采用离子色谱法对黄酒中氨基酸的比较研究

1、采用离子色谱法对黄酒中氨基酸的比较研究诸葛庆，李博斌，刘兴泉，郑云峰（国家黄酒产品质量监督检测中心 绍兴 312071）摘要：准确测定黄酒中的氨基酸对研究黄酒的营养价值和黄酒风味具有重要的意义，本研究采用了阴离子交换色谱法-积分脉冲安培检测法测定了江西、绍兴、福建三地黄酒中的氨基酸。分析结果显示，绍兴黄酒、福建黄酒的氨基酸总量较高，平均含量分别是3946.56mg/L、3726.80 mg/L，江西黄酒氨基酸含量为1634.33 mg/L，每种黄酒的呈味氨基酸以甜味氨基酸和苦味氨基酸为主，它们占80%左右。关键词：阴离子交换色谱法；积分脉冲安培检测；氨基酸；黄酒黄酒是我国的民族特产，黄酒是以稻

2、米、黍米、玉米、小米、小麦等粮食为主要原料，经蒸煮、糖化、发酵、压榨、过滤、贮存、勾兑等工艺生产的酿造酒。黄酒酒精度低、耗粮较少、富含多种氨基酸、蛋白质、维生素和对人体有益的矿物元素，营养丰富1。黄酒中含有多种多量的氨基酸，黄酒中的氨基酸主要是曲霉菌的酸性蛋白霉和酸性羧肽酶对蒸煮后的原料米中的蛋白质起作用而产生的，是黄酒中的主要成分之一，不仅是黄酒的营养成分，也是黄酒的风味物质或风味的前驱体，对黄酒的风味起着重要作用2,3。氨基酸具有鲜、甜、苦、涩等多种味感，赋予了黄酒丰富的味觉层次，使黄酒具有鲜美、醇和、浓郁、柔润、协调和多滋多味的特征4。黄酒中的呈味氨基酸与黄酒的风味有着很大的联系，因此准

3、确的对黄酒中的氨基酸进行定性和定量分析是非常有必要的。但是氨基酸种类繁多、性质接近，氨基酸分析是色谱界公认的难题。现在常用的方法有离子交换色谱法，基于反相色谱分离、柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相法，阴离子交换分离直接安培法检测的离子色谱法，衍生化气相色谱法和毛细管电泳法，这些方法在检测氨基酸方面还存在一定的不足。本研究所用的高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法（HPAEC-IPAD）是一种新的氨基酸分析方法5。此方法是基于氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可以形成阴离子，而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电位，可在贵金属（金、铂）电极表面发生氧化反应，从而实现氨基酸的阴离子交

4、换色谱分离和积分脉冲安培检测6,7,8。1 实验部分1.1仪器和试剂美国Dionex DX-600型离子色谱仪，配有GS50四元梯度泵，AS40自动进样器，AS50色谱柱室，ED50电化学检测器，Peak Net色谱工作站。17种氨基酸混合标样，乙酸钠（Dionet,USA），氢氧化钠、叠氮化钠为分析纯。标准溶液的配制：用20mg/L叠氮化钠水溶液配制成氨基酸标准溶液。淋洗液：去离子水、0.25mol/LNaOH、1.0mol/LNaAc。1.2色谱条件色谱柱：AminoPac PA10阴离子交换柱，包括分析柱（2×250mm）和保护柱（2×50mm）。淋洗条件：采用梯度洗

5、脱，梯度淋洗条件见表1，流速：0.25mL/min。检测条件：积分脉冲安培法检测。柱温：30。进样体积：25mL表1 分离氨基酸的梯度淋洗程序Time(min)Water(%)0.25 mol/LNaOH(%)1 mol/LNaAC(%)Curve0.09372.0901055.08515811.06436813.0643615.06040820.03070825.0307025.127703833.023707838.0207010845.0107020850.0103060860.01030601.3 样品前处理样品在分析前用去离子水稀释500倍，经过0.45µm的滤膜过滤直接进

