遗传学实验ppt

1、遗传学实验遗传学实验1.1.果蝇的培养、形态观察及整体装片的制作果蝇的培养、形态观察及整体装片的制作2.2.果蝇的伴性遗传果蝇的伴性遗传3.3.果蝇巨染色体的制片和观察果蝇巨染色体的制片和观察4.4.从口腔脱落细胞中提取人类基因组从口腔脱落细胞中提取人类基因组DNA DNA 5.PCR5.PCR法鉴定人法鉴定人SRYSRY基因基因6.6.学生自主创新性实验学生自主创新性实验微核检测技术微核检测技术 7.7.荧光定量荧光定量PCRPCR检测烟草刺激后人肺细胞检测烟草刺激后人肺细胞ERCC4ERCC4基因和基因和GAPDHGAPDH基因的表达变化基因的表达变化 8.8.人类人类ACEACE基因多态

2、检测及其与耐力运动能基因多态检测及其与耐力运动能力的关联分析力的关联分析注意安全！注意安全！v1.1.穿实验服。穿实验服。v2.2.各项操作务必规范，小心谨慎。对有各项操作务必规范，小心谨慎。对有毒有害物质进行操作时，要做好防护。毒有害物质进行操作时，要做好防护。v3.3.避免在实验室吃喝食物。避免在实验室吃喝食物。v4.4.遵守实验室其他安全守则。遵守实验室其他安全守则。实验报告格式实验报告格式v实验名称实验名称 实验人员姓名实验人员姓名 学号学号 实验时间实验时间v一、实验目的一、实验目的v二、实验原理二、实验原理v三、实验步骤三、实验步骤v四、实验结果四、实验结果实验一实验一果蝇的培养、

3、形态观察及整体装片果蝇的培养、形态观察及整体装片的制作的制作（一）果蝇的生活史（一）果蝇的生活史昆虫纲，双翅目。昆虫纲，双翅目。2525下，下，1212天完成一个周天完成一个周期期 ：卵：卵幼虫幼虫蛹蛹成虫。成体果蝇可活成虫。成体果蝇可活几周。几周。卵卵幼虫幼虫蛹蛹成虫成虫雌雄果蝇的主要雌雄果蝇的主要形态特征形态特征性状性状雌蝇雌蝇雄蝇雄蝇体型体型较大较大较小较小腹部末端腹部末端腹端尖腹端尖腹端钝腹端钝背部黑色横纹背部黑色横纹7条条(可见可见5条条)5条条(可见可见3条条)腹片数腹片数6片片4 片片性梳性梳无无有、位于前足附节上有、位于前足附节上（二）果蝇的培养及杂交（二）果蝇的培养及杂交 1

4、 1、果蝇培养时常用的培养基、果蝇培养时常用的培养基2 2、果蝇的麻醉、果蝇的麻醉 首先，将培养瓶棉塞上的果蝇驱到瓶底，打开首先，将培养瓶棉塞上的果蝇驱到瓶底，打开培养瓶与麻醉瓶的瓶塞，迅速使两瓶口对接，培养瓶与麻醉瓶的瓶塞，迅速使两瓶口对接，将培养瓶中部分果蝇驱入麻醉瓶中，迅速塞上将培养瓶中部分果蝇驱入麻醉瓶中，迅速塞上棉塞，防止果蝇的种群污染，拔开麻醉瓶棉塞，棉塞，防止果蝇的种群污染，拔开麻醉瓶棉塞，以其侧面遮盖麻醉瓶口，再棉塞中央滴几滴乙以其侧面遮盖麻醉瓶口，再棉塞中央滴几滴乙醚，塞上棉塞，等果蝇麻醉。（果蝇翅膀外层醚，塞上棉塞，等果蝇麻醉。（果蝇翅膀外层4545度角表死亡）度角表死亡）

