配几率就大很多，加上这几个核苷酸还没有与模板形成稳定的双链结构，DNA聚合酶35校对功能很难发挥作用。因此为了保证生物DNA复制的保真度，采用以RNA为引物这种过渡形式，既为DNA聚合酶提供3-羟基端，又容易被 DNA聚合酶识别而停止其聚合作用，且便于DNA聚合酶进行切口平移。切口平移过程中发生错误的几率极少，因为DNA聚合酶（pol I）有35外切核酸

29、酶活性，具有校对功能。 DNA DNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)可催化两段可催化两段DNADNA片段之间片段之间磷酸二酯键磷酸二酯键的形成，而使两的形成，而使两段段DNADNA连接起来。连接起来。l DNADNA连接酶催化的连接酶催化的条条件件是：是： 需一段需一段DNADNA片段具有片段具有3-OH3-OH，而，而另一段另一段DNADNA片段具有片段具有5-Pi5-Pi基基； 未封闭未封闭的缺口位于双链的缺口位于双链DNADNA中，即其中有一条链中，即其中有一条链是完整的是完整的； 需要需要消耗能量，在原核生消耗能量，在原核生物中由物中由NADNAD+ +供

30、能，在供能，在真核生物中由真核生物中由ATPATP供供能。能。 DNA复制通常是从双螺旋的特定位置复制原点（ori）开始，一般是富含A-T的区段，该区段的双链DNA具有较强的呼吸作用（breathing），是经常瞬间处于打开形成单链的区段（frequently opening region），由此产生的瞬时单链与SSB蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）结合，对复制的起始十分重要。 原核生物的复制原点通常为一个，而真核生物则有多个特定的复制原点。图2-17 DNA复制的不同方式 依DNA合成的起始方式，复制可分为从新起始与共价延伸两种类型： 一

31、、复制叉式复制 二、 环状环状DNA双链的复制双链的复制 一、复制叉式复制一、复制叉式复制(一一)、复制的起始、复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。复制的起始阶段，由下列两步构成。 1、预引发：、预引发： （ 1）解旋解链，形成复制叉：）解旋解链，形成复制叉：l 由拓扑异构酶和解链酶作用，使由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链断裂，形成两条单链DNA。单链。单链DNAl结合蛋白（结合蛋白（SSB）结合在两条单链）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。上，形成复制叉。 DNA复制时，局部双复制时，

32、局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为称为复制叉复制叉。对于双向复制而言，形成。对于双向复制而言，形成的的两个复制叉向相反方向行进两个复制叉向相反方向行进，每个复，每个复制叉上的两条制叉上的两条DNA链均被拷贝。链均被拷贝。图5-12 复制叉 （箭头表示子链总的生长方向） （2 2）引发体组装：）引发体组装：l由蛋白因子（如由蛋白因子（如dnaBdnaB等）识别复制起始等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。组装形成引发体。 2 2、引发：、引发：在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNAD

33、NA为模板，合成为模板，合成一段短的一段短的RNARNA片段，从而获得片段，从而获得33端自由羟端自由羟基（基（3-OH3-OH）。）。 （二）、复制的延长（二）、复制的延长 1 1、聚合子代、聚合子代DNADNA：由由DNADNA聚合酶催化，以聚合酶催化，以3535方向的亲代方向的亲代 DNADNA链为模板，从链为模板，从5353方向聚合子方向聚合子代代DNADNA链。在原核生物中，参与链。在原核生物中，参与DNADNA复制复制延长的是延长的是DNADNA聚合酶聚合酶；而在真核生物中，；而在真核生物中，是是DNADNA聚合酶聚合酶(延长滞后链延长滞后链) )和和（延长（延长前导链）前导链）。

34、2 2、引发体移动：、引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，滞后链重新合成形成新的复制叉，滞后链重新合成RNARNA引引物，继续进行链的延长。物，继续进行链的延长。 （三）、复制的终止（三）、复制的终止 1 1、去除引物，填补缺口：、去除引物，填补缺口：在原核生物中，由在原核生物中，由DNADNA聚合酶聚合酶来水解去除来水解去除RNARNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处引物，并由该酶催化延长引物缺口处的的DNADNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，口。而在真核生物中，RNARNA引物

35、的去除，引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由段仍由DNADNA聚合酶来延长。聚合酶来延长。 2 2、连接冈崎片段：、连接冈崎片段：l在在DNADNA连接酶的催化下，形成最后一个磷连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的整的DNADNA长链。长链。 (1)型型 (2) 滚环型滚环型(rolling circle) (3) D-环型环型(D-loop)大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒DNADNA双向复制双向复制的模式与实验验证。的模式与实验验证。左：左：形复制模式图；右：形复制模式图；右：3 3

