经典液相色谱法(2010)

1、1第第7 7章章 经典液相色谱法经典液相色谱法经典液相色谱包括经典液相色谱包括柱色谱柱色谱和和平面色谱平面色谱。 以液体为流动相的色谱称为液相色谱。按以液体为流动相的色谱称为液相色谱。按固定相的规格、流动相的驱动力、分离效能和周固定相的规格、流动相的驱动力、分离效能和周期不同，又分为期不同，又分为经典液相色谱经典液相色谱和和现代液相色谱法现代液相色谱法（高效液相色谱法（高效液相色谱法). 经典液相色谱法采用普通规格的固定相，常经典液相色谱法采用普通规格的固定相，常压输送流动相，以重力和毛细管作用力为驱动压输送流动相，以重力和毛细管作用力为驱动力分离效能不高，周期较长，一般不具有在线力分离效能不

2、高，周期较长，一般不具有在线检测器。经典液相色谱法仪器设备简单，费用低，检测器。经典液相色谱法仪器设备简单，费用低，可用于中草药有效成分的分离纯化、药品的纯度可用于中草药有效成分的分离纯化、药品的纯度控制和杂质检查等。控制和杂质检查等。2 第第1 1节节 液液- -固吸附柱色谱法（固吸附柱色谱法（LSCLSC） 经典的液经典的液固吸附色谱（固吸附色谱（liquid solid adsorption chromatography，LSC）是）是以吸附剂为固定相，有机溶剂为流动相，利用不以吸附剂为固定相，有机溶剂为流动相，利用不同组分在吸附剂上吸附性能的差异，进行分离分同组分在吸附剂上吸附性能的差

3、异，进行分离分析的方法。析的方法。 用于分离分析极性至弱极性的化合物，不适用用于分离分析极性至弱极性的化合物，不适用于分离分析强极性的物质。于分离分析强极性的物质。一、基本原理一、基本原理 1 1吸附与吸附平衡吸附与吸附平衡 3 吸附过程是试样中组分分子与流动相分子吸附过程是试样中组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程。争夺吸附剂表面活性中心的过程。图图10-1 10-1 吸附色谱示意图吸附色谱示意图m.m.流动相流动相 a.a.吸附剂吸附剂 XmXm. .流动相中溶质分子流动相中溶质分子 YmYm. .流动相分子流动相分子 XaXa. .被吸附的溶质分子被吸附的溶质分子 4这种吸附

4、平衡过程可表示为这种吸附平衡过程可表示为Xm nYa Xa nYm +吸附 解吸附 namnmaYXYXK 吸附平衡常数吸附平衡常数: 因为流动相的量很大，因为流动相的量很大， 近似于常数，而近似于常数，而且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常数可写成数可写成 nanmYY5msmaCCmVmXaSaXXXK/的浓度为溶质分子在流动相中面的浓度为溶质分子在吸附剂表maXX为流动相的体积为吸附剂表面面积maVSCS为溶质在固定相表面的分析浓度，为溶质在固定相表面的分析浓度， Cm为溶质在流动相中的分析浓度为溶质在流动相中的分析浓度 K K与组分的性质

5、、吸附剂的活性、流动相的与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的 性质及温度有关。性质及温度有关。6 K值小，说明该物质的吸附能力弱，在固定相值小，说明该物质的吸附能力弱，在固定相中滞留时间短，移动速率快，先流出色谱柱；若中滞留时间短，移动速率快，先流出色谱柱；若K值大，说明该物质值大，说明该物质的吸附能力强的吸附能力强，在固定相中，在固定相中滞留时间长，移动速率慢，后流出色谱柱。滞留时间长，移动速率慢，后流出色谱柱。在一在一定条件下，不同组分因吸附系数的差异得以分离。定条件下，不同组分因吸附系数的差异得以分离。 2 2吸附等温线吸附等温线 在一定温度下，某一组分在固定相和流动相在一定温度下，某一