5、3 3、果蝇的转接、果蝇的转接被麻醉果蝇移入饲养瓶中，将瓶横卧置放，被麻醉果蝇移入饲养瓶中，将瓶横卧置放，否则未醒果蝇粘着于饲料会溺死。待果蝇苏否则未醒果蝇粘着于饲料会溺死。待果蝇苏醒后再将瓶直立，贴上标签，放入培养箱。醒后再将瓶直立，贴上标签，放入培养箱。、处女果蝇的选取、处女果蝇的选取 雌果蝇受精囊内可贮存大量的精子，因此雌果蝇受精囊内可贮存大量的精子，因此在做品系间杂交时，母本必须选用处女蝇。在做品系间杂交时，母本必须选用处女蝇。雌蝇孵出雌蝇孵出12小时后才会交配（小时后才会交配（8小时更为可小时更为可靠），所以将老果蝇清除后，靠），所以将老果蝇清除后，12小时内所小时内所收集到的雌蝇就

6、是处女蝇。收集到的雌蝇就是处女蝇。（三）果蝇整体装片的制作（三）果蝇整体装片的制作、制片：取轻度麻醉的雌雄果蝇各一只放在、制片：取轻度麻醉的雌雄果蝇各一只放在载玻片上，待果蝇将醒能动时，滴一滴树胶载玻片上，待果蝇将醒能动时，滴一滴树胶在果蝇上，盖上盖玻片，让盖片自然沉降，在果蝇上，盖上盖玻片，让盖片自然沉降，要防止气泡产生。滴树胶的量以浸没果蝇，要防止气泡产生。滴树胶的量以浸没果蝇，盖上盖片不外漏为度。盖上盖片不外漏为度。、观察：果蝇的背部横纹、雄果蝇的性梳。、观察：果蝇的背部横纹、雄果蝇的性梳。（四）作业（四）作业制作一张良好的装片，要求能够看到果蝇的背制作一张良好的装片，要求能够看到果蝇的

7、背部横纹及性梳。部横纹及性梳。实验二实验二果蝇的伴性遗传实验果蝇的伴性遗传实验 一、实验目的一、实验目的 v了解伴性遗传和非伴性遗传的区别，了解伴了解伴性遗传和非伴性遗传的区别，了解伴性遗传基因在正、反杂交中的差异。性遗传基因在正、反杂交中的差异。v掌握基本的遗传结果记录及统计处理方法。掌握基本的遗传结果记录及统计处理方法。二、实验原理二、实验原理 三、实验步骤三、实验步骤1、杂交组合亲本设计、杂交组合亲本设计正交：红眼雌蝇正交：红眼雌蝇(处女蝇处女蝇)白眼雄蝇白眼雄蝇反交：白眼雌蝇反交：白眼雌蝇(处女蝇处女蝇)红眼雄蝇红眼雄蝇反交方法：反交方法： (a)把红眼果蝇倒出麻醉，仔细挑出只雄蝇，移

8、到把红眼果蝇倒出麻醉，仔细挑出只雄蝇，移到上述杂交瓶中，贴好标签。上述杂交瓶中，贴好标签。 (b) 把白眼雌蝇（处女蝇）倒出麻醉，挑只移到杂把白眼雌蝇（处女蝇）倒出麻醉，挑只移到杂交瓶中交瓶中。 (c)等杂交亲本在杂交瓶中全部苏醒后，将杂交瓶移等杂交亲本在杂交瓶中全部苏醒后，将杂交瓶移入入25温箱中培养。温箱中培养。2、第二周，倒去杂交亲本果蝇。、第二周，倒去杂交亲本果蝇。3、第三周，观察、第三周，观察F1眼睛颜色。将眼睛颜色。将F1全部倒全部倒出，轻度麻醉，观察出，轻度麻醉，观察F1成蝇，记载正反交成蝇，记载正反交结果结果 。观察后，将。观察后，将F1果蝇全部移入一新培果蝇全部移入一新培养瓶

