定量PCR中-ct值的含义

1、实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念一一Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是：每

2、个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图1所示)。2.荧光域值(threshold)的设定3. PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10'SDcycle6-15Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系”，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。LogCO图2.

3、荧光定量标准曲线4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料现将其原理简述如下：1） TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核甘酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示。PolymerizationFORWAR

4、DPlitULRIC*Rep口RfERQ=QuERO淖RLLHSLPRlfMERStrandDisplacementCleavage2） Polymeri2ationCompleted5'TVSYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。1 二.内标在传统定量中的意义.几种传统定量PCR方法简介3：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标

5、记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板”。2）竞争法：3） 选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数oPCR-ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗

6、地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线,也可实现定量检测目的®。2.内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4）,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。(且ISSBP)BgucuuMBJOnu:1.40E+00%0QE-

7、QIA.octroi-i.ooe-on图4.相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性三.内标对荧光定量PCR的影响1.实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，弁记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间

8、不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著1ActorJK,LimorJR,HunterRL.Aflexiblebioluminescent-quantitivepolymerasereactionassayforanalysi

9、sofcompetitivePCRamplicons.JClinLabAnal,1999,13(1):40-47.®。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方©oAppliedBiosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量

10、检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域110，/2,13。1. 参考文献HiguchiR,FocklerC,etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnology,1993,11(9):1026-1030.2. DNA/RNAReal-TimeQuantitativePCR-Rev.BApplie

11、dBiosystems定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用.中华检验医学杂志2000,23(2):120-121.3. AndersonKM,CheungPH,KellMD.RapidgenerationofhomologousinternalstandardsandevaluationofdataforquantitaionofmessengerRNAbycompetitivepolymerasechainreaction.JPharmacolToxicolMethods,1997,38:133-140.4. WuhuA,WaiztuM,KochA.Arapidandsensitivepro

12、tocolforcompetitivereversetranscriprase(CRT)PCRanalysisofcellulargenes.BrainPathol,1998,8:13-18仝文斌，高巍，费然等.核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测方法.中华医学检验杂志，1999,22:83-86.8. SchnellS,MendozaC.Enzymologicalconsiderationsforatheoreticaldescriptionofthequantitativecompetitivepolymerasechainreaction(QC-PCR).JTheorBiol,1997,1

13、84(4):433-440.9. KeLD,ChenZ,YungWK.Areliabilitytestofstandard-basedquantitativePCR:exogenousvsendogenousstandards.Mol.CellProbes,2000,14(2):127-135.10. BeckerK.,D.PanandC.B.Whitely.Real-timequantitativepolymerasechainreactiontoassessgenetransfer.Hum.GeneTher,1999,10:2559-2566.11. Higgis,J.A.,etal.5&

14、#39;nucleasePCRassaytodetectYersiniapesits.JClinMicrobiol,1998,36:2284-2288.12. BiecheI.,P.Oondy,etal.Real-timereversetranscription-PCRassayforfuturenagementofERBB2-basedclinicalapolications.Clin.Chem,1999,45:1148-1156.13. WangX.X.Li,etal.Applicationofreal-timepolymerasechainreactiontoquantitateindu

15、cedexpressionofinterleukin-1betamRNAinischemicbraintolerance.2000,Neurosci.Res,59(2):238-46.荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念基线(Baseline):是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。荧光域值(threshold)的设定：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR第315个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。CT值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线T关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：1、曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数