6、组分在固定相和流动相 之间达到平衡时，以组分在固定相中的浓度之间达到平衡时，以组分在固定相中的浓度C Cs s为纵坐标，以组分在流动相中的浓度为纵坐标，以组分在流动相中的浓度C Cm m为横坐为横坐标得到的曲线。标得到的曲线。 7等温线有三种类型：线性、凸形和凹形。通常在等温线有三种类型：线性、凸形和凹形。通常在低浓度时，每种等温线均呈线性，而高浓度时，低浓度时，每种等温线均呈线性，而高浓度时，等温线则呈凸形（常见）或凹形。等温线则呈凸形（常见）或凹形。吸附等温吸附等温柱内溶质柱内溶质浓度分布浓度分布柱内溶质柱内溶质浓度的分浓度的分布曲线布曲线流出曲线流出曲线 保留时间保留时间与进样量与进样量

7、的关系的关系 8二、二、 吸附剂吸附剂 1. 1. 对吸附剂的要求：对吸附剂的要求： (1)表面积大，具有一定的吸附能力。表面积大，具有一定的吸附能力。 (2)不应与流动相发生化学反应。不应与流动相发生化学反应。 (3)粒度要细，一般为粒度要细，一般为150目左右。目左右。2. 2. 常用吸附剂常用吸附剂有机类有机类 活性炭、淀粉、葡萄糖、聚酰胺、大孔活性炭、淀粉、葡萄糖、聚酰胺、大孔 树脂等树脂等无机类无机类 氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、 硅藻土等硅藻土等（1 1）硅胶（）硅胶（SiOSiO2 2xHxH2 2O O）9结构结构：内部内部硅氧交联结构硅氧交联结

8、构多孔结构多孔结构 表面表面有硅醇基有硅醇基氢键作用氢键作用吸附活性中心吸附活性中心SiOH S iOHOS i S iOS i游离羟基游离羟基(I) 键合羟基键合羟基() 硅醚结构硅醚结构() 硅醚结构硅醚结构()没有吸附活性。没有吸附活性。 10由于硅胶具有弱酸性，能与碱起反应，只适用由于硅胶具有弱酸性，能与碱起反应，只适用于分离酸性和中性化合物。于分离酸性和中性化合物。 碱性氧化铝碱性氧化铝 pH 9pH 910 10 适于分析碱性、中性物质适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝中性氧化铝 pH7.5 pH7.5 适于分析酸性碱性和中性物质适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝酸性氧化铝 p

9、H 4pH 45 5 适于分析酸性、中性物质适于分析酸性、中性物质（2 2）氧化铝）氧化铝(3) (3) 聚酰胺聚酰胺 由酰胺聚合而成的高分子物质由酰胺聚合而成的高分子物质。CH2CH2CH2CH2CH2CNHOn11 酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸附作用。附作用。 （4 4）大孔吸附树脂）大孔吸附树脂 一种不含交换基团，具有大孔一种不含交换基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。理化网状结构的高

10、分子吸附剂。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。大孔树脂可分为非极性和溶剂。大孔树脂可分为非极性和中等极性两类，在水溶液中吸附中等极性两类，在水溶液中吸附力较强且有良好的吸附选择性，力较强且有良好的吸附选择性，而在有机溶剂中吸附能力较弱。而在有机溶剂中吸附能力较弱。12硅胶含水量硅胶含水量（%）氧化铝含水氧化铝含水量（量（%）活度级别活度级别051525380361015表表10-1 硅胶、氧化铝的含水量与活度级别的关系硅胶、氧化铝的含水量与活度级别的关系2. 2. 吸附剂的吸附活性：吸附剂的吸附活性： 氧化铝、硅胶的吸附力的大小氧化铝、硅胶的吸附力的大小, 还与

11、其含水量有还与其含水量有较大的关系：较大的关系：13 活度级数活度级数 含水量含水量 活性活性 吸附能力吸附能力 小小 少少 大大 强强 大大 多多 小小 弱弱 加热除水，活性提高，吸附力加强（活化）加热除水，活性提高，吸附力加强（活化） 吸水，活性下降，吸附力减弱。吸水，活性下降，吸附力减弱。 三、色谱条件的选择三、色谱条件的选择 选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物质、流动相质、流动相(洗脱剂洗脱剂)三方面进行综合考虑。三方面进行综合考虑。 141. 1. 被分离物质的极性被分离物质的极性被分离物质的极性越大被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附