9、（这里不需用处女蝇）置养瓶（这里不需用处女蝇）置25温箱中温箱中培养。培养。4、第四周，倒去、第四周，倒去F1亲本。亲本。5、第五周，观察、第五周，观察F2成蝇眼睛颜色。被统计成蝇眼睛颜色。被统计过的果蝇处理掉。过的果蝇处理掉。四、实验记录及结果分析四、实验记录及结果分析X X2 2检验（检验（ F2F2） 实验三实验三 果蝇巨染色体的制片与观察果蝇巨染色体的制片与观察一一 实验目的实验目的1、练习果蝇幼虫的解剖技术及果蝇唾、练习果蝇幼虫的解剖技术及果蝇唾腺染色体的制片方法腺染色体的制片方法2、观察果蝇的唾腺染色体、观察果蝇的唾腺染色体二二 实验原理实验原理 唾腺染色体是一类存在于双翅目昆虫幼

10、虫唾腺染色体是一类存在于双翅目昆虫幼虫唾液腺内的巨大染色体，由于染色体唾液腺内的巨大染色体，由于染色体DNA经过经过多次复制，但并未发生细胞核分裂，重复复制多次复制，但并未发生细胞核分裂，重复复制后的染色线聚集在一起，因此比一般的染色体后的染色线聚集在一起，因此比一般的染色体大得多。同时，唾腺细胞中的同源染色体总是大得多。同时，唾腺细胞中的同源染色体总是处于配对状态，因此在果蝇唾腺细胞只能看到处于配对状态，因此在果蝇唾腺细胞只能看到体细胞染色体数目的一半。体细胞染色体数目的一半。 研究证明，多线染色体的带纹与某些特定研究证明，多线染色体的带纹与某些特定的基因相联系，由于多线染色体上的带纹清晰的

11、基因相联系，由于多线染色体上的带纹清晰可数，因此巨染色体是遗传学上研究染色体形可数，因此巨染色体是遗传学上研究染色体形态结构和染色体畸变的好材料。态结构和染色体畸变的好材料。三三 实验步骤实验步骤 1、取材、取材(三龄幼虫，三龄幼虫，5mm) 取一张载玻片放在双筒解剖镜下，滴一滴生理盐水，取一张载玻片放在双筒解剖镜下，滴一滴生理盐水，将幼虫放在生理盐水内。两手各握一枚解剖针，一将幼虫放在生理盐水内。两手各握一枚解剖针，一枚钉住幼虫末端的枚钉住幼虫末端的1/3处固定幼虫，另一枚解剖针钉处固定幼虫，另一枚解剖针钉住幼虫头部，前拉，把头部自身体拉开，可看到唾住幼虫头部，前拉，把头部自身体拉开，可看到

12、唾腺，剔除唾腺周围的脂肪及其它物质。腺，剔除唾腺周围的脂肪及其它物质。 2、固定染色、固定染色 吸去生理盐水，滴数滴盐酸，水解分钟，吸去生理盐水，滴数滴盐酸，水解分钟，使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体散开。散开。 吸去盐酸，加吸去盐酸，加1滴蒸馏水轻轻冲洗后吸干，滴蒸馏水轻轻冲洗后吸干，滴滴12滴醋酸洋红染液，固定染色滴醋酸洋红染液，固定染色1020分分钟。钟。3.3.制片制片 染色完成后，盖上盖玻片压片，然后用吸水染色完成后，盖上盖玻片压片，然后用吸水纸包被玻片，吸干多余染色液，并用手指轻压纸包被玻片，吸干多余染色液，并用手指轻压盖玻片，再用铅笔的

13、橡皮头或解剖针柄垂直轻盖玻片，再用铅笔的橡皮头或解剖针柄垂直轻敲，或进一步用拇指在盖玻片上适当用力压片，敲，或进一步用拇指在盖玻片上适当用力压片，注意勿使盖玻片移动。注意勿使盖玻片移动。4.4.观察观察 将制片置低倍镜下找到分散好的标本，移至将制片置低倍镜下找到分散好的标本，移至视野中心，然后转到高倍镜下观察。对染色体视野中心，然后转到高倍镜下观察。对染色体分散、个体性清楚的片子，应仔细观察染色体分散、个体性清楚的片子，应仔细观察染色体的横纹数量、形状和排列顺序，以便对照模式的横纹数量、形状和排列顺序，以便对照模式照片辨认出不同的染色体臂。照片辨认出不同的染色体臂。 一般在一个唾腺细胞中能看到