36、H H标记质粒标记质粒DNADNA合成图。合成图。（一）环状（一）环状DNADNA双链的双链的型复制型复制（二）、（二）、滚环式复制：滚环式复制：环状环状DNADNA可以通过这种方式产生可以通过这种方式产生多单元单链多单元单链DNADNA双链环状双链环状DNA复制起始于某复制起始于某一条一条DNA链上链上新生新生DNA链延伸，链延伸，不断取代母链不断取代母链复制一圈，产生复制一圈，产生单位长度的线性单位长度的线性DNA链链若复制继续进行，若复制继续进行，可产生多单元线可产生多单元线性性DNA链链单向复制单向复制的特殊方式X174的双链DNA复制型(RF)滚环式复制滚环式复制（三）（三）D lo

37、ops单向复制单向复制的特殊方式的特殊方式 双链环状DNA中的一条前导链已经引发并开始合成，与其模板形成双链结构，而另一条亲本链则被前导链置换出来成为单链状态。 这种由一条单链和一条双链组成的三元泡状结构，叫做置换噜噗或D-噜噗（displacement loop）。只有前导链将另一条亲本链（即滞后链的模板）的特别序列置换出来成为单链形式，才能产生滞后链前体的引发并合成其互补链。线粒体DNA的复制就是以这种有趣的不对称方式进行复制，并由真核DNA聚合酶负责。 三、真核生物三、真核生物DNADNA的复制特点的复制特点 ( (一）、真核生物有一）、真核生物有多处复制起始点多处复制起始点。（二）、真

38、核生物（二）、真核生物复制子相对较小复制子相对较小，为，为40-10040-100千千碱基对。在全部完成复制之前，各个起始点上碱基对。在全部完成复制之前，各个起始点上DNADNA的复制不能再开始。的复制不能再开始。DNADNA复制复制只在只在S S期进行期进行。真核生物真核生物DNA的的复制子复制子被称为被称为ARS (autonomously replicating sequences)，长约长约150bp左右，包括数个复制起始必左右，包括数个复制起始必需的保守区。需的保守区。真核生物真核生物DNA复制的起始需要复制的起始需要起始点识别复合物起始点识别复合物（origin recogniti

39、on complex，ORC）参与，）参与，ORC结合于结合于ARS，它是由，它是由6种蛋白质组成的启动复合物。种蛋白质组成的启动复合物。 （三）、真核生物（三）、真核生物DNA复制叉的复制叉的移动速度大约只有移动速度大约只有50bp/秒，还不到秒，还不到大肠杆菌的大肠杆菌的1/20。因此，人类。因此，人类DNA中中每隔每隔30,000-300,000bp就有一个复制就有一个复制起始位点。起始位点。（四）、（四）、DNA聚合酶聚合酶 真核生物真核生物DNA聚合酶有聚合酶有15种以种以上，在哺乳动物细胞中主要有上，在哺乳动物细胞中主要有5种种DNA聚合酶聚合酶，分别称为，分别称为DNA聚合聚合酶

40、酶、和和 。真核生物真核生物DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较性质性质DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶亚基数亚基数4122-31在细胞内在细胞内分布分布核内核内核内核内线粒体线粒体核内核内核内核内(?)功能功能DNA引物合引物合成成损伤修损伤修复复线粒体线粒体DNA复制复制主要主要DNA复复制酶制酶DNA复复制制(?)35外外切切无无无无有有有有有有53外外切切无无无无无无无无无无 DNA聚合酶聚合酶主要参与主要参与引物合成引物合成。DNA聚合酶聚合酶活性水平稳定，主要在活性水平稳定，主要在DNA损损伤的修复伤的修复中起作用。中起作

41、用。DNA聚合酶聚合酶主要负责主要负责DNA的复制。的复制。DNA聚合酶聚合酶与后随链合成有关，在与后随链合成有关，在DNA合合成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中起着重要的作用。起着重要的作用。DNA聚合酶聚合酶 在线粒体在线粒体DNA的复制中发挥的复制中发挥作用。作用。 真核生物中还存在真核生物中还存在 、 、 和和 等等几种几种DNA聚合酶，它们承担着聚合酶，它们承担着修修复损伤复损伤的功能，但这些修复酶的的功能，但这些修复酶的忠实性都很低。忠实性都很低。 （五）真核生物（五）真核生物端粒端粒和和端粒酶端粒酶：l端粒端粒（telomeretelomer