12、得越牢被吸附剂吸附得越牢!常见的化合物极性大小顺序常见的化合物极性大小顺序: 烷烃烷烃 烯烃烯烃 醚类醚类 硝基化合物硝基化合物 二甲胺二甲胺 脂脂类类 酮类酮类 醛类醛类 硫醇硫醇 胺类胺类 酰胺酰胺 醇类醇类 酚类酚类 羧酸类羧酸类 被分离物质的极性与结构的关系被分离物质的极性与结构的关系 (1) 基本母核相同基本母核相同 , 基团极性愈大基团极性愈大 , 分子极性愈大。分子极性愈大。 基本母核相同基本母核相同 , 极性基团数目愈多极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。分子极性愈大。(2) 分子双键多分子双键多, 吸附力吸附力 。(3) 空间排列空间排列 , 影响极性。影响极性。例如羟基处于

13、能形成分子内氢键的位置时例如羟基处于能形成分子内氢键的位置时15COOHOHCHOOHO2. 吸附剂的活性吸附剂的活性: 吸附剂的活性吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力大，对被测组分的吸附能力强强 物质的极性物质的极性 吸附剂活性吸附剂活性 大大 小小 防吸附太牢防吸附太牢,难洗脱难洗脱 小小 大大 防防tR太小太小,不易分离不易分离3. 3. 流动相的极性流动相的极性 流动相极性大，对被测组分的洗脱能力强流动相极性大，对被测组分的洗脱能力强16常用流动相极性强弱顺序常用流动相极性强弱顺序: 石油醚石油醚 环己烷环己烷 四氯化碳四氯化碳 苯苯 甲苯甲苯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 醋酸乙酯醋酸乙酯

14、正丁醇正丁醇 丙醇丙醇 乙醇、甲醇乙醇、甲醇 1 , 说明B+ 较牢地结合在树脂上 KB/A 1 , 说明A+ 较牢地结合在树脂上 所以KB/A说明了树脂对A+、 B+两种离子选择性交换的能力,故也称之为选择性系数选择性系数。 KB/A=B+ A+r A+ B+ rR A+ B+ R B+ A+22 用离子交换树脂分离不同离子时，样品组分离用离子交换树脂分离不同离子时，样品组分离子与流动相离子在树脂上产生竞争交换，交换能力子与流动相离子在树脂上产生竞争交换，交换能力弱的离子易被流动相洗脱。选择性系数大的离子交弱的离子易被流动相洗脱。选择性系数大的离子交换能力强，保留时间长，后流出色谱柱。结果各

15、种换能力强，保留时间长，后流出色谱柱。结果各种离子按选择性系数的大小顺序被洗脱。离子按选择性系数的大小顺序被洗脱。二、离子交换树脂结构与分类二、离子交换树脂结构与分类离子交换树脂是具有网状立体结构的高分子多离子交换树脂是具有网状立体结构的高分子多元酸或多元碱的聚合物。常用的是聚苯乙烯型元酸或多元碱的聚合物。常用的是聚苯乙烯型离子交换树脂。它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合离子交换树脂。它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合而成球形网状结构，而成球形网状结构，聚苯乙烯型磺酸基阳离子交换树脂的制备：聚苯乙烯型磺酸基阳离子交换树脂的制备：23CH CH2CH CH2CH CH2单体+聚合磺酸化磺酸化交联剂交联剂如果用其

16、它基团代替磺酸基，如果用其它基团代替磺酸基，就可以得到一系列阳离子交就可以得到一系列阳离子交换树脂。例如换树脂。例如COOH、OH等。这些基团上的氢离等。这些基团上的氢离子可被样品溶液中的阳离子子可被样品溶液中的阳离子交换。交换。24阴离子交换树脂具有与阳离子交换树脂同样的有阴离子交换树脂具有与阳离子交换树脂同样的有机骨架，只是在骨架上引入了可离解的碱性基团，机骨架，只是在骨架上引入了可离解的碱性基团，如如季胺基季胺基(NR 3OH )等等，就成为阴离子交，就成为阴离子交换树脂。其交换反应如下：换树脂。其交换反应如下：OHXRNRXOHRNR33三、离子交换树脂的性能三、离子交换树脂的性能 1

17、. 交联度交联度: 交换树脂中交换树脂中 , 交联剂交联剂(二乙烯苯二乙烯苯)的含的含量为交联度量为交联度 , 以重量百分比表示。以重量百分比表示。25 交联度交联度 网眼网眼 交换速度交换速度 离子离子 选择性选择性 大大 小小 慢慢 小离子小离子 好好 小小 大大 快快 大小离子大小离子 差差 阳离子交换树脂一般交联度阳离子交换树脂一般交联度8 % 阴离子交换树脂一般交联度阴离子交换树脂一般交联度4 % 2. 2. 交换容量交换容量: : 交换容量是指每克干树脂能参加交换反应的交换容量是指每克干树脂能参加交换反应的活性基团数。一般为活性基团数。一般为110mmol/g。它反映了离子交换树脂