14、一般在一个唾腺细胞中能看到5条长臂的染色体，分条长臂的染色体，分别为别为X染色体、第二对染色体的左臂（染色体、第二对染色体的左臂（L）、右臂）、右臂（R）、第三对染色体的左臂（）、第三对染色体的左臂（L）、右臂（）、右臂（R），），这这5条染色体臂由条染色体臂由染色中心染色中心发射出来。这是由于第发射出来。这是由于第四对染色体相当小看不清，四对染色体相当小看不清，Y染色体浓缩，染色体浓缩，X染色体染色体的着丝点位于端部只有一条臂之故。的着丝点位于端部只有一条臂之故。四四 作业作业v制作果蝇巨染色体装片制作果蝇巨染色体装片v画出你所观察到的果蝇巨染色体，并加画出你所观察到的果蝇巨染色体，并加以标

15、注与描述。以标注与描述。 实验四实验四 从口腔脱落细胞中提取从口腔脱落细胞中提取人类基因组人类基因组DNA实验目的实验目的1、了解从细胞中提取、了解从细胞中提取DNA的基本原理的基本原理2、学习从口腔脱落细胞中提取高分子量、学习从口腔脱落细胞中提取高分子量DNA的基本操作步骤和会影响提取效果的注意事的基本操作步骤和会影响提取效果的注意事项。项。实验原理实验原理DNADNA提取的方法：提取的方法：浓盐法浓盐法阴离子去污剂法阴离子去污剂法苯酚抽提法苯酚抽提法水抽提法水抽提法金属螯合树脂抽提法金属螯合树脂抽提法破坏细胞的细胞膜，释放出破坏细胞的细胞膜，释放出DNA。1.用蛋白酶用蛋白酶K（使膜上蛋白

16、（使膜上蛋白变性分解）和去污剂变性分解）和去污剂SDS（破坏细胞膜的脂质结构）（破坏细胞膜的脂质结构）共同消化细胞。共同消化细胞。2.然后酚、氯仿等有机溶剂然后酚、氯仿等有机溶剂进行抽提，进行进行抽提，进行DNA的纯化，的纯化，去掉蛋白质、去掉蛋白质、RNA、多糖等、多糖等生物大分子。生物大分子。3.最后用无水乙醇沉淀最后用无水乙醇沉淀DNA，干燥后用干燥后用TE溶解，在溶解，在4下下可保存一年。可保存一年。实验步骤实验步骤1、先用清水漱口。然后用舌头舔颊粘膜上颚、用牙、先用清水漱口。然后用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将

17、唾液吐到杯中。用液吐到杯中。用1ml生理盐水洗涤，后将生理盐水洗涤，后将1.5ml液液体转入体转入1个干净的个干净的EP管中，管中，2000rpm离心离心5分钟，分钟，倒掉上清。倒掉上清。2、重复用、重复用1.0ml生理盐水洗涤沉淀生理盐水洗涤沉淀1次，离心，去上次，离心，去上清。清。3、沉淀中加、沉淀中加500l 1x细胞裂解液（细胞裂解液（STE），打散细胞），打散细胞团、混匀，再加团、混匀，再加15l 20mg/ml蛋白酶蛋白酶K，充分混，充分混匀。匀。 55水浴水浴30min。4、加、加500l饱和饱和酚，轻摇混匀，室温酚，轻摇混匀，室温12000rpm离离心心10min。5、上清（注

18、意不要吸到中间层白色絮状物质以及、上清（注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相）移至另一加入装有下层有机相）移至另一加入装有500l氯仿的氯仿的EP管，轻摇混匀，室温管，轻摇混匀，室温12000rpm离心离心10min。6、吸取、吸取400l上清上清（注意不要吸到中间层白色絮状（注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相）至已装有物质以及下层有机相）至已装有900 l预冷无水预冷无水乙醇的离心管，混合均匀，可见白色絮状沉淀，乙醇的离心管，混合均匀，可见白色絮状沉淀，10000rpm离心离心5min，DNA沉淀在管底。沉淀在管底。7 、 去 上 清 ， 加 入、 去 上 清 ， 加 入

