遗传实验2-2 粗糙链孢霉生活史及

1、.实验二实验二 粗糙链孢霉生活史及杂交粗糙链孢霉生活史及杂交.一、实验原理一、实验原理 粗糙链孢霉属于真菌中的子囊菌纲。粗糙粗糙链孢霉属于真菌中的子囊菌纲。粗糙链孢霉的菌丝体是链孢霉的菌丝体是单倍体单倍体（n=7n=7），每一菌丝），每一菌丝细胞中含有细胞中含有几十个细胞核几十个细胞核。由菌丝顶端断裂形。由菌丝顶端断裂形成分生孢子。成分生孢子。 分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分生孢子中含有几个核。分生孢子个核，大型分生孢子中含有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这是粗糙链孢霉的这是

2、粗糙链孢霉的无性生殖无性生殖过程。过程。.链孢霉（链孢霉（Neurospora crassaNeurospora crassa）的生活史）的生活史图图8-19. 粗糙链孢霉的菌株有两种不同的接合型，粗糙链孢霉的菌株有两种不同的接合型，用用A,a A,a 或或mt+, mt-mt+, mt-表示，他们受一对等位表示，他们受一对等位基因控制。不同结合型菌株的细胞接合产基因控制。不同结合型菌株的细胞接合产生有性孢子，这过程称为生有性孢子，这过程称为有性生殖有性生殖。有性。有性生殖可以通过两种方式进行。生殖可以通过两种方式进行。 一是产生一是产生原子囊果原子囊果，内附有产囊体，若，内附有产囊体，若另一

3、接合型的另一接合型的分生孢子分生孢子落在这落在这原子囊果的原子囊果的受精丝受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达产囊体，形成接合型基因的异核丝，到达产囊体，形成接合型基因的异核体。体。 二是不同接合型的菌株的二是不同接合型的菌株的菌丝连接菌丝连接，两种接合型的细胞核发生融合形成合子，两种接合型的细胞核发生融合形成合子，产生产生子囊果。子囊果。. 其中，其中，1 1 和和2 2 是是未交换的，称第一未交换的，称第一次分裂分离子囊；次分裂分离子囊；3-6 3-6 都是发生交换都是发生交换的，称第二次分裂的，称第二次分裂分离子囊。分离子囊。 因此，统计第二因此，统

4、计第二次分裂分离子囊占次分裂分离子囊占总子囊数的比例，总子囊数的比例，乘以乘以0.50.5，就可决定，就可决定某一基因与着丝粒某一基因与着丝粒之间的重组值。重之间的重组值。重组值去掉组值去掉% %（即乘以（即乘以100100），即为该基因），即为该基因图距。图距。.粗糙链孢霉的子囊和子囊型粗糙链孢霉的子囊和子囊型.本实验用本实验用赖氨酸缺陷型赖氨酸缺陷型（记作（记作LysLys- -）与）与野生型野生型（记作（记作LysLys+ +）杂交，得到的子囊孢子分离为）杂交，得到的子囊孢子分离为4 4个黑的（），个黑的（），4 4个是灰的（个是灰的（- -）。黑的孢子是野生型；赖氨酸缺陷型孢）。黑的孢

5、子是野生型；赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，所以呈灰色。根据黑色孢子和灰色孢子在子子成熟迟，所以呈灰色。根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，可有囊中的排列顺序，可有6 6种子囊类型。种子囊类型。 子囊型（子囊型（1 1）和（）和（2 2）的产生如图。第一次减数分裂）的产生如图。第一次减数分裂（M M1 1）时，带有）时，带有LysLys+ +的两条染色单体移向一极，而带有的两条染色单体移向一极，而带有LysLys- -的两条染色单体移向另一极。的两条染色单体移向另一极。LysLys+ +/Lys/Lys- -这对基因在这对基因在第一次减数分裂时分离，称第一次分裂分离。第二次减第一次减数分裂时分离

6、，称第一次分裂分离。第二次减数分裂（数分裂（M M2 2）时，每一染色单体相互分开，形成四分体，）时，每一染色单体相互分开，形成四分体，顺序是顺序是或或，再经过一次有丝分裂，成，再经过一次有丝分裂，成为（为（1 1）和（）和（2 2）子囊型。形成这两种子囊型时，在着丝）子囊型。形成这两种子囊型时，在着丝粒和基因对粒和基因对LysLys+ +/Lys/Lys- -间未发生过交换，是第一次分裂分间未发生过交换，是第一次分裂分离子囊。离子囊。 .图中（图中（3 3）和（）和（4 4）的形成。由于）的形成。由于LysLys基因与着丝粒基因与着丝粒间发生了一个交换，间发生了一个交换，LysLys+ +/

