PINK1Parkin介导的线粒体自噬在白蛋白超负荷所致肾小管上皮细胞损伤中的作用

1、PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在白蛋白超负荷所致肾小管上皮细胞损伤中的作用目的 : 蛋白尿不仅仅是肾小球疾病肾损伤的结果, 更是加重肾小管 - 间质损伤的一种重要原因。前期研究已证实自噬激活减轻了尿蛋白诱导的肾小管上皮细胞损伤 , 然而自噬激活减轻尿蛋白所致肾小管上皮细胞损伤而发挥保护作用的具体机制尚未完全清楚。近年来线粒体功能异常已成为研究肾小管上皮细胞损伤的热点问题。适时地清除功能异常的线粒体 , 对于维持肾小管上皮细胞正常生长与代谢具有非常重要的意义。Pink1/Parkin介导的线粒体自噬便是清除线粒体的经典途径之一。由此我们推测尿蛋白所诱导的肾小管上皮细胞损伤是否是通过受损

2、的线粒体激活了Pink1/Parkin介导的线粒体自噬 , 清除了受损的线粒体 , 从而减轻了尿蛋白超负荷所致肾小管上皮细胞损伤的呢。本研究通过选取尿蛋白的主要成分白蛋白超负荷处理肾小管上皮细胞, 并结合基因沉默技术敲除PARK2基因 , 检测肾小管上皮细胞凋亡水平、细胞内线粒体功能、自噬水平以及线粒体自噬强度的变化, 研究尿蛋白的主要成分白蛋白诱导的肾小管上皮细胞线粒体受损是否通过Pink1/Parkin信号通路介导了肾小管上皮细胞线粒体自噬激活。 方法 :(1) 研究对象 : 人近端肾小管上皮细胞株HK-2 细胞(2) 模型建立与分组 : 应用终浓度为 0mg/ml,4mg/ml,8mg/

3、ml,12mg/ml 的白蛋白处理 HK-2 细胞 , 处理 8 小时。(3) 基因沉默与分组 : 应用基因沉默技术敲除 PARK2基因 , 设正常对照组、siRNA 组、白蛋白处理组和siRNA+白蛋白处理组 , 选取自噬表达变化最明显的白蛋白浓度 8mg/ml 作为处理条件。 (4) 需要检测的指标 : 通过 western blot技术以及免疫荧光染色技术检测HK-2细胞 LC3-II 表达 ; 通过电子显微镜和JC-1 荧光染色观察线粒体结构功能变化; 通过 western blot技术检测线粒体内蛋白细胞色素C在胞浆及线粒体内的变化情况; 通过 western blot技术检测各组

4、HK-2 细胞Pink1/Parkin信号通路相关蛋白PINK1、Parkin 的表达变化及线粒体自噬变化,溶酶体荧光探针Lyso Tracker 和线粒体荧光探针Mito Tracker 共定位观察溶酶体与线粒体的融合情况 ,TUNEL法检测各实验组HK-2 细胞凋亡率。结果 :(1) 白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞凋亡的影响。与对照组相比, 白蛋白超负荷处理的HK-2 细胞的凋亡率显著增加 , 差异具有统计学意义(P<0.05)(2)白蛋白超负荷处理后 ,HK-2 细胞线粒体结构功能的影响。JC-1 检测结果显示 , 随白蛋白浓度升高细胞内线粒体膜电位降低明显, 差异具有统计学意义 (

5、P<0.05)。同时电镜观察显示 , 白蛋白超负荷诱导了HK-2 细胞线粒体线粒体肿胀 , 同时还可以看到双层膜结构增多。同时 , 免疫印迹显示 , 与对照组相比 , 白蛋白组线粒体内细胞色素C 减少 , 胞浆内细胞色素 C 增加 , 差异具有统计学意义 (P<0.05)。(3) 白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞中自噬相关蛋白LC3-II水平的影响 , 及对 HK-2 细胞内线粒体自噬相关蛋白 Pink1 、Parkin 蛋白表达的影响和线粒体自噬水平的变化: 白蛋白处理后 , 免疫荧光显示 LC3-II 阳性点增加 , 免疫印迹证实自噬相关蛋白LC3-II 表达增加 , 并且 8mg

6、/ml 时到达高峰 , 差异具有统计学意义 (P<0.05)。白蛋白处理后 , 与对照组相比免疫印迹结果显示PINK1、 Parkin 表达增加 ,差异具有统计学意义 (P<0.05)。线粒体与溶酶体荧光共定位结果显示对照组酸性溶酶体较少 , 仅见很少的线粒体与溶酶体融合的现象, 而白蛋白组可见线粒体与溶酶体融合增多。(4) 敲低 PARK2后 , 白蛋白对 HK-2 细胞内 Parkin 的蛋白表达、线粒体自噬水平的影响。结果显示 , 敲低 PARK2的表达水平可抑制白蛋白组 Parkin 表达增加 ,同时线粒体与溶酶体荧光共定位结果显示线粒体与溶酶体融合减少, 差异具有统计学意义 (P<0.05)。结论本研究证实 :(1) 尿蛋白中的主要成份 ( 白蛋白 ) 诱导了肾小管上皮细胞凋亡及线粒体损伤 (2) 白蛋白超负荷损伤线粒体同时自噬激活, 并伴有线粒体自噬关键蛋白 PINK1、Parkin 表达增加 (3) 敲低 PARK2基因水平后