18、进行离子交换反应的能力，决它反映了离子交换树脂进行离子交换反应的能力，决定于网状结构内所含有的酸性或碱性基团的数目。树定于网状结构内所含有的酸性或碱性基团的数目。树脂的结构与组成、溶液的脂的结构与组成、溶液的pH等因素都影响交换容量。等因素都影响交换容量。26第第4节节 空间排阻柱色谱法（空间排阻柱色谱法（SEC）利用被测组分分子大小不同，在固定相上选择利用被测组分分子大小不同，在固定相上选择性渗透，实现分离。性渗透，实现分离。主要用于大分子物质如蛋主要用于大分子物质如蛋白质、多糖等的分离。白质、多糖等的分离。 固定相固定相多孔性凝胶多孔性凝胶 流动相流动相水水凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱 流动相

19、流动相有机溶剂有机溶剂凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱 一、基本原理一、基本原理1 1分子筛效应分子筛效应 27体积大的组分完全不能进入凝胶体积大的组分完全不能进入凝胶颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶颗粒之间的间隙随流动相最先流颗粒之间的间隙随流动相最先流出色谱柱；而体积小的组分，可出色谱柱；而体积小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此在流经凝胶颗粒之间的间隙和全在流经凝胶颗粒之间的间隙和全部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流出；介于大小分子中间的组分，出；介于大小分子中间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔只能进入一部分颗粒内

20、较大的孔隙，在中间时间段流出。隙，在中间时间段流出。 根据溶质分子大小的不同进行分离的现象称根据溶质分子大小的不同进行分离的现象称为分子筛效应为分子筛效应2 2渗透系数渗透系数K KP P 28XXKmSPXm与与Xs分别代表在孔外流动相中和凝胶孔隙中分别代表在孔外流动相中和凝胶孔隙中同等大小的溶质分子。平衡时，两者浓度之比同等大小的溶质分子。平衡时，两者浓度之比为渗透系数为渗透系数根据空间排阻理论，凝胶孔内外同等大小的根据空间排阻理论，凝胶孔内外同等大小的分子处于扩散平衡状态分子处于扩散平衡状态 XmXs29在凝胶孔径一定时，当分子大到不能进入凝胶所在凝胶孔径一定时，当分子大到不能进入凝胶所

21、有空隙时（排斥极限），有空隙时（排斥极限）， XS=0，则，则KP=0；而当分子小到能进入所有空隙时（全渗透），而当分子小到能进入所有空隙时（全渗透）， XS=Xm，KP=1；分子尺寸在上述两种分子之间时，能进入部分空分子尺寸在上述两种分子之间时，能进入部分空隙，隙， 0KP1.在高分子溶液中，相同成分的分子尺寸大小与在高分子溶液中，相同成分的分子尺寸大小与分子量成比例，因此，在一定范围内，分子量成比例，因此，在一定范围内，KP与分与分子量相关，分子量小，子量相关，分子量小，KP大。大。30排斥极限与全渗透之间对应的分子量范围称为排斥极限与全渗透之间对应的分子量范围称为凝胶的分子量范围。选择凝

22、胶时应使试样的分凝胶的分子量范围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。子量落入此范围。当组分的分子量在凝胶的分子量范围之内时，其当组分的分子量在凝胶的分子量范围之内时，其保留体积与渗透系数有如下关系保留体积与渗透系数有如下关系:SP0mSP0RVKV)VVK1 (VV)VV(m0死体积VS为凝胶孔隙的总体积（固定相体积），为凝胶孔隙的总体积（固定相体积），Vm为凝胶的粒间体积（流动相体积）为凝胶的粒间体积（流动相体积）31固定相固定相常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和和.聚苯乙烯凝胶等。聚苯乙烯凝胶等。 要选择对样品的溶解好，又能润湿凝胶，粘度要选