42、e）是指真核生物染色体）是指真核生物染色体线性线性DNADNA分子末端的结构部分，通常膨大分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富成粒状。其共同的结构特征是由一些富含含G G、C C的短重复序列构成，可重复数十的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。次至数百次。 l 线性线性DNADNA在复制完成后，其末端由于引物在复制完成后，其末端由于引物RNARNA的水解而可能出现缩短。故需要在的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶端粒酶（telomerasetelomerase）的催化下，进行延长反应。）的催化下，进行延长反应。l 端粒酶端粒酶是一种参与真核生物染色体末端的端是一种参

43、与真核生物染色体末端的端粒粒DNADNA复制的复制的RNA-RNA-蛋白质蛋白质复合体，其本质是一复合体，其本质是一种逆转录酶，它可以其种逆转录酶，它可以其RNARNA为模板，通过为模板，通过逆转逆转录录过程对末端过程对末端DNADNA链进行延长。链进行延长。 被延长的TG链可以作为合成冈崎片段的模板，使端粒形成双链。 端粒酶以自身的RNA作为端粒DNA复制的模版，合成出富含脱氧单磷酸鸟苷Deoxyguanosine Monophosphate(dGMP)的DNA序列后添加到染色体的末端并与端粒蛋白质结合，从而稳定了染色体的结构。 细胞发生癌变后，端粒酶活性比正常时明显增高，端粒DNA这种渐进

44、性缩短趋势受到阻碍，使正常细胞转化成具有无限分裂能力的永生化恶性细胞。 端粒酶的活性是癌细胞的一种标志，可以作为癌症治疗中的一个靶子。l作为一种能决定生命状态存在和延续的生物大分子，DNA在遗传过程中必需保持高度的精确性和完整性，而且这种性能是细胞中任何一种分子都无法与之相比的。尽管如此，在DNA复制过程中，仍难免会存在少量未被校正的差错。此外，DNA还会受到各种物理和化学因素的损伤。这些差错和损伤如果不被修复，将会产生严重的细胞学后果，因为DNA分子本身是无法替代的，一个细胞通常只有1-2套基因组DNA，而不像蛋白质和RNA分子那样，能利用DNA中的遗传信息不断产生新的分子来替代受损伤的分子

45、。所以，维护DNA遗传信息的稳定性对生物细胞来说是极其重要的。在漫长的生命进化过程中，生物体不仅演化出能纠正复制错误的“校正”系统，而且在细胞中形成了多种多样的DNA修复系统，能对各种DNA的损伤进行修复，恢复DNA正常的超螺旋结构，以保持每个世代遗传信息的稳定性。极少数不能修复的DNA损伤将会导致基因的突变，其中一部分突变将有利于物种的进化，而另一部分突变将导致细胞发生变异和死亡。l由自发的或环境的因素引起由自发的或环境的因素引起DNADNA一级结构一级结构的任何异常的改变称为的任何异常的改变称为DNADNA的损伤的损伤。l常见的常见的DNADNA的损伤包括的损伤包括碱基脱落碱基脱落、碱基修

46、碱基修饰、交联，链的断裂，重组饰、交联，链的断裂，重组等。等。（一）引起（一）引起DNADNA损伤的因素：损伤的因素： 1 1自发因素：自发因素： 1)1)脱嘌呤和脱嘧啶脱嘌呤和脱嘧啶 在生理条件下，在生理条件下，DNADNA分子通过自发水分子通过自发水解解经常经常发生脱嘧啶和脱嘌呤反应，使嘌发生脱嘧啶和脱嘌呤反应，使嘌呤碱和嘧啶碱从呤碱和嘧啶碱从DNADNA分子的分子的脱氧核糖脱氧核糖- -磷磷酸骨架上脱落下来酸骨架上脱落下来。LindahlLindahl估计，一个估计，一个哺乳动物细胞在哺乳动物细胞在3737条件下，条件下，2020小时内小时内通过自发水解可从通过自发水解可从DNADNA链

47、上脱落约链上脱落约1000010000个嘌呤碱和个嘌呤碱和500500个嘧啶碱。个嘧啶碱。2 2）碱基的脱氨基作用）碱基的脱氨基作用 碱基中的胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）都含有环外氨基，氨基有时会自发脱落，从而使胞嘧啶变为尿嘧啶（U），腺嘌呤变为次黄嘌呤（I）, 鸟嘌呤变为黄嘌呤（X）。例如，胞嘧啶自发水解脱氨变成尿嘧啶后，如果未被修复，产生的尿嘧啶会在接下来的复制中与腺嘌呤配对，从而产生点突变。3 3）碱基的互变异构）碱基的互变异构 DNA中的四个碱基都可能自发地使氢原子改变位置而产生互变异构体，从而使碱基的配对形式发生改变。如腺嘌呤的稀有互变异构体与胞嘧啶配对，胸腺嘧啶的稀有互