19、7 0 % 乙 醇乙 醇 1 m l 清 洗 沉 淀 ，清 洗 沉 淀 ，10000rpm离心离心5min，去上清（尽量用小枪头，去上清（尽量用小枪头将液体去干净，但注意不要将沉淀也吸走），将液体去干净，但注意不要将沉淀也吸走），室温干燥室温干燥5min，再用，再用50l TE buffer溶解沉淀，溶解沉淀，4储藏备用。储藏备用。DNA纯度和浓度鉴定纯度和浓度鉴定紫外分光光度计测紫外分光光度计测OD值、琼脂糖凝胶电泳检测。值、琼脂糖凝胶电泳检测。1 OD260=0.05g/l DNA纯品纯品DNA： OD260/OD280=1.8 1.8 有有RNA 1.8 有蛋白有蛋白琼脂糖凝胶电泳，可以

20、看到一条基因组琼脂糖凝胶电泳，可以看到一条基因组DNA条带。条带。作业作业v提取人类口腔脱落细胞基因组提取人类口腔脱落细胞基因组DNA。实验五实验五 PCRPCR法鉴定人法鉴定人SRYSRY基因基因实验目的实验目的1.1.认识性别决定基因认识性别决定基因SRYSRY，了解生物的性，了解生物的性别是由基因决定的。别是由基因决定的。2.2.了解了解PCRPCR方法鉴定基因的原理及步骤。方法鉴定基因的原理及步骤。42实验原理实验原理SRYSRY基因在哺乳动物的性别分化过程中起着决基因在哺乳动物的性别分化过程中起着决定性的作用，该基因只存在于雄性个体中。以定性的作用，该基因只存在于雄性个体中。以人为研

21、究对象，对人为研究对象，对SRYSRY基因进行基因进行PCRPCR扩增，若测扩增，若测试者是男性，样本中存在该基因，测试结果为试者是男性，样本中存在该基因，测试结果为阳性；女性测试者则会相应得到阴性结果。阳性；女性测试者则会相应得到阴性结果。人人SRYSRY基因位于基因位于Yp11.3Yp11.3，只含有，只含有一个外显子，没有内含子，转一个外显子，没有内含子，转录单位长约录单位长约1.1kb1.1kb，编码一个，编码一个204204氨基酸的蛋白质。氨基酸的蛋白质。实验步骤实验步骤（一）获取口腔脱落细胞，提取（一）获取口腔脱落细胞，提取DNA（二）（二）PCR扩增扩增SRY基因基因（三）电泳检

22、测（三）电泳检测SRY基因基因 （SRY基因扩增条带大小约为基因扩增条带大小约为420bp。）。）PCRPCR反应体系（共反应体系（共25ul 25ul ） 10X10X缓冲液：缓冲液： 2.5ul2.5ul 引物：引物： 各各0.5ul0.5ul dNTP dNTP： 0.5ul0.5ul TapDNA TapDNA聚合酶：聚合酶： 0.5ul 0.5ul Mg Mg离子溶液：离子溶液： 1.5ul1.5ul 模板模板DNADNA： 2ul2ul ddH2O ddH2O： 17ul17ulvPCR实验反应实验反应 （35个循环）个循环） 94 5min 94 30s 55 30s 72 30

23、s 72 5min作业作业vPCR扩增扩增SRY基因，观察电泳结果是否与性基因，观察电泳结果是否与性别相符合。别相符合。实验六实验六 微核检测技术微核检测技术（自主创新实验）（自主创新实验）一、实验目的一、实验目的1. 了解微核检测技术原理和毒理遗传学意义。2.培养实验设计能力及解决各类问题的能力。二、实验原理二、实验原理微核（微核（micronucleusmicronucleus， 简称简称MCNMCN）也称卫星核，是细胞在分裂时因各种有害因素如辐也称卫星核，是细胞在分裂时因各种有害因素如辐射、化学药剂的所带来的损伤，使细胞核成份残留射、化学药剂的所带来的损伤，使细胞核成份残留在核外的微小核

