大肠杆菌检查法标准操作程序

1、1 目的：规范大肠杆菌检查操作，保证检验结果准确。2 范围：本程序适用于药品大肠杆菌的检查。3 责任者：QC员、QC复核人员、QC主任。4 程序：4.1试药与试液 除特别注明外，试验中所用的试剂均为分析纯试剂，水为纯化水。4.1.1 0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠NaCl9.0g，加水使溶解成1000ml，121灭菌20分钟。4.1.2 无菌磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)取磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O25.8g和磷酸二氢钠NaH2PO4·H2O4.4g，加水使溶解至1000ml，121灭菌20分钟。4.1.3 萘酚乙醇试液取萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。

2、4.1.4 40氢氧化钾试液取氢氧化钾40g，加水溶解使成100ml。4.1.5 靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛C9H11NO1g，加入95%乙醇C2H5OH95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸HCl20ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。4.1.6 甲基红试液取甲基红C15H15N3O20.1g，加95%乙醇C2H5OH300ml与水适量，使溶解，再加水至500ml，即得。4.1.7 V-P试液取-萘酚C10H7OH6.0g，加无水乙醇C2H5OH使溶解成100ml。另取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml。分别将试药与各溶剂混合即得。4.1.8

3、革兰染色液4.1.8.1 沙黄染液取沙黄0.25g，加95%的乙醇C2H5OH10ml，使完全溶解后，加水至100ml。4.1.8.2 结晶紫染液取结晶紫C25H30ClN31.0g，加95%的乙醇C2H5OH20ml，使溶解，加1%的草酸铵溶液80ml，混匀。静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存。4.1.8.3 碘试液取碘化钾KI2.0g，加水35ml使溶解，加入碘片I21.0g，使全部溶解后，加水稀释至300ml，置密闭棕色瓶中储存。4.1.8.4 95乙醇。4.1.9 溴麝香草酚蓝指示液4.2 培养基的种类4.2.1 营养肉汤培养基4.2.2 营养琼脂培养基4.2.3 胆盐乳糖培养基（B

4、L）4.2.4 4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)4.2.5 乳糖培养基4.2.6 5%乳糖培养基4.2.7 蛋白胨水培养基4.2.8 磷酸盐葡萄糖胨水培养基4.2.9 枸橼酸盐培养基4.2.10 曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）4.3对照用菌液 取大肠杆菌CMCC (B) 44102的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36±1培养1824小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌液加入量含菌50100个（一般用量为0.1m1），其菌数在做阳性对照的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。4.4仪器与设备4.4.1 菌检室。4.4.2 净

5、化工作台，恒温培养箱（36±1），微波炉，恒温水浴（45±1），高压蒸汽灭菌器，电冰箱，匀浆仪，离心机（5004000转/分钟），显微镜（1500倍），紫外灯（366nm）。4.4.3 薄膜过滤装置：微孔滤膜直径约50mm，孔径0.45±0.02mm。8.4 锥形瓶（250300ml，内装玻璃珠若干），研钵（陶瓷制，直径l012cm）、培养皿（9cm），量筒（100ml），试管（18´180mm）及塞，吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1），注射器（20ml或30ml），注射针头，载玻片，盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。4.4.4 玻璃器皿用前应洗涤

6、干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160干热灭菌2小时或高压蒸汽121灭菌30分钟，烘干备用。4.4.5 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用7075%乙醇溶液浸泡）。4.4.6 无菌衣、帽、口罩、手套。洗净后配套，用牛皮纸包严，灭菌，备用。4.4.7 接种环（白铱金或镍铬合金，环径45mm、长度610cm），乙醇灯，乙醇棉球或碘伏棉球，灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子，灭菌钢锥，灭

7、菌称样纸，不锈钢药匙，试管架，火柴，记号笔，白瓷盘，洗手盆，陶瓦盖（12cm）等。 所有进入无菌室的物品必须经过消毒或灭菌，应严格按照菌检室物品进出标准操作程序（SOP QC-003-00）进行操作。4.5 准备4.5.1 供试品的检验量4.5.1.1 所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位。4.5.1.2 固体制剂检验量为l0g。4.5.1.3 液体制剂检验量为l0ml。4.5.1.4 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。4.5.2 供试液的制备4.5.2.1 液体供