48、变异构体与鸟嘌呤配对。当DNA复制时，如果模板链上存在着这样形式的互变异构体，在子链上就可以产生错误，造成DNA损伤。4 4）细胞正常代谢产物对）细胞正常代谢产物对DNADNA的损伤的损伤 在所有需氧细胞中，细胞呼吸作用产生的副产物超氧阴离子（O2-）和H2O2非常活跃，由于这些超氧化物、羟基自由基（OH）等活性氧的存在，导致DNA在正常条件下发生氧化损伤。 2 2物理因素物理因素：l 由紫外线、电离辐射、由紫外线、电离辐射、X X射线等引起的射线等引起的DNADNA损伤。损伤。其中，其中，X X射线和电离辐射常常引起射线和电离辐射常常引起DNADNA链的断裂，链的断裂，而而紫外线紫外线常常引

49、起常常引起嘧啶二聚体嘧啶二聚体的形成，如的形成，如TTTT，TCTC，CCCC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。碍。 3 3化学因素：化学因素： (1)(1)脱氨剂脱氨剂：如：如亚硝酸与亚硝酸盐亚硝酸与亚硝酸盐，可，可加速加速C C脱氨基脱氨基生成生成U U，A A脱氨基生成脱氨基生成I I。 (2)(2)烷基化剂烷基化剂：这是一类带有活性烷基：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的碱基或磷酸基的烷基化烷基化，

50、甚至可引起邻近，甚至可引起邻近碱基的交联。碱基的交联。 (3)DNA(3)DNA加合剂加合剂：如苯并芘，在体内代谢：如苯并芘，在体内代谢后生成后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。损伤。 (4)(4)碱基类似物碱基类似物：如：如5-FU5-FU，6-MP6-MP等，可等，可掺入到掺入到DNADNA分子中引起损伤或突变。分子中引起损伤或突变。 (5)(5)断链剂断链剂：如过氧化物，含巯基化合：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起物等，可引起DNADNA链的断裂。链的断裂。 生物体内存在多种修复途径：生物体内存在多种修复途径：l光复活修复系统光复活修复系统l切除修复

51、系统切除修复系统l重组修复系统重组修复系统l错配修复系统错配修复系统lSOSSOS修复系统修复系统等。等。 DNADNA分子的双螺旋结构是其损伤修复的分子的双螺旋结构是其损伤修复的重要基础，因为重要基础，因为DNADNA的的互补双链互补双链可保证其一股可保证其一股链上的损伤被切除后，能从另一股链上获得链上的损伤被切除后，能从另一股链上获得修复所需要的修复所需要的信息信息。 （一）光复活修复（直接修复）（一）光复活修复（直接修复）（light repairinglight repairing）：）： 这是一种广泛存在的修复作这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二用。光复活能够修复任

52、何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为：聚体的损伤。其修复过程为：光光复活酶复活酶（photo-lyase)photo-lyase)识别嘧啶识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物二聚体并与之结合形成复合物在在300300600nm600nm可见光照射下，酶可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复环打开，使之完全修复光复活光复活酶从酶从DNADNA上解离。上解离。 （二）切除修复（二）切除修复(excision repairing)(excision repairing)： 切除修复切除修复（excision repair）需要先识别损伤部位，然后切除损

53、伤的碱基或核苷酸，用正常的碱基或核苷酸填补缺口，用连接酶连接切口。1 1、碱基切除修复、碱基切除修复 碱基切除修复碱基切除修复（base excision repair, BER） 是在DNA聚合酶、DNA糖苷酶、内切酶和连接酶等参与下完成的。 DNA糖苷酶（DNA-glycosylase）可以特异性识别并将不正常的碱基水解切除，形成无碱基的AP位点（AP site），由AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开，然后外切酶切除包括AP位点在内的DNA链，聚合酶填补单链缺口，最后由连接酶将链连接。 BER特别适合于修复较轻的碱基损伤。碱基切除修复碱基切除修复2 2、核苷酸切除修复、核苷酸切除修

54、复 核苷酸切除修复核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER） 主要用来修复导致DNA结构发生扭曲并影响到DNA复制的损伤，如可造成DNA发生大约30o弯曲的嘧啶二聚体。 主要由5步反应组成： 由特殊的蛋白质探测损伤，并引发一系列蛋白质与损伤部位的有序结合。 由特殊的内切酶在损伤部位的两侧切开DNA链。 去除2个切口之间的带有损伤的DNA片段，形成缺口。 由DNA pol填补缺口。 由DNA连接酶连接切口。 （三）重组修复（三）重组修复(recombination (recombination repairing)repairing)： 其过程分为三个步骤：

