免疫标记技术1

1、主讲：谢永生主讲：谢永生病原生物学与免疫学教研室病原生物学与免疫学教研室简 介( (immunolabeling technique) )是指用荧光素、酶、放射性同位是指用荧光素、酶、放射性同位素等对抗体或抗原进行标记，然后再通过素等对抗体或抗原进行标记，然后再通过检测标记物来观察抗原抗体反应的实验技检测标记物来观察抗原抗体反应的实验技术。术。 优点优点：特异、敏度和快速；：特异、敏度和快速； 可定性、定量和定位可定性、定量和定位分 类免疫标记技术免疫标记技术 放射免疫技术放射免疫技术 免疫酶技术免疫酶技术 免疫荧光技术免疫荧光技术 免疫金标记技术免疫金标记技术 放射免疫技术 为一种将放射性同

2、位素测量的高度为一种将放射性同位素测量的高度灵敏性和抗原抗体反应的高度特异性相结合，在灵敏性和抗原抗体反应的高度特异性相结合，在体外测定超微量物质的一项技术体外测定超微量物质的一项技术 常用的放射性同位素有：常用的放射性同位素有：125I、3H 、14C、35S、32P 三种方法：三种方法： 基于竞争性结合反应的放射免疫分析基于竞争性结合反应的放射免疫分析(RIA)(RIA) 非竞争性结合的免疫放射分析非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)(IRMA) 放射受体分析技术（放射受体分析技术（RRARRA）放射免疫技术 放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、精密度

3、好的优点，常用于各种激素、微量精密度好的优点，常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定，但具有放射污染的缺点。测定，但具有放射污染的缺点。免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。效催化作用有机结合的一种方法。 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP) 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)(AP) - -灵敏度高、特异性强、准确性好、试剂稳定和简灵敏度高、特异性强、准确性好、试剂稳定和简易安全等优点。易安全等优点。免疫酶技术免疫酶技术 酶联免疫酶联免疫吸附技术吸附技术 酶免疫组

4、化技术酶免疫组化技术 双抗体夹心法双抗体夹心法 双抗原夹心法双抗原夹心法 间接法间接法 双位点一步法双位点一步法 分类竞争法竞争法 免疫荧光技术 免疫荧光技术是用荧光标记的抗体或抗原与样品免疫荧光技术是用荧光标记的抗体或抗原与样品( (细胞、组织或分离的物质等细胞、组织或分离的物质等) )中相应的抗原或抗中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析的体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析的方法方法 常用于标记的荧光素有：异硫氰酸（常用于标记的荧光素有：异硫氰酸（FITCFITC）、罗）、罗丹明（丹明（RB200RB200） 常用的方法有直接法和间接法两种常用的方法有直接法和间接法

5、两种 直接荧光法：把荧光素标记的抗体与待检标本（细直接荧光法：把荧光素标记的抗体与待检标本（细胞悬液、细胞涂片或组织切片）相互作用，洗去未胞悬液、细胞涂片或组织切片）相互作用，洗去未结合荧光标记抗体，在荧光显微镜下观察，有荧光结合荧光标记抗体，在荧光显微镜下观察，有荧光的部分为阳性的部分为阳性。 。 免疫荧光技术 间接荧光法：将特间接荧光法：将特异性抗体（一抗）异性抗体（一抗）和待检标本（细胞和待检标本（细胞悬液、细胞涂片或悬液、细胞涂片或组织切片）相互作组织切片）相互作用后加入荧光素标用后加入荧光素标记的一抗的抗体（记的一抗的抗体（二抗）显示结果二抗）显示结果。 免疫荧光技术-双抗体夹心法测

6、定甲胎蛋白双抗体夹心法测定甲胎蛋白（AFP)AFP)酶联免疫吸附技术 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是一种集免疫学、生物化学及光学是一种集免疫学、生物化学及光学检测技术为一体的测定方法。将抗原或者抗体固检测技术为一体的测定方法。将抗原或者抗体固定化后，加入酶标抗体或抗原，形成抗原抗体复定化后，加入酶标抗体或抗原，形成抗原抗体复合物，再加入酶反应的底物后，底物被酶催化成合物，再加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析接相关，由此进行定性

7、或定量分析。EE EE 双抗体夹心法【实验原理实验原理】ELISA基本的实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色物，使发生酶促反应而显色ELISA基本的实验过程【实验器材】1 1、AFPAFP诊断试剂盒诊断试剂盒2 2、A

8、FPAFP阳性对照品，阴性对照品，待检品阳性对照品，阴性对照品，待检品3 3、微量加样器、温箱微量加样器、温箱【操作步骤】1.1.将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对照各照各50ul50ul2.2.在各孔内加入酶结合物在各孔内加入酶结合物1 1滴，滴，3737温育温育3030分钟分钟3.3.甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液1 1滴，摇滴，摇匀，弃去，用蒸馏水或自来水加满各孔甩掉，反复匀，弃去，用蒸馏水或自来水加满各孔甩掉，反复5 5次，次，然后在吸水纸上吸干（倒扣在吸水纸上）然后在吸水纸

9、上吸干（倒扣在吸水纸上）4.4.各孔内加入底物和显色液各各孔内加入底物和显色液各1 1滴，轻轻摇动混匀，室温滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应避光反应2-5min2-5min，观察结果，观察结果【注意事项】 1 1、加样应加在加样孔的底部，避免产生气、加样应加在加样孔的底部，避免产生气泡，防止产生假阴性泡，防止产生假阴性2 2、洗涤必须彻底，防止产生假阳性、洗涤必须彻底，防止产生假阳性【实验结果】 若待检孔显色浅于或等于阴性对照孔则若待检孔显色浅于或等于阴性对照孔则判定为判定为 若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为判定为 若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对若待

10、检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为照孔之间则判定为阴性阴性阳性阳性弱阳性弱阳性【临床意义】1 1、原发性肝癌的大规模普查原发性肝癌的大规模普查 2 2、可以用作检测胎儿畸形、可以用作检测胎儿畸形 、畸胎瘤、畸胎瘤免疫金标记技术 免疫金标记技术免疫金标记技术( (ImmunogoldImmunogold labellinglabelling techiquetechique) ) 是将金颗粒标记抗原或抗体，是将金颗粒标记抗原或抗体，用于检测相应抗体或抗原的一种实验方法用于检测相应抗体或抗原的一种实验方法免疫金标记技术 该技术主要利用了金颗粒具有高电子密度该技术主要利用了金颗粒具有高电

11、子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中疫检测方法中【实验原理】胶体金标记的鼠抗胶体金标记的鼠抗人人hCG抗体抗体抗人抗人hCG抗抗体体抗鼠抗鼠IgG抗体抗体hCG妊娠诊断试纸妊娠诊断试纸 【实验原理】【操作步骤】1.1.待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复到室温后检测到室温后检测 2.2.将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中，将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中，5 5秒钟后