8、试品。取供试品l0ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，摇匀，作为1:10供试液。4.5.2.2 固体供试品。称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入0.9%无菌氯化钠溶液100ml，用匀浆仪，振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。4.5.2.3 含抑菌成分供试品。供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌。不能检出时，该供试液须按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。4.5.2.3.1 稀释法。取规定量的供试液种入较大体积的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。4.5.2.3.2 离心沉淀集菌法。取规定量的供试液于无菌刻度离心管中，3000转/分钟

9、离心30分钟，移去上清液，留底部集菌液约2ml，并稀释该供试液至原规定量。如有不溶性药渣，可先以500转/分钟离心5分钟，取全部上层液，再按上述方法集菌处理。4.5.2.3.3 薄膜过滤法。取规定量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02m微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100ml，将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中。4.5.2.3.4 沉降法。取规定量供试液，自然沉降5分钟，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。供 试 品供 试 液BL增菌培养液MUG蛋白胨MUG阳性

10、、靛基质阳性MUG阴性、靛基质阴性MUG阳性、靛基质阴性MUG阴性、靛基质阳性EMB或麦康凯琼脂平板疑似菌落纯培养革兰染色、乳糖、靛基质、甲基红、V-P、枸橼酸盐利用36±1 1824小时36±1 4、24小时报告36±1 1824小时36±1 1824小时36±1 2448小时报告4.6 检验程序4.7 增菌培养 取胆盐乳糖培养基（BL）3瓶，每瓶各100ml。2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入对照菌50100个作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。37培养1824小时（必要时可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。 摇匀

11、上述BL增菌培养液，以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液各0.2ml，分别加入4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）管，37培养4、24小时后，将各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后靛基质试液45滴于上述MUG管内，观察液面颜色。MUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色），报告检出大肠杆菌；MUG阴性（无荧光）、靛基质阴性（无色），报告未检出大肠杆菌。4.8 分离培养 如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品BL。增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB平板上，培养1824小时，观察EMB平板有无可疑大

12、肠杆菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于表1所列特征，可判为供试品1g或1ml未检出大肠杆菌。表1 大肠杆菌菌落形态特征培养基菌 落 形 态曙红亚甲蓝琼脂（EMB）典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽。麦康凯琼脂典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。 当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。有疑似菌落生长者

13、，挑取可疑菌落做革兰染色、镜检、IMVic试验。4.9 纯培养 如生长菌落与表1所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选23个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养1824小时，作以下检查。 如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板，培养1824小时，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。4.10 革兰染色、镜检4.10.1 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰23次（载玻片不烫手

14、）固定。4.10.2 滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。4.10.3 滴加碘液，媒染1分钟，水洗，以滤纸吸干余水。4.10.4 滴加95%乙醇，脱色2030秒钟，水洗。4.10.5 滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。4.10.6 染色结果 革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠杆菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。4.10.7 注意事项4.10.7.1 玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。4.10.7.2 培养物的菌龄以1624小时为宜。培养时间过长的革兰阳性菌易染成红色。4.10.7.3 脱色是关键，脱色时间

15、不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性。4.11 生化试验4.11.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养2448小时，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。 为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24小时出现阳性。或适当延长培养时间。4.11.2 靛基质试验（1） 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养2448小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98%的大肠杆菌靛基质试验为阳性。一般24小时即可出

16、现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24小时，作靛基质试验。4.11.3 甲基红试验（M） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于培养液中加入甲基红指示液23滴（约每ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。4.11.4 乙酰甲基甲醇生成试验（V-P） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于2ml培养液中加入-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4小时（通常在30分钟）

17、内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。4.11.5 枸橼酸盐利用试验（C） 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养24天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。4.12 结果判断4.12.1 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性，供试晶MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌。MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠杆菌。4.12.2 MUG阳性、靛基质阴性、IMVic试验为 + 、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为 + + 、革兰

18、阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌。4.12.3 供试品培养物检查不符合9.6.2二项中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠杆菌。4.12.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不能作出检验报告。4.13 注意事项4.13.1 MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性。因此，在MUG培养基成分中增加丁去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出。既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌。4.13.2 配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解，本身则显荧光；分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。4.13.3 培养时间 供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时间，一般在4小时、24小时观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至48小时再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。4.13.4 结果观察 取供试品的MUG