23、择对样品的溶解好，又能润湿凝胶，粘度要低的溶剂，否则，会限制分子扩散而影响分离要低的溶剂，否则，会限制分子扩散而影响分离效果。一般水溶性试样选水溶液，非水溶性试样效果。一般水溶性试样选水溶液，非水溶性试样选四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机选四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂。溶剂。流动相流动相第第5 5节节 薄层色谱法（薄层色谱法（TLCTLC）32 将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离分析的方法称为薄层色谱法（离分析的方法称为薄层色谱法（TL

24、C）。）。铺有固定相的板子称为薄层板简称薄板。在薄层铺有固定相的板子称为薄层板简称薄板。在薄层色谱法中使用的流动相又称为展开剂。色谱法中使用的流动相又称为展开剂。 按分离机制薄层色谱法可分为吸附、离子交按分离机制薄层色谱法可分为吸附、离子交换、分配和分子排阻色谱法等。按薄层板的分离换、分配和分子排阻色谱法等。按薄层板的分离效率不同，又可分为经典薄层色谱法效率不同，又可分为经典薄层色谱法(TLC)及高及高效薄层色谱法效薄层色谱法(HPTLC)。本节主要讨论应用最。本节主要讨论应用最为广泛的吸附薄层色谱法。为广泛的吸附薄层色谱法。操作过程：操作过程：33特点：特点：设备简单，操作方便，分析速度快，

25、分离效率设备简单，操作方便，分析速度快，分离效率高，灵敏度高，显色方便，结果直观，高，灵敏度高，显色方便，结果直观，预处理简单预处理简单。应用：应用：定性、药物杂质检查、纯度测定定性、药物杂质检查、纯度测定一、基本原理一、基本原理 1.分离过程分离过程 将混合组分的试液将混合组分的试液, 点在铺了吸附剂的玻璃板一点在铺了吸附剂的玻璃板一端端, 在密闭容器中用适当的溶剂在密闭容器中用适当的溶剂 (展开剂、流动相展开剂、流动相) 展开展开, 各组分不断地被吸附各组分不断地被吸附, 解吸附解吸附 随展开剂前随展开剂前移移, 利用吸附剂对不同组分的吸附能力利用吸附剂对不同组分的吸附能力 (吸附平衡吸附

26、平衡常数常数)不同不同, 产生差速迁移产生差速迁移, 而达到分离。而达到分离。342. 比移值比移值 原点到斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离=Rf RfA= a / c RfB = b / c一般要求组分的一般要求组分的fR 值在值在0.20.20.80.8之间。之间。Rf = 0 ，被固定完全吸附，被固定完全吸附, K Rf = 1 ，组分不被固定相吸附，组分不被固定相吸附, K 0 ) 0 Rf 135 比移值是薄层色谱的基本定性参数，它说明比移值是薄层色谱的基本定性参数，它说明组分在色谱系统中的保留行为。比移值的数值除组分在色谱系统中的保留行为。比移值的数值除与组分的性质有关外，还与薄

27、层板的性质与组分的性质有关外，还与薄层板的性质(活性活性等等)、展开剂的性质、展开剂的性质(极性、组成等极性、组成等)和温度有关。和温度有关。值的因素很多，值的因素很多，重复性较差重复性较差 3相对比移值相对比移值 的距离原点到对照品斑点中心心的距离原点到样品组分斑点中stRk11Rf在一定条件下，吸附平衡常数越大，在一定条件下，吸附平衡常数越大，容量因子容量因子k就越大，则比移值越小。就越大，则比移值越小。36讨论讨论 对照品与被测组分在完全对照品与被测组分在完全相同条件下展开，可以消相同条件下展开，可以消除系统误差，大大提高重除系统误差，大大提高重现性和可靠性；现性和可靠性； 对照品可以是

28、后加入纯物对照品可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组质，也可是样品中已知组分。分。 相对比移值相对比移值Rst与组分、对与组分、对照品性质等因素有关，可照品性质等因素有关，可以大于或小于以大于或小于1。AB对对cabcaR)A(stcbR)B(st37二、固定相二、固定相吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用,如如硅胶、硅胶、Al 2O 3等，但等，但粒度比柱色谱更细。粒度比柱色谱更细。硅胶微带酸性，适用于酸性及中性物质的分离。硅胶微带酸性，适用于酸性及中性物质的分离。 薄层色谱用硅胶粒度为薄层色谱用硅胶粒度为40m，硅胶硅胶G 硅胶硅胶 + 煅石膏（煅石膏