55、 1、复制，损伤的DNA仍然可以复制，但复制到损伤部位时，子链就出现了缺口。 2、重组，从完整的母链将相应的片段移到缺口，而母链上形成缺口。 3、填补和连接，母链上的缺口由DNA聚合酶进行填补合成，最后由DNA连接酶连接。 重组修复重组修复是是DNADNA的复制过程中所采的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。用的一种有差错的修复方式。 修复过修复过程中，程中，DNADNA损伤并未除去，但随着复制损伤并未除去，但随着复制的不断进行，损伤部位被逐渐稀释，的不断进行，损伤部位被逐渐稀释，实际上消除了损伤的影响。实际上消除了损伤的影响。（四）、错配修复（四）、错配修复DNA复制是一个高保真过程，但

56、其正确性毕竟不是绝对的，复制产物中仍会存在少数未被校出的错配碱基。通过对错配碱基的修复将使复制的精确性提高102-103倍。现已在大肠杆菌、酵母和哺乳动物中都发现了错配修复系统。复制错配中的错配碱基存在于新合成的子代链中，错配修复是按模板的遗传信息来修复错配碱基的。因此，该修复系统必须有一种能在复制叉通过之后识别模板链与新合成 DNA链的机制，以保证只从新合成的DNA链中去除错配碱基。 在大肠杆菌中主要通过对模板链的甲基化来区分新合成的DNA链。大肠杆菌中存在一种Dam甲基化酶，它通常首先对DNA模板链的5- GATC序列中腺嘌呤的N6位置进行甲基化，当复制完成后，在短暂的时间内（几秒或几分钟

57、），只有模板链是甲基化的，而新合成的链是非甲基化的。正是子代DNA链中的这种暂时半甲基化，可以作为一种链的识别标志，以区别模板链和新合成的链，从而使存在于GATC序列附近的复制错配将按亲代链为模板进行修复。几分钟后新合成链也将在Dam甲基化酶作用下被甲基 化，从而成为全甲基化DNA。一旦两条链都被甲基化，这种错配修复过程几乎不再发生。由于甲基化DNA成为识别模板链和新合成链的基础，且错配修复发生在GATC的邻近处，故这种修复也称为甲基指导的错配修复（methyl-directed mismatch repair）。 （五）（五）SOSSOS修复修复：l 这是一种在这是一种在DNADNA分子受到

58、较大范围损伤分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以以SOSSOS借喻细胞处于危急状态。借喻细胞处于危急状态。l DNADNA分子受到长片段高密度损伤，使分子受到长片段高密度损伤，使DNADNA复制过程在损伤部位受到抑制。复制过程在损伤部位受到抑制。l 损伤诱导一种特异性较低的新的损伤诱导一种特异性较低的新的DNADNA聚聚合酶，以及重组酶等的产生。合酶，以及重组酶等的产生。l 由这些特异性较低的酶继续催化损伤部由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位位DNADNA的复制，复制完成后，保留许多错的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突

59、变。误的碱基，从而造成突变。 （一）、基因突变的类型（一）、基因突变的类型碱基序列发生改变的基因我们称之为突变基因（mutant gene）。携带突变基因的生物个体或群体或株系通常称为突变体（mutant）。基因没有发生变化而表现正常的生物个体则称为野生型（wild type）。突变及其在机体中的后效也可用 基 因 型 （ g e n e t y p e ） 和 表 现 型（phenotype）两个术语来表述，前者用于描述突变及其所处基因；后者用于描述突变在机体中的后果。此外，按照突变生成的过程可将突变分为自发突变（spontaneous mutation）和诱发突变（induced muta

60、tion，简称诱变）两种类型。由于自然界中突变剂的作用或由于偶然的复制错误而产生的突变都属于自发突变。由于人们使用突变剂处理生物体而产生突变则是诱变。从不同角度看，基因突变可以分为许多相互联系的类别。目前人们最了解和最常见的基因突变主要有以下两类：1 1、碱基置换突变、碱基置换突变指基因中一个或少数几个碱基被替代的突变。最简单的碱基置换突变是点突变，即DNA序列上单个碱基的改变。如前述镰刀型红细胞贫血病人的血红蛋白中，链第6为谷氨酸被缬氨酸取代，其编码链DNA序列中的谷氨酸密码子GAG被置换为缬氨酸密码子GTG，两者之间仅发生了一个碱基的改变。点突变如果是嘌呤与嘌呤之间，嘧啶与嘧啶之间发生互换