24、染色质块，类似细胞核，游离于主在核外的微小核染色质块，类似细胞核，游离于主核之外，呈圆形或椭圆形，但体积较小，大小应在核之外，呈圆形或椭圆形，但体积较小，大小应在主核主核1/31/3以下。一般认为以下。一般认为 ，微核由染色体断片和滞，微核由染色体断片和滞留染色体组成。这些断片或染色体在分裂过程中行留染色体组成。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当细胞周期进入到下一次分裂间期时，之外的核块。当细胞周期进入到下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。它们便浓缩成主核之外的小核，即形成

25、了微核。 通过微核检测技术，可同时检测染通过微核检测技术，可同时检测染色体断裂、丢失、分裂延迟、分裂不色体断裂、丢失、分裂延迟、分裂不平衡、基因扩增、不分离、平衡、基因扩增、不分离、DNADNA损伤损伤修复障碍、修复障碍、HPRTHPRT基因突变、凋亡、细基因突变、凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传学终点，可胞分裂不平衡等多种遗传学终点，可以用来评估某种环境因素是否具有诱以用来评估某种环境因素是否具有诱变性。变性。 蚕豆根尖微核检测蚕豆根尖微核检测泥鳅血红细胞微核检测泥鳅血红细胞微核检测三、实验步骤三、实验步骤蚕豆根尖微核检测蚕豆根尖微核检测 蚕豆蚕豆:根尖细胞的染色体大，根尖细胞的染色体大，DN

26、A含量高，对诱含量高，对诱变因反应敏感，便于观察。变因反应敏感，便于观察。v蚕豆：实验材料的培养蚕豆：实验材料的培养实验处理（用选择的诱变实验处理（用选择的诱变剂处理剂处理2天）天）根尖细胞恢复培养根尖细胞恢复培养固定固定酸解酸解染染色色结果观察结果观察用蒸馏水浸洗固定好的幼根两次，每次用蒸馏水浸洗固定好的幼根两次，每次3-5分钟，吸分钟，吸净水，加入净水，加入5mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解盐酸将幼根浸没，室温下酸解5-10分钟，视幼根软化程度而定，幼根软化即可。分钟，视幼根软化程度而定，幼根软化即可。吸去盐酸，用水浸没幼根三次，每次吸去盐酸，用水浸没幼根三次，每次12分钟。最分钟。最

27、后浸于水中。后浸于水中。制片时，将幼根放置于载玻片上，截下制片时，将幼根放置于载玻片上，截下12mm左左右长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染色右长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染色58分钟。分钟。盖上盖玻片，观察。盖上盖玻片，观察。图图1. 1. 蚕豆根尖细胞微核观察图（上方两图为染色体断裂片段，下方两图为微核）蚕豆根尖细胞微核观察图（上方两图为染色体断裂片段，下方两图为微核）泥鳅血红细胞微核检测泥鳅血红细胞微核检测v泥鳅：实验材料的培养泥鳅：实验材料的培养实验处理（用选择实验处理（用选择的诱变剂处理的诱变剂处理2天）天）制片制片染色染色结果观察。结果观察。用剪刀或刀片断尾取泥鳅外周血于载玻片上，

28、用剪刀或刀片断尾取泥鳅外周血于载玻片上，用一洁净的载玻片迅速从一端向另一端刮去。用一洁净的载玻片迅速从一端向另一端刮去。晾干后先用瑞氏染液染晾干后先用瑞氏染液染1min，然后用水洗去，然后用水洗去瑞氏染液，再用磷酸缓冲液稀释瑞氏染液，再用磷酸缓冲液稀释10倍后的姬倍后的姬母萨染液染母萨染液染 15 min ，水洗，晾干即可用显，水洗，晾干即可用显微镜观察。微镜观察。 a a 正常红细胞正常红细胞 b b正常细胞核均等分裂正常细胞核均等分裂 c c正常细胞的均等分裂正常细胞的均等分裂 d d 核变形核变形 e e 核变形核变形 f f 核不均等缢缩核不均等缢缩泥鳅血红细胞的血涂片图泥鳅血红细胞的

