农残分析12--农药残留的酶抑制法与免疫测定

1、农药残留的酶抑制法与免疫测农药残留的酶抑制法与免疫测定技术定技术6.1 酶抑制分析测定法酶抑制分析测定法 1951年年,Giang与与Hall应用有机磷和氨基甲酸应用有机磷和氨基甲酸酯农药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理来酯农药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理来测定其含量测定其含量. 1968年年Mendoza利用薄层利用薄层-酶抑制技术测定酶抑制技术测定10种有机磷和氨基甲酸酯农药种有机磷和氨基甲酸酯农药,最小检出量可达纳最小检出量可达纳克水平克水平. 1975年年Kramer与与Gamson用一种与靛酚乙酸用一种与靛酚乙酸酯相似的化合物酯相似的化合物,测定测定110g的各种有机磷酸酯的

2、各种有机磷酸酯化合物化合物,与此同时与此同时,Zweig等也测定了甲萘威等农药等也测定了甲萘威等农药. 进入进入20世纪世纪80年代年代,人们开始以来源丰富人们开始以来源丰富,取取材和制备都十分方便的材和制备都十分方便的植物酶源植物酶源,建立薄层建立薄层-植物植物酯酶抑制方法酯酶抑制方法,为酶抑制法的进一步推广和应用创为酶抑制法的进一步推广和应用创造了条件造了条件.6.1.2 酶法检测原理酶法检测原理 有机磷和氨基甲酸酯类农药有机磷和氨基甲酸酯类农药 对参与神经生理传对参与神经生理传递过程的乙酰胆碱酯酶递过程的乙酰胆碱酯酶AChE具有抑制作用具有抑制作用,使该酶使该酶的分解作用不能正常进行的分

3、解作用不能正常进行,从而导致底物乙酰胆碱的从而导致底物乙酰胆碱的积累积累,影响动物正常的神经传导影响动物正常的神经传导,引起中毒或死亡引起中毒或死亡. 可将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测可将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测中中,如果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有如果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有机磷或氨基甲酸酯类农药机磷或氨基甲酸酯类农药,酶的活性就不被抑制酶的活性就不被抑制,试样试样中加入的基质就被酶水解中加入的基质就被酶水解,或少部分水解或少部分水解, 水解产物水解产物与加入的显色剂反应产生颜色与加入的显色剂反应产生颜色;反之反之,如果试样提取液如果试样提取液中含

4、有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药, 酶的活酶的活性就被抑制性就被抑制,试样中加入的基质就不被酶水解试样中加入的基质就不被酶水解, 从而从而不显色或颜色很浅不显色或颜色很浅,用分光光度计测定吸光度值用分光光度计测定吸光度值,计算计算出抑制率出抑制率,就可判断出样品中农药残留情况就可判断出样品中农药残留情况.6.1.3 酶源选择与提取酶源选择与提取 酶源选择是生物酶技术应用的基础酶源选择是生物酶技术应用的基础,其其性质的好坏性质的好坏,特异性大小特异性大小,稳定与否直接关系稳定与否直接关系到检测的结果到检测的结果. 在酶抑制检测的技术中在酶抑制检测的技术中,

5、既有应用既有应用AChE的的,也有应用非特异性酯酶的也有应用非特异性酯酶的,其来源其来源既有动物的既有动物的,也有植物的也有植物的.6.1.4 底物和底物和 显色剂显色剂 酶抑制剂显色反应可使用的底物和显酶抑制剂显色反应可使用的底物和显色剂很多色剂很多,大致可分为以下几类大致可分为以下几类:(1)乙酰胆碱乙酰胆碱-溴百里酚蓝显色溴百里酚蓝显色;(2) 乙酸乙酸-萘酯萘酯-固蓝固蓝B盐显色反应盐显色反应;(3)乙酸羟基吲哚显色法乙酸羟基吲哚显色法;(4)乙酸靛酯显色法乙酸靛酯显色法;6.1.5 检测方法检测方法(1)比色法比色法: 我国农业部农药检定所利用酶抑我国农业部农药检定所利用酶抑制产生的