6、样分析。 结果与讨论2.1氨基酸的色谱分离实验所测定17种氨基酸标样色谱图见图1。图1氨基酸标准色谱图从图1中可以看出，17种氨基酸在选定的分离条件下可以达到很好的分离。2.2方法的检出限、线性范围及回收率根据以上的分离条件，对氨基酸的混合标样进行测定，得出了该方法的检出限、线性范围，同时还分析了各种氨基酸的回收率，所得的数据见表2。表2方法的检出限、线性范围及回收率化合物名称检出限mol/L回归方程相关系数线性范围mol/L加入量mol/L实测值mol/L回收率%精氨酸0.00950.99900.2205.004.9398.6赖氨酸0.05890.32X+0.110.99890.2202.5

7、02.57102.8丙氨酸0.02091.01X+0.990.99760.22010.009.6996.9苏氨酸0.00912.28X+0.320.99920.2202.502.55102.0甘氨酸0.02121.10X+0.010.99950.2205.004.8997.8缬氨酸0.02541.31X+0.650.99850.2204.003.7593.8丝氨酸0.00782.49X+0.550.99940.2204.004.03100.8脯氨酸0.01621.29X+0.910.99820.2208.008.09101.1异亮氨酸0.04590.58X+0.420.99970.2202.5

8、02.53101.2亮氨酸0.06010.61X+0.530.99940.2205.005.13102.6蛋氨酸0.01382.07X+0.970.99650.2201.000.9595.0组氨酸0.00614.56X+0.430.99810.2201.000.9393.0苯丙氨酸0.01390.99990.2204.003.8997.2谷氨酸0.25790.20X+0.050.99981.0204.003.8596.2天冬氨酸0.06980.18X+0.610.99910.2205.004.7394.6胱氨酸0.00440.99690.2201.000.9696.0酪氨酸0.00601.97

9、X+0.890.99920.2202.502.57102.8由表2可知，该方法对17种氨基酸的检测具有较低的检出限、较宽的线性范围和较高的回收率，较高的回收率也说明了用该方法检测黄酒中的氨基酸所得到的数据是准确可靠的。2.3 黄酒中氨基酸的分析随意选取了江西、绍兴及福建三个省份的各5种黄酒样品进行检测，以保留时间定性、外标法定量，所得到的样品图谱见图2，分析结果见表3、表4及表5。由谱图2可见，在以上所选定的色谱条件下，样品中的17种氨基酸具有良好的分辨率和重现性。图2 黄酒中氨基酸分析谱图表3 江西黄酒氨基酸分析结果（单位：mg/l）氨基酸样品1样品2样品3样品4样品5平均值甜味氨基酸甘氨酸

10、Gly92.2662.3375.3361.1990.4976.32 丙氨酸Ala220.37165.32211.21149.96444.92238.36 脯氨酸Pro197.5084.83196.16137.50137.40150.68 丝氨酸Ser104.2973.0689.0019.2690.2175.16 苏氨酸Thr71.8065.2257.0411.9750.6751.34 胱氨酸cys11.5621.1016.0018.386.0114.61 蛋氨酸Met31.9841.5022.567.7345.7829.91 729.76513.36667.3405.99865.48636.3

11、8 苦味氨基酸组氨酸His52.0930.5736.8320.8817.9131.66 精氨酸Arg146.5593.42204.6056.2517.61103.69 缬氨酸Val115.0284.3884.1323.23122.2085.79 异亮氨酸Ile82.1469.3054.0514.6088.1761.65 亮氨酸Leu208.09193.16235.4752.85261.74190.26 苯丙氨酸Phe117.89114.12168.7051.79174.88125.48 赖氨酸Lys127.3080.90105.5625.8510.3269.99 849.08665.85889

