TA29-Barnase转基因雄性不育芥菜的获得及豌豆花药特异启动子PsEND1功能分析载体构建

1、TA29-Barnase 转基因雄性不育芥菜的获得及豌豆花药特异启动子 PsEND1功能分析载体构建雄性不育作为杂种一代生产最为经济、有效的方法在水稻、 玉米、油菜以及部分蔬菜作物中广泛应用。 由于具有育种实用价值的天然雄性不育资源较为稀缺,同时不育资源在不同作物中分布不均匀, 导致一些农作物杂种优势利用发展缓慢。针对该情况 , 育种家将解决问题的思路转向通过基因工程创制雄性不育。目前 , 利用基因工程手段己经在多种植物中获得了雄性不育系, 并在油菜、玉米、菊苣等作物中成功商业化应用。芥菜是我国的特产蔬菜之一, 虽然近年来利用细胞质雄性不育在芥菜杂种优势育种上取得了一定的进展, 但如何发掘、创

2、造优良的芥菜雄性不育材料仍是当前芥菜雄性不育研究的重要内容之一。同时, 为保证基因工程雄性不育系育性稳定性, 获得一个时空表达严谨的雄性器官特异启动子是关键要素之一。PsEND1启动子 (Pisum sativum ENDOTHECIUM1)是一个长度为2.7Kb 的豌豆花药特异启动子 , 该启动子早期在花药原基细胞表达, 之后便严格限制在雄蕊原基的表皮、结缔组织、药室内壁和中层细胞等细胞层表达。相对基因工程雄性不育常用的绒毡层启动子 , 该启动子在花药发育的开始驱动不育基因的表达, 在小孢子母细胞分化之前阻止小孢子的发生, 最终导致花粉败育。 因此 , 该启动子控制的雄性不育可能败育更为彻底

3、。但目前 , 有关该启动子的功能区域尚未有研究报道, 同时该启动子序列太长也不利于雄性不育基因的遗传操作。针对上述情况, 本论文将烟草绒毡层TA29启动子驱动下的Barnase 基因通过农杆菌介导法导入“渝丰”榨菜, 获得了败育彻底的雄性不育植株 , 拓宽芥菜雄性不育资源。 同时 , 根据启动子的顺式作用元件的分布情况设计引物 , 对全长 2.7Kb 的 PsENDl启动子进行 5端缺失 , 分别与 GUS报告基因和 Barnase 基因构建融合表达载体 , 转化农杆菌 EHA105,并分别转化拟南芥和烟草 , 获得的主要结果如下： 1. TA29-Barnase 转基因雄性不育芥菜植株的获得

4、 (1) 将 TA29-Barnase 用农杆菌介导转化“渝丰”榨菜下胚轴, 通过PPT(phosphinothricin,膦丝菌素 ) 的多轮筛选获得转基因芥菜植株。(2) TA29-Barnase 转基因芥菜植株的分子检测提取转基因植株 DNA用TA29-1+BN-2引物进行 PCR扩增 , 结果在 5 株转基因植株中扩增出预期约630bp大小的 DNA片段 , 表明外源目的基因已整合到芥菜植物基因组中。(3) 转基因芥菜植株的花器官形态转基因芥菜植株与野生型芥菜植株形态之间无明显差异, 但开花时转基因植株与野生型植株相比花朵偏小, 并伴随花瓣较小、雌蕊短且粗、雄蕊短缩的现象 , 同时花药

5、瘦小、 干瘪、无花粉囊及花粉。 (4) 转基因芥菜植株的花药发育的细胞学观察通过石蜡切片和显微观察, 转基因植株的花药绒毡层细胞提前降解 , 不能产生有活性的花粉 , 花药败育。(5) 转基因芥菜植株的结实性转基因植株开花后 , 自交花朵的果荚基本不能膨大 , 部分脱落 , 无种子形成 , 用野生型植株花粉授粉后 , 基本均能结实 , 但与野生型植株相比果荚较短 , 不饱满 , 且种子数少。 2. PsENDl启动子的功能分析载体构建 (1) 提取豌豆 DNA,利用引物 PSE1+PSE2扩增获得预期长度为 2.7Kb 的 PsEND1启动子 , 测序分析显示获得了正确的PsEND1启动子。(

6、2) 对 PsEND1启动子进行 5端缺失 ,PCR获得五条不同长度的5端缺失启动子。分别以 PS-2+PS-7; PS-3+PS-7; PS-4+PS-7; PS-5+PS-7; PS-6+PS-7为引物 ,PsENDl 为模板 ,pfu高保真酶扩增出5 个不同长度的启动子片段, 将扩增出预期目的片断插入PSK,测序结果正确 , 依次命名为 PSKPS、PSKPS-3、PSKPS-4PSKPS、-5PSKPS-6。 (3) 不同长度 PsENDl5端缺失启动子驱动Barnase基因表达载体的构建以BN-F+BR-R为引物 ,PCABARABN-10为模板 ,pfu 高保真酶扩增 Barnas

7、e 及下游的 Nos 终止子和 Bastar 基因 ,PCR产物用 NcoI+EcoRI 酶切后插入中间载体 PB1525后进行测序分析。将 PSKPS-2(3、4、5、6) 上的不同长度启动子酶切下来替换中间载体上的 35S-35S 启动子 , 最后将构好的不同长度的PsENDl缺失启动子及下游的Barnase 基因片段用 Hind+EcoRI 酶切后插入PCABarSN/SCG载体相应位点获得对应的植物表达载体PCABarPS-2Barnase、PCABarPS-3Barnase、 PCABarPS-4Barnases、 PCABarPS-5Barnase、PCABarPS-6Barnase。上述载体经 PCR、酶切检测正确 , 用液氮冻融法转入农杆菌EHA105。(4) 不同长度 PsENDl5端缺失启动子驱动GUS报告基因表达载体的构建将PBIIN2-1/GUS载体中的 GUS基因及下游的 Nos终止子用 Ncol+EcoR1替换上述载体中的Barnase基因 , 获得 PCABarPS-2Gus、PCABarPS-3Gus、PCABarPS-4Gus、 PCABarPS-5Gus、PCABarPS-6Gus表达载体。上述载体经 PCR、酶切检测均正确 , 用液氮冻融法转入农杆菌 EHA105。(5) 将 P