6、显色反应制产生的显色反应,通过分光光度计比色测通过分光光度计比色测定酶的抑制率定酶的抑制率,以测定有机磷和氨基甲酸酯以测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量类农药残留量.(2)酶片法酶片法: 酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其他敏感酶酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其他敏感酶类的滤纸或类似载体物质类的滤纸或类似载体物质.(3)固相酶速测技术固相酶速测技术6.2 免疫检测技术免疫检测技术 6.2.1免疫分析概述免疫分析概述 当细菌、病毒和有害物等病原入侵时当细菌、病毒和有害物等病原入侵时,能产生能产生抵御外来物的抗体，这就是动物的免疫反应，致抵御外来物的抗体，这就是动物的免疫反应，致病的外来物称为抗原。病的外来物称

7、为抗原。 免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。结合反应为基础的分析技术。6.2.2酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法(ELISA) 原理是在测定过程，样品提取液中的农药与原理是在测定过程，样品提取液中的农药与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点。已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点。 为了观察测定结果，往往加入底物和显色剂，为了观察测定结果，往往加入底物和显色剂，以产生颜色变化。根据样品颜色和标准物质颜色以产生颜色变化。根据样品颜色和标准物质颜色的吸光度之差就可计算出样品中农药的含量的吸光度之差就可计算出样品中农药

8、的含量. 农药残留免疫分析方法的建立，一般包括待农药残留免疫分析方法的建立，一般包括待测农药的选择、半抗原合成、人工抗原合成、抗测农药的选择、半抗原合成、人工抗原合成、抗体制备和样品前处理方法等几个步骤体制备和样品前处理方法等几个步骤.(1)直接直接ELISA原理原理: 是在抗原与抗体发生反应后，直接进行显色是在抗原与抗体发生反应后，直接进行显色的非均相固相反应免疫分析方法。的非均相固相反应免疫分析方法。 1类类:首先将抗原固定在聚苯乙烯反应板孔内壁，首先将抗原固定在聚苯乙烯反应板孔内壁，然后加入然后加入待测抗原待测抗原和和酶标记酶标记抗体，固相抗原与待抗体，固相抗原与待测游离抗原竞争测游离抗

9、原竞争有限量有限量的酶标记抗体，反应后洗的酶标记抗体，反应后洗去可溶性的游离抗原与抗体的结合物，加入酶作去可溶性的游离抗原与抗体的结合物，加入酶作用底物，测定固相抗原与抗体结合物上的酶活性，用底物，测定固相抗原与抗体结合物上的酶活性，便可得到待测抗原的量。酶反应活性与待测抗原便可得到待测抗原的量。酶反应活性与待测抗原的量呈负相关的量呈负相关.2类: 首先固定抗体，然后同时加入待测抗原和酶标首先固定抗体，然后同时加入待测抗原和酶标记抗原，待测抗原与酶标记抗原竞争记抗原，待测抗原与酶标记抗原竞争有限量有限量的固的固相抗体，反应后测定固相抗体与酶标记抗原结合相抗体，反应后测定固相抗体与酶标记抗原结合

10、物上的酶活性，便可得到待测抗原的量。物上的酶活性，便可得到待测抗原的量。 酶活性酶活性强度与待测抗原呈负相关。强度与待测抗原呈负相关。(2) 间接间接ELISA原理原理 首先固定抗原，然后加入待测抗原和抗体，首先固定抗原，然后加入待测抗原和抗体，固相抗原与待测抗原竞争有限的第一轮抗体，反固相抗原与待测抗原竞争有限的第一轮抗体，反应后洗去游离的结合物，再加入酶标记的第二抗应后洗去游离的结合物，再加入酶标记的第二抗体体(以第一抗体为抗原的酶标记抗体以第一抗体为抗原的酶标记抗体)，反应后吸，反应后吸取酶标记的游离抗体，测定结合物上的酶活性。取酶标记的游离抗体，测定结合物上的酶活性。酶活性与待测抗原浓