12、.34245.45692.83668.51 鲜味氨基酸天冬氨酸Asp139.74106.33145.4413.5229.1586.84 谷氨酸Glu175.25313.59148.9486.44110.77167.00 314.99419.92294.3899.96139.92253.83 涩味氨基酸酪氨酸Tyr103.6088.44142.6337.366.0075.61 总氨基酸1997.431687.571993.65788.771704.221634.33以上五种江西黄酒样品均以红米为原料酿制而成，从表3可以看出，不同样品的黄酒其氨基酸含量是有差别的，氨基酸含量最高能达到1997.43

13、 mg/l，最低只有788.77mg/l，这是因为黄酒中的氨基酸主要是曲霉菌的酸性蛋白霉和酸性羧肽酶对蒸煮后的原料米中的蛋白质起作用而产生，因此原料中蛋白质含量的不同及蛋白质转化率的高低是决定黄酒中氨基酸含量的主要因素，但是氨基酸的含量过低也有可能是由于勾兑所造成。从分析结果还可以看出，以上五种黄酒中的呈味氨基酸以甜味氨基酸和苦味氨基酸的种类居多、含量为主。 表4 绍兴黄酒氨基酸分析结果（单位：mg/l）氨基酸样品1样品2样品3样品4样品5平均值甜味氨基酸甘氨酸Gly274.30176.35203.72273.71230.06231.63 丙氨酸Ala490.08353.58410.01503

14、.59424.04436.26 脯氨酸Pro800.11588.15527.32771.96678.51673.21 丝氨酸Ser236.88131.94133.73234.04180.63183.44 苏氨酸Thr190.5085.6888.81142.00101.96121.79 胱氨酸cys26.3113.5017.1828.8322.5221.67 蛋氨酸Met3.512.1326.995.011.957.92 2021.691351.331407.761959.141639.671675.92 苦味氨基酸组氨酸His71.0854.8372.6041.9171.3362.35 精氨酸

15、Arg423.31433.760.00527.90469.05370.80 缬氨酸Val224.96149.57194.66234.11186.35197.93 异亮氨酸Ile173.17122.67135.55172.59144.22149.64 亮氨酸Leu428.04295.67322.44431.36355.41366.58 苯丙氨酸Phe314.62206.91251.65301.23231.03261.09 赖氨酸Lys233.00202.66197.99242.81206.04216.50 1868.181466.071174.891951.911663.431624.90 鲜味

16、氨基酸天冬氨酸Asp304.89157.28154.75265.47208.40218.16 谷氨酸Glu219.93154.85211.56162.70190.02187.81 524.82312.13366.31428.17398.42405.97 涩味氨基酸酪氨酸Tyr261.73198.95248.19278.89211.10239.77 总氨基酸4676.423328.483197.154618.113912.623946.56 绍兴酒是中国黄酒的杰出代表，以糯米为原料发酵酿制而成的麦曲稻米酒，其芬芳醇厚，色香味俱佳9。从上表对氨基酸分析的结果来看，五种黄酒氨基酸的含量都比较高，呈味

17、氨基酸还是以甜味氨基酸和苦味氨基酸为主，它们的含量超过了80%。黄酒甜味氨基酸与米和麦曲经酶的水解所产生的以葡萄糖、麦芽糖等糖类物质赋予了黄酒滋润、丰满、浓厚的内质；黄酒的苦味，主要来自发酵过程中所产苦味氨基酸与发酵过程中产生的甲硫基腺苷和胺类等物质及糖色，恰到好处的苦味，使味感清爽，给酒带来一种特殊的风味；黄酒中的鲜味，来自众多氨基酸中的鲜味氨基酸以及蛋白质水解所产生的多肽及含氮碱，为黄酒所特有。黄酒的涩、苦两味同时产生的，主要由乳酸、酪氨酸、异丁醇和异戊醇等成分构成，苦、涩味适当，不但不会使酒呈明显的苦涩味，反而能使酒味有浓厚的柔和感。因此准确分析黄酒中的氨基酸对研究氨基酸对黄酒风味的影响

18、是非常有意义的。表5 福建黄酒氨基酸分析结果（单位：mg/l）氨基酸样品1样品2样品3样品4样品5平均值甜味氨基酸甘氨酸Gly216.5998.31136.69257.39276.41197.08 丙氨酸Ala475.66249.09315.24718.21488.89449.42 脯氨酸Pro279.58157.63390.78496.81389.19342.80 丝氨酸Ser186.2084.80145.88294.21300.67202.35 苏氨酸Thr78.1540.5995.20252.72177.27128.79 胱氨酸cys10.861.5117.2826.6025.8816.