29、血涂片图-1 泥鳅血红细胞的血涂片图泥鳅血红细胞的血涂片图-2 g g 微核微核 h h 微核微核 i i细胞不均等分裂细胞不均等分裂 j j 细胞不均等分裂细胞不均等分裂 k k 细胞开始凋亡细胞开始凋亡 l l细胞裂解细胞裂解作业作业蚕豆：每一处理至少观察蚕豆：每一处理至少观察3个根尖，每个根尖数个根尖，每个根尖数1000个细胞，计算微核数、污染指数，判断污染程度。个细胞，计算微核数、污染指数，判断污染程度。泥鳅：每处理泥鳅：每处理3个重复，每重复统计个重复，每重复统计1000个细胞个细胞 ，计，计算微核数、污染指数，判断污染程度。算微核数、污染指数，判断污染程度。微核率微核率= = 微核

30、细胞数观察细胞总数微核细胞数观察细胞总数 1000 1000 污染指数（污染指数（PIPI）= =样品实测样品实测MCNMCN平均值平均值/ /对照组对照组MCNMCN平平均值均值实验七实验七 荧光定量荧光定量PCRPCR检测烟草刺激后人检测烟草刺激后人肺细胞肺细胞ERCC4ERCC4基因和基因和GAPDHGAPDH基因的基因的表达变化表达变化实验目的实验目的1.了解基因表达与环境的关系了解基因表达与环境的关系2.了解荧光定量了解荧光定量PCR技术的原理和基本步技术的原理和基本步骤骤3.研究吸烟刺激后肺细胞基因表达的变化研究吸烟刺激后肺细胞基因表达的变化实验原理：实验原理：u 实时荧光定量实时

31、荧光定量PCR是在是在PCR 技术基础上发展起技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。它是在来的一种高度灵敏的核酸定量技术。它是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。板浓度进行定量分析。u ERCC4：在：在DNA损伤修复中的重要功能。损伤修复中的重要功能。 GAPDH：甘油醛：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在不同条件下，磷酸脱氢酶，在不同条件下，GAPDH的表达相对稳定，可作为内参照。的表达相对稳定，可作为内参照。u 在本次实验中，我们

32、将利用实时荧光定量在本次实验中，我们将利用实时荧光定量PCR分析在吸烟刺激下，分析在吸烟刺激下，ERCC4基因的表达变化。基因的表达变化。Threshold lineC(t) value 阈值阈值：荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准 C(t)C(t)值值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数。起始拷贝数越多，Ct值越小。 在实时荧光定量PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。扩增阶段：扩增阶段： 指数期指数期 平台期平台期

33、两种定量方法v绝对定量 标准曲线法v相对定量 双标准曲线法 2 2 -c(t)-c(t) 法法实验步骤：实验步骤：一、样品准备（已完成）一、样品准备（已完成）1、CSE（香烟烟雾提取物）的制备（香烟烟雾提取物）的制备2、HELF细胞（人胚肺成纤维细胞）的培养细胞（人胚肺成纤维细胞）的培养3、CSE处理处理HELF细胞细胞4、总、总RNA的抽提的抽提5、逆转录生成、逆转录生成cDNA二、二、Realtime PCR反应反应1.Realtime PCR反应体系配置：反应体系配置：2 Syber green PCR MasterMix 10 l10uM 的的PCR特异引物特异引物10.5 l10uM 的的PCR特异引物特异引物20.5 l样品样品 1 lH2O 8ul 总体积为总体积为 20 l轻弹管底将溶液混合，轻弹管底将溶液混合，5000 rpm短暂离心。短暂离心。2.将上述将上述PCR反应溶液置于反应溶液置于Realtime PCR仪上进仪上进行行PCR反应。反应。 GAPDH、 ERCC4 反应温度：反应温度： 95，5min；30个个PCR循环（循环（95，30秒；秒；55，30秒；秒；72，30秒；（收