29、（CaSO4） 硅胶硅胶H 硅胶硅胶(未加任何物质未加任何物质)硅胶硅胶HF254 硅胶硅胶+荧光物质荧光物质硅胶硅胶GF254 硅胶硅胶+煅石膏煅石膏+荧光物质荧光物质氧化铝一般适用于碱性物质和中性物质的分离氧化铝一般适用于碱性物质和中性物质的分离 38三、展开剂三、展开剂在吸附薄层色谱法中，展开剂选择的一般原则与在吸附薄层色谱法中，展开剂选择的一般原则与吸附柱色谱法中选择流动相的原则相同，主要根吸附柱色谱法中选择流动相的原则相同，主要根据被分离物质的极性、吸附剂的活性以及展开剂据被分离物质的极性、吸附剂的活性以及展开剂本身的极性来选则。本身的极性来选则。39 实验中，一般先选择单一溶剂展开

30、，对难分实验中，一般先选择单一溶剂展开，对难分离组分，则需使用二元、三元甚至多元的溶剂系离组分，则需使用二元、三元甚至多元的溶剂系统。统。 在多元展开剂中占比例较大的主要溶剂起在多元展开剂中占比例较大的主要溶剂起溶解样品和基本分离的作用，占比例较小的溶溶解样品和基本分离的作用，占比例较小的溶剂起调整剂起调整Rf 值、改善分离度和对某些组分的选值、改善分离度和对某些组分的选择性作用。择性作用。 如某一物质在用苯作展开剂时，移动距离太小，说明如某一物质在用苯作展开剂时，移动距离太小，说明展开剂的极性太小，此时可以加入一定量的乙醇等极性大展开剂的极性太小，此时可以加入一定量的乙醇等极性大的溶剂。再视

31、分离的效果适当改变溶剂的配比，如苯的溶剂。再视分离的效果适当改变溶剂的配比，如苯:乙乙醇为醇为91、82或或73等。必要时甚至还要加一些酸等。必要时甚至还要加一些酸或碱。一般希望或碱。一般希望Rf值在值在0.20.8之间较为满意。之间较为满意。 40四、操作方法四、操作方法1. 1. 薄层板制备薄层板制备 薄层板分为硬板与软板。软板的制备是直接薄层板分为硬板与软板。软板的制备是直接将吸附剂置于玻璃板上并使成为一均匀薄层便制将吸附剂置于玻璃板上并使成为一均匀薄层便制成了一块软板。硬板的制备需要以下几个步骤：成了一块软板。硬板的制备需要以下几个步骤： 载板的准备。载板的准备。 匀浆的制备：制备匀浆

32、时匀浆的制备：制备匀浆时有时需要加一些粘合剂，常有时需要加一些粘合剂，常用粘合剂有煅石膏、羧甲基用粘合剂有煅石膏、羧甲基纤维素钠（纤维素钠（CMC-Na）等。）等。41煅石膏：吸附剂的煅石膏：吸附剂的9-15%9-15%左右左右羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠CMC-NaCMC-Na：0.5-1%0.5-1%水溶液水溶液 例如，取一定量的硅胶例如，取一定量的硅胶H放入研钵中，加入放入研钵中，加入3倍量的含有倍量的含有0.3%0.7%羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的水溶液，朝同一方向研磨成）的水溶液，朝同一方向研磨成均匀稀糊状均匀稀糊状. 铺板铺板 手工涂铺法手工涂铺法 机械涂铺法机械

33、涂铺法 42活化：将铺好的薄层板先凉干，再在活化：将铺好的薄层板先凉干，再在105110进行加热活化，活化的程度等进行加热活化，活化的程度等要根据样品的性质决定。要根据样品的性质决定。2.2.点样点样 （1）样品溶液的制备）样品溶液的制备 应尽量避免用水作溶剂，因为水溶液斑点容易应尽量避免用水作溶剂，因为水溶液斑点容易扩散，且不易挥发。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯扩散，且不易挥发。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂，最好用与展开剂极性相似的仿等挥发性有机溶剂，最好用与展开剂极性相似的溶剂。水溶性样品可先用少量水溶解，再用甲醇或溶剂。水溶性样品可先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。乙

