达拉奉对血管性痴呆大鼠海马线粒体COX活性及基因表达的影响

1、达拉奉对血管性痴呆大鼠海马线粒体COX活性及基因表达的影响    【摘要】     目的 探讨依达拉奉对血管性痴呆(VD)大鼠海马组织的细胞色素C氧化酶(COX)活性及基因表达的影响。方法 采用双侧颈总动脉永久结扎法制备慢性前脑缺血大鼠模型，分依达拉奉治疗组(皮下注射，每日1次，3 mg/kg体重)，甲磺酸阿米三嗪(都可喜，灌胃，每日1次，20 mg/kg体重)组和模型组，另取正常大鼠为正常对照组。自手术7 d起给药，共20 d后，各组分别取1及2个月为时间点，处死取脑，测定大鼠海马组织COX活性及基因表

2、达并进行基因突变分析。结果 提取各组大鼠海马组织线粒体后，COX活性检测结果显示：术后1、2个月依达拉奉治疗组COX活性明显高于相应时间点模型组(P<0.05)，并有高于都可喜组趋势。依达拉奉治疗组COX表达量高于模型组(P    【关键词】  血管性痴呆;依达拉奉;细胞色素C氧化酶    The effect of edaravone on COX activity and gene expression of hippocampus mitochondria of vascular dement

3、ia ratsZHAO Qing，DU JianShi，XU ZhongXin,et al.Neurology Department, ChinaJapan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130031,Jilin， China【Abstract】 Objective To explore the effect of the activity of cytochrome C oxidase (COX) and the expression of COX in the vascular dementia (VD) rats after

4、administrated with edaravone.Methods The VD rat model was established by permanent bilateral occlusion of both common carotid arteries.The rats were divided into 4 groups randomly as control，VD model (0.9% sodium chloride)，edaravone (3 mg/kg per day，for 20 d) and duxil groups (gastric perfusion，20 m

5、g/kg per day) after place navigation training.The treatment was from the 7th day after operation and lasted for 20 d.At the 1st and 2nd month the heads of rats were cut down for brain to measure the activity of COX and the change of genetic expression.Results The activity of COX in edaravone and dux

6、il group was higher significantly than that of model group(P【Key words】 Vascular dementia;Edaravone;Cytochrome C oxidase (COX)血管性痴呆(VD)是多种因素参与的复杂病理过程，而线粒体氧化损伤起重要作用1。细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX)是线粒体电子传递链上的末端酶，也是电子传递链限速酶，在细胞能量代谢过程中起关键作用。神经元功能活动与COX活性密切相关。国内外尚未见应用自由基清除剂依达拉奉治疗VD的研究。故本实验通过观察依达拉奉对VD

7、大鼠COX的影响，探讨其对VD大鼠的保护作用。1 材料与方法1.1 材料 雄性Wistar大鼠，体重300350 g，由吉林大学实验动物中心提供。RNA prep培养细胞总RNA提取试剂盒、组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。One Step RNA PCR Kit购自TaKaRa公司。其余试剂为国产分析纯。1.2 动物模型的制备及分组 采用双侧颈总动脉永久结扎方法制备慢性前脑VD大鼠模型2。将VD模型鼠分为：依达拉奉(商品名必存，南京先生药业公司)组(皮下注射，每日1次，3 mg/kg体重);甲磺酸阿米三嗪(都可喜)组(灌胃，每日1次，20 mg/kg体重)和模型组(

8、灌胃，每日1次，同容量生理盐水)，各10只。另取10只鼠为正常对照组(灌胃，每日1次，同容量生理盐水)，除不结扎、不剪断双侧颈总动脉外，其余过程与模型大鼠相同，以减少手术损伤造成的误差。各组大鼠手术7 d起给药，共20 d后取1及2个月为时间点，处死取脑。1.3 大鼠海马组织线粒体COX活性检测 取1 h内新鲜海马组织约0.5 g提取线粒体。在冰浴中剪碎，加分离介质约58 ml(成分为25 mmol/L 蔗糖，75 mmol/L 甘露糖，50 mol/L 乙二胺四乙酸钾盐(EDTAK)，10 mmol/L TrisHCl，0.1 mol/L KCl，并加入肝素50 U/ml，pH调至7.2)，

9、在冰浴中匀浆。制备好的肌匀浆在0下4 500 r/min离心5 min，留取上清。在0下10 000 r/min离心20 min，得到棕灰色沉淀少量，再用洗液(成分为25 mmol/L蔗糖，75 mmol/L甘露糖，50 mol/L EDTAK，0.1 mol/L KCl，pH调至7.4)洗2遍，离心后悬浮于0.3% 0.4 ml的分离介质中备用。按文献3的方法进行COX活性检测。取pH7.4的200 nmol/L的KH2PO4 0.5 ml，加入双蒸水0.375 ml，2%(V/V)TritonX100 25 l，线粒体蛋白67 l(约2030 g)和细胞色素C 33 l(20 mg/ml，