11、度呈负相关。酶活性与待测抗原浓度呈负相关。(3)半抗原的制备 抗原是指一切能刺激机体产生抗体和致敏淋抗原是指一切能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合发生特异性免疫反应的物巴细胞，并能与之结合发生特异性免疫反应的物质。质。 抗原具有抗原具有免疫原性免疫原性和和反应原性反应原性。 免疫原性免疫原性是指能刺激机体产生抗体或能诱导是指能刺激机体产生抗体或能诱导机体产生免疫应答反应；机体产生免疫应答反应； 而而反应原性反应原性是指能与其诱导产生的抗体或致是指能与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞进行反应的特性。敏淋巴细胞进行反应的特性。 既具有免疫原性反又具有反应原性的抗原称既具有免疫原性反又具有

12、反应原性的抗原称为为完全抗原完全抗原, 而只具有而只具有反应原性反应原性而没有免疫原性而没有免疫原性的抗原称为的抗原称为不完全抗原不完全抗原,也称也称半抗原半抗原.(4)人工免疫抗原的合成人工免疫抗原的合成 首先将半抗原活化，然后通常是在条件温和首先将半抗原活化，然后通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合。的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合。 如半抗原分子含有羧基，可用碳二亚胺法或如半抗原分子含有羧基，可用碳二亚胺法或混合酸酐法，如具有羟基活性基团则采用琥珀酸混合酸酐法，如具有羟基活性基团则采用琥珀酸酐法酐法.(5)农药抗体制备农药抗体制备 农药抗体是经由小分子农药与大分子载体

13、偶农药抗体是经由小分子农药与大分子载体偶联后的联后的复合物复合物免疫动物使机体产生抗农药的抗体，免疫动物使机体产生抗农药的抗体，并取其免疫动物血清，然后进行分离、鉴定其特并取其免疫动物血清，然后进行分离、鉴定其特异性而得到的。农药抗体的产生一般可采用两种异性而得到的。农药抗体的产生一般可采用两种途径途径.1)多克隆抗体技术多克隆抗体技术 多克隆抗体是由许多多克隆抗体是由许多B淋巴细胞克隆产生的混合抗体淋巴细胞克隆产生的混合抗体.2)杂交瘤技术生产单抗杂交瘤技术生产单抗 单克隆抗体是指由一个单克隆抗体是指由一个B淋巴细胞分化增殖的浆细胞淋巴细胞分化增殖的浆细胞产生的针对单一抗原决定簇的抗体产生的

14、针对单一抗原决定簇的抗体.(6)ELISA方法的选择方法的选择分为五种类型分为五种类型:1)酶标抗原直接竞争抑制法酶标抗原直接竞争抑制法;2)酶标抗体直接竞争抑制法酶标抗体直接竞争抑制法;3)酶标抗体间接竞争抑制法酶标抗体间接竞争抑制法;4)抗体夹心法抗体夹心法; 5)间接夹心法间接夹心法(7)实验条件的选择实验条件的选择 必须注意以下几个方面必须注意以下几个方面: 1)确定酶结合的最适浓度确定酶结合的最适浓度. 2) 确定包被物质的最适浓度确定包被物质的最适浓度. 3)样品往往会产生交叉反应样品往往会产生交叉反应. 4)样品前处理时样品前处理时,使用的溶液必须考虑其影响抗体使用的溶液必须考虑

15、其影响抗体对分析物识别的可能性对分析物识别的可能性.(8)ELISA法的特点法的特点: 1)适用现场快速筛选适用现场快速筛选; 2)适用常规方法难以检测的农药适用常规方法难以检测的农药; 3)适用环境监控适用环境监控.6.3 生物传感器在农药残留检测中的应用6.3.1 生物传感器的原理生物传感器的原理 生物传感器是指由一种生物敏感部件与转换生物传感器是指由一种生物敏感部件与转换器紧密配合器紧密配合,对特定种类物质或生物活性物质具有对特定种类物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置选择性和可逆响应的分析装置. 传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间标分析物之间,如酶与底物如酶与底物,抗原与抗体抗原与抗体,外源凝集外源凝集素与糖素与糖,核酸与其互补片段之间的识别反应会产生核酸与其互补片段之间的识别反应会产生一些物理化学信号的变化一些物理