34、醇稀释定容。43（2）点样量）点样量点样量的多少视薄层的性能及显色剂的灵敏度等点样量的多少视薄层的性能及显色剂的灵敏度等而定，在检测器灵敏度足够时，应降低点样量。点样而定，在检测器灵敏度足够时，应降低点样量。点样量太多，展开后会出现斑点过大或拖尾等现象，而影量太多，展开后会出现斑点过大或拖尾等现象，而影响分离效果。响分离效果。点样体积一般在点样体积一般在几到几十微克（几到几十微克（ 1 10 l）, 点点样量太大样量太大, 斑易拖尾斑易拖尾, 影响分离效果。影响分离效果。(3)点样方法点样方法点样方式：接触式点样与喷雾式点样点样方式：接触式点样与喷雾式点样点样形状；点状、条状点样点样形状；点状

35、、条状点样点样器具微量进样器、定量毛细管；点样器具微量进样器、定量毛细管；底距：底距： 1.52cm点距：点距：0.5 1cm原点直径原点直径 ： 23 mm。（边点边热风吹）。（边点边热风吹）4445起始线起始线463.展开展开 将点好样的薄层板浸入展开剂中，展开剂借薄层将点好样的薄层板浸入展开剂中，展开剂借薄层板上固定相的毛细作用携带样品组分在薄层板上板上固定相的毛细作用携带样品组分在薄层板上迁移一定距离的过程称为展开。迁移一定距离的过程称为展开。（1）展开装置）展开装置 常用的展开装置有直立型的单槽色谱缸和双槽色谱缸、圆常用的展开装置有直立型的单槽色谱缸和双槽色谱缸、圆形色谱缸、卧式色谱

36、缸等。形色谱缸、卧式色谱缸等。 47(2)展开方式展开方式 一般展开方式一般展开方式 ：上行、下行、双向等：上行、下行、双向等展开距离：展开距离：615cm注意点：注意点： 展开剂浸薄层板下端展开剂浸薄层板下端0.5cm, 不能浸住起始线不能浸住起始线, 层析缸应密闭。层析缸应密闭。 先饱和先饱和1530分钟分钟,再展开再展开,防止边缘效应。防止边缘效应。 48 边缘效应是指同一物质边缘效应是指同一物质的色谱斑点，在薄层板上的色谱斑点，在薄层板上两边缘部分的两边缘部分的Rf值大于中值大于中间部分的间部分的Rf值的现象。值的现象。 这是由于色谱缸内溶剂这是由于色谱缸内溶剂蒸气未达饱和，造成展开蒸

37、气未达饱和，造成展开剂的蒸发速率在薄层板两剂的蒸发速率在薄层板两边与中间部分不等。展开边与中间部分不等。展开剂中极性较弱和沸点较低剂中极性较弱和沸点较低的溶剂在边缘挥发的快些，的溶剂在边缘挥发的快些，致使边缘部分的展开剂中致使边缘部分的展开剂中极性溶剂比例增大，故极性溶剂比例增大，故Rf值相对变大。值相对变大。 49原点12双向展开双向展开4.斑点定位斑点定位 有色化合物有色化合物直接定位直接定位50显色剂有通用型和专用型两种。通用型显色剂有碘、硫酸显色剂有通用型和专用型两种。通用型显色剂有碘、硫酸溶液、等。碘使许多化合物显色，如生物碱、氨基酸衍生溶液、等。碘使许多化合物显色，如生物碱、氨基酸

38、衍生物、肽类、脂类及皂甙等。它的最大特点是与物质的反应物、肽类、脂类及皂甙等。它的最大特点是与物质的反应是可逆的，当碘升华挥去后，斑点便于进一步处理。硫酸是可逆的，当碘升华挥去后，斑点便于进一步处理。硫酸能对大部分有机化合物显色，但它是破坏性显色剂。能对大部分有机化合物显色，但它是破坏性显色剂。物理捡出法物理捡出法化学捡出法化学捡出法51 专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试剂，例如茚三酮是氨基酸的专用显色剂，。羧酸可剂，例如茚三酮是氨基酸的专用显色剂，。羧酸可用酸碱指示剂作显色剂，含酚羟基物质可喷三氯化用酸碱指示剂作显色剂，含酚羟基物质可喷三氯