19、43 蛋氨酸Met9.8015.9840.0273.2994.7846.77 1256.84647.911141.092119.231753.091383.63 苦味氨基酸组氨酸His62.7343.1071.6164.66108.6670.15 精氨酸Arg239.70152.97302.15452.01410.05311.38 缬氨酸Val134.4883.34132.57324.46271.94189.36 异亮氨酸Ile109.5765.73108.35223.79182.29137.95 亮氨酸Leu360.14157.64249.70564.69463.64359.16 苯丙氨酸P

20、he209.4993.01148.73220.54281.93190.74 赖氨酸Lys234.85121.82205.24268.49272.38220.56 1350.96717.611218.352118.641990.891479.29 鲜味氨基酸天冬氨酸Asp297.7898.74162.50522.44325.69281.43 谷氨酸Glu297.01295.67701.13340.94416.78410.31 594.79394.41863.63863.38742.47691.74 涩味氨基酸酪氨酸Tyr176.0374.05141.36214.04255.21172.14 总氨

21、基酸3378.631833.993364.435315.304741.653726.80福建黄酒又名红曲黄酒，利用耐高温红曲酿制的红曲稻米黄酒10。从对福建黄酒氨基酸的分析结果来看，个别黄酒氨基酸的含量比较高，达到5315.30 mg/l，它与含量最低的相差了3481.31 mg/l，福建黄酒中的氨基酸与绍兴黄酒的氨基酸一样，也是以甜味氨基酸和苦味氨基酸为主，而且甜味氨基酸与苦味氨基酸的含量差别不大。3 结论氨基酸是黄酒的重要组成物质，在黄酒口感和营养作用中扮演着重要的角色。长期以来，由于氨基酸的特殊性，其定量技术成为深入研究的难点。本研究采用阴离子交换色谱测黄酒中氨基酸，利用不同氨基酸之间的

22、阴离子交换色谱的保留行为存在差异，从而实现了用阴离子交换色谱-积分脉冲安培法分离、测定黄酒中的氨基酸。该检测方法只要对酒样进行简单的稀释和过滤，即可进行分析，操作简单，成本低，大大提高了氨基酸分析的效率和能力。从对三个地方的黄酒分析结果来看，每种黄酒的氨基酸种类及含量都是以甜味氨基酸和苦味氨基酸为主，它们的含量占80%左右。但是由于所用的原料及酿造的工艺不同，不同地方生产的黄酒其氨基酸的含量有所不同，其中绍兴黄酒及福建黄酒的氨基酸总量相对比较高，分别是3946.56 mg/l、3726.80 mg/l，江西黄酒的氨基酸含量相对较低，为1634.33 mg/l。黄酒就其呈味氨基酸的主体而言，都是

23、以甜味氨基酸和苦味氨基酸为主，但是由于所用的原料及酿造工艺的差异，不同产地、不同生产企业生产的黄酒其氨基酸的含量还是存在一定差别的。尽管氨基酸与黄酒的营养价值及风味有很大的联系，但是黄酒是一个复杂的体系，评价黄酒酒质的好坏还需综合考虑其它方面的因素。参考文献1. 汪建国, 徐亮.(2005) 我国黄酒的特征及展望. 江苏调味副食品，22(6),5-92. 汪建国. (2004) 黄酒中的色、香、味、体的构成和来源分析. 中国酿造, (4), 6-10, 183. 李家寿. (2001) 黄酒色、香、味成分来源浅析. 酿酒科技, (3), 48-504. 杨国军. (2003)黄酒中苦味物质及其来源探讨. 酿酒,30 (3), 44-465. 于泓, 丁永胜, 牟世芬. (2002) 阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法分