7、Lys/Lys- -在第一次减数分离时在第一次减数分离时没有分离，到第二次减数分裂（没有分离，到第二次减数分裂（M M2 2）时，带有）时，带有Lys+Lys+的染色单体才和带有的染色单体才和带有Lys-Lys-的染色单体相互分开，所的染色单体相互分开，所以称为第二次分裂分离。然后再经一次有丝分裂，以称为第二次分裂分离。然后再经一次有丝分裂，形成形成4 4个孢子对，顺序是个孢子对，顺序是-或或-。这是第二次分裂分离子囊。这是第二次分裂分离子囊。（5）和（）和（6）子囊型的形成与（）子囊型的形成与（3）和（）和（4）类似，）类似，也是两个染色单体发生了交换，不过交换不是发生也是两个染色单体发生了

8、交换，不过交换不是发生在第在第2条染色单体与第条染色单体与第3条染色单体之间，而是发生条染色单体之间，而是发生在在1，3或或2，4两条染色单体之间。两条染色单体之间。 .粗糙链孢霉粗糙链孢霉lys+与与lys-杂杂交子囊孢子的排列顺序交子囊孢子的排列顺序(1)、(2)为非交换型为非交换型(3)、（、（4)、(5)、(6)为交换型子囊为交换型子囊(7)、（、（8)、(9)、(10)是由转换造成的异常比例是由转换造成的异常比例.二、二、实验目的实验目的1 1 掌握粗糙链孢霉的杂交技术；掌握粗糙链孢霉的杂交技术；2 2 统计杂交结果，计算基因图距。统计杂交结果，计算基因图距。. 三、实验材料三、实验

9、材料 粗糙链孢霉野生型菌株，粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+,Lys+,接合型接合型A.A.粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株Lys-,Lys-,接合型接合型a.a. 四、实验器具和药品四、实验器具和药品 1.1.器具：显微镜，钟表镊，解剖针，接种器具：显微镜，钟表镊，解剖针，接种针，载玻片，试管，培养皿。针，载玻片，试管，培养皿。2.2.药品：药品： 次氯酸钠。次氯酸钠。. 五、实验步骤五、实验步骤 1 1、菌种活化：、菌种活化：把野生型和缺陷型菌种从冰箱取出，把野生型和缺陷型菌种从冰箱取出，分别接在两支土豆培养基试管斜面上，分别接在两支土豆培养基试管斜面上， 2828O O

10、C C温箱培养天。培养到菌丝上部有分生孢子温箱培养天。培养到菌丝上部有分生孢子产生。产生。、杂交：、杂交：（）同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生（）同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝，孢子或菌丝，25 25 O OC C温箱进行混合培养。注意要贴温箱进行混合培养。注意要贴好标签，写明亲本菌株及杂交日期。好标签，写明亲本菌株及杂交日期。（2 2）杂交后天就能看到许多棕色的原子囊果）杂交后天就能看到许多棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变黑变成子囊果。出现，以后原子囊果变黑变成子囊果。（3 3）在天左右，就可在显微镜下观察。）在天左右，就可在显微镜下观察。. 另外一种方法：另外一种

11、方法：在杂交培养基上接种一个亲在杂交培养基上接种一个亲本菌株，本菌株，25 OC培养天后即有原子囊果出培养天后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面基本湿润，继续基本湿润，继续25OC培养。原子囊果在加进分培养。原子囊果在加进分生孢子一天后即可开始增大变黑成子囊果，生孢子一天后即可开始增大变黑成子囊果，天后即成熟。天后即成熟。、显微镜观察步骤：、显微镜观察步骤：（）在长有子囊果的试

12、管中加少量（）在长有子囊果的试管中加少量无菌水无菌水，摇，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。防止分生孢子飞扬。.（）取一载玻片，滴一滴（）取一载玻片，滴一滴次氯酸钠次氯酸钠，然后用然后用接种针接种针挑出子囊果放在载玻片上，挑出子囊果放在载玻片上，用另一用另一载玻片载玻片盖上，用手指压片，将子盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜下（倍）囊果压破，置显微镜下（倍）检查，即可见到个子囊。检查，即可见到个子囊。（3）最后用过的针及玻片要用开水煮过洗最后用过的针及玻片要用开水煮过洗净。净。. （4）在显微镜下观察记录子囊孢子在子囊中的排列顺在显微镜下观察记录子囊孢子在子囊中的排列顺序，将结果记入下表。序，将结果记入下表。红色链孢霉性状遗传杂交实验结果红色链孢霉性状遗传杂交实验结果子子 囊囊 类类 型型子子 囊囊 数数非交换型非交换型（1 1）（2 2）交换型交换型（3 3）（4 4）（5 5）（6 6）合计合计其它类型其它类型.链孢霉的子囊果和子囊链孢霉的子囊果和子囊(a)成熟的子囊果；成熟的子囊果；(b)散开的子囊散开的子囊 交换型子囊交换型子囊交换型子囊交换型子囊未交换型子囊未交换型子囊.交换型子囊交换型子囊未交换型子囊未交换型子囊未交换型子囊未交换型子囊.六、作业：