39、化铁铁铁氰化钾试剂进行显色。铁氰化钾试剂进行显色。 显色剂直接由喷雾器喷洒在硬板上，立即显色显色剂直接由喷雾器喷洒在硬板上，立即显色或加热至一定温度显色。或加热至一定温度显色。五、定性分析五、定性分析1. 1. 利用利用R Rf f 值定性或相对比移值值定性或相对比移值R Rstst（在同一块板上）（在同一块板上）2. 2. R Rf f 值值+ +斑点颜色特征（原位化学反应）斑点颜色特征（原位化学反应）; ;3. 3. 多种展开剂体系展开进行验证多种展开剂体系展开进行验证; ;4. 4. 与其他技术联用。与其他技术联用。52六、定量分析六、定量分析（一）洗脱法（一）洗脱法 薄层分离薄层分离

40、取下斑点取下斑点 洗脱洗脱 离心离心 取上清液进行测定取上清液进行测定 （二）薄层扫描法（二）薄层扫描法 又称原位定量薄层扫描法又称原位定量薄层扫描法 1.基本原理基本原理53 用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对薄层板进行扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的薄层板进行扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度，所得吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度，所得关系曲线下的面积与色谱斑点中待测物质的浓度或关系曲线下的面积与色谱斑点中待测物质的浓度或量成正比量成正比 。薄层扫描法的分类薄层扫描法的分类扫描方式扫描方式吸收法吸收

41、法荧光法荧光法反射法反射法透射法透射法 大多用于凝胶色谱大多用于凝胶色谱非透明界质薄层板非透明界质薄层板54方程是薄层扫描法定量的依据。方程是薄层扫描法定量的依据。Kubelka-Munk古柏尔卡古柏尔卡-曼克曼克55 通常在薄层扫描中都是以空白板为基准，测通常在薄层扫描中都是以空白板为基准，测定定相对透光率相对透光率及及相对反射率相对反射率来计算薄层色谱斑来计算薄层色谱斑点的吸光度。点的吸光度。透射法透射法 00lglgiiTTA空白薄层和样品斑空白薄层和样品斑点的透射率分别为点的透射率分别为000IiT 0IiT 56 反射法示意图反射法示意图 I0为照射光强度；为照射光强度；j0为空白板

42、反射光强度；为空白板反射光强度； j为斑点处反射光强度为斑点处反射光强度空白薄层和样品斑点的反射率分别为空白薄层和样品斑点的反射率分别为0000IjR,IjR斑点的吸光度斑点的吸光度00lglgjjRRA57SX=20SX=10SX=0根据根据Kubelka-Munk方程，色谱斑点中待测物质的方程，色谱斑点中待测物质的吸光度吸光度A与被测物质存在严格的定量关系，但不是一与被测物质存在严格的定量关系，但不是一种直线关系。因此，薄层扫描定量不遵从于种直线关系。因此，薄层扫描定量不遵从于Lambert-Beer定律。定律。 58SX=0SX=10SX=20为方便定量，必须对其曲线进行校直。为方便定量

43、，必须对其曲线进行校直。 59Kubelka-Munk曲线的校直：曲线的校直： 日本岛津日本岛津CS系列的薄系列的薄层色谱扫描仪均有线性补偿器，其工作原理即根据层色谱扫描仪均有线性补偿器，其工作原理即根据Kubelka-Munk方程式用电路系统将弯曲的曲线校正方程式用电路系统将弯曲的曲线校正为直线后用于定量，为直线后用于定量， 瑞士瑞士CAMAG公司公司SCANNER系列的薄系列的薄层色谱扫描仪，则采层色谱扫描仪，则采用计算机进行线性回用计算机进行线性回归或非线性回归，求归或非线性回归，求出回归方程，然后进出回归方程，然后进行定量分析。行定量分析。60 扫描模式扫描模式 直线扫描直线扫描应用一长应用一长方形光束（其长度大于方形光束（其长度大于斑点直径）以直线轨迹斑点直径）以直线轨迹通过色谱斑点。通过色谱斑点。 适用于圆形规则的斑点，适用于圆形规则的斑点，且扫描结果受扫描方向且扫描结果受扫描方向的影响。的影响。 锯齿扫描锯齿扫描照射在薄照射在薄层板上的光束与薄层板层板上的光束与薄层板的相对运动的轨迹呈锯的相对运动的轨迹呈锯齿形或矩形。齿形或矩形。 适用于任何形状的斑点，适用于任何形状的