10、用前以过量Vit C还原A550/A565>12)，用紫外分光光度计测定550 nm处细胞色素吸收值A的变化。1.4 RTPCR检测线粒体COX的表达情况 按说明书操作。反应结束后，取PCR反应液(510 l)进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察PCR扩增产物。用TAE(40 mmol/L TrisHAc，1 mmol/L EDTA)热溶解0.8%1.2%琼脂糖凝胶，稍冷后加入EB，铺胶。DNA溶液中加凝胶加样缓冲液(61)上样电泳，电泳缓冲液也用1×TAE，电压为15 V/cm。电泳结束后，凝胶内DNA于紫外灯下观察并拍照。1.5 大鼠海马组织线粒体COX基因突变分析 提取组织基因组

11、DNA并进行PCR扩增引物设计。根据GenBank登陆的大鼠mtDNA基因组(登陆号：X14848)全序列设计PCR扩增引物。COX在mtDNA基因组的位置是nt6 9917 674，设计3对引物;COX在mtDNA基因组的位置是nt8 5849 367，设计3对引物(表1)。PCR反应结束，取5 l PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测目的基因扩增结果。琼脂糖凝胶回收目的基因片段。切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA回收率。测序由上海英骏生物技术有限公司完成。对所测得的序列在GenBank上进行BLAST，分析突变位

12、点。表1 PCR扩增引物1.6 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS14.0统计软件进行单因素方差分析。2 结 果2.1 各组大鼠海马线粒体COX活性的影响 对各组大鼠海马组织线粒体后COX活性检测结果显示：术后1、2个月依达拉奉治疗组COX活性显著高于相应时间点模型组(P<0.05;与治疗前比较：2)P<0.012.2 各组大鼠海马线粒体COX基因表达的影响A.正常对照组;B.模型组;C.都可喜组;D.依达拉奉组;E：DNA marker(DL2000)图1 各组大鼠海马线粒体COX的表达正常对照组COX COX模型组COX COX都可喜组COX COX依达拉奉组

13、COX COX7 026 GCTGCC无义突变9 171 ATTCTT无义突变7 026 GCTGCC无义突变8 640 ACAACG无义突变7 026 GCTGCC无义突变8610 TATGATGluTyr7 018 CAAGAA8 616 AACAGCAsnSer7 132 ACAGCAThrAla9 182 AGCAGASerArg7 082 GTAGGAValGly8 641 GGACGAGlyArg7 082GTAGGAValGly9171 ATTCTTIleLeu7 026 GCTGCC无义突变8 846 GTCGCCValAla7 149 ACAACG无义突变9 396 CTTG

14、TTLeuVal7 132 ACAGCAThrAla9 182 AGCAGASerArg7 132 ACAGCAThrAla9 182 AGCAGASerArg7 040 ATAAAAIlelY7 180 CAACATGlnHis7 144 CACGACHisAsp7 144 CACGACHisAsp9396 CTTGTTLeuVal7 082 GTAGGAValGly7 189 CAACATGlnHis7 149 ACAACG无义突变7 149 ACAACG无义突变9397 CTTGGTLeuGly7 149 ACAACG无义突变7 199 CTGTTG无义突变7 385 TGAGTTSTO

15、PVal7 151 ACACCAThrPro7 339 TAGTAA无义突变7 386 ACTGCTThrAla7 429 AGAACAArgThrA：正常对照组COX1，B：模型组COX1，C：都可喜组COX1，D：依达拉奉COX1，E：正常对照组COX2，F：模型组COX2，G：都可喜组COX2，H：依达拉奉COX2，Mk：DNA Marker(DL2000)，I：正常对照组COX3，J：模型组COX3，K：都可喜组COX3，L：依达拉奉COX3，M：正常对照组COX4，N：模型组COX4，O：都可喜组COX4，P：依达拉奉COX4，Q：正常对照组COX5，R：模型组COX5，S：都可喜组

16、COX5，T：依达拉奉COX5，U：正常对照组COX6，V：模型组COX6，W：都可喜组COX6，X：依达拉奉COX6，Mk：DNA Marker(DL2000)图2 PCR扩增COX、COX基因片段结果3 讨 论脑组织富含线粒体(mitochondria)，既是细胞呼吸和能量代谢的重要场所，又是氧自由基产生的主要部位。由于脑组织有较多的不饱和脂肪酸，耗氧量大，而抗氧化酶活性相对较低，因此易遭受自由基的氧化损伤。大量自由基一方面可引起线粒体结构和功能受损，影响丙酮酸脱氢酶的活性，使葡萄糖的氧化分解发生障碍，乙酰胆碱合成不足4，导致痴呆患者学习记忆呈渐进性减退;另一方面，大量自由基还可损伤线粒体

17、DNA(mtDNA)，导致其编码的呼吸链复合物酶蛋白亚基表达下降，酶活性降低，进一步危害能量代谢机制5。而线粒体又是细胞的能量代谢中心，已有许多研究报道，缺血时线粒体发生肿胀、变性、空洞化、数量减少等一系列退行性改变，因而线粒体被认为在细胞缺血中具有重要的作用6，7。COX是细胞色素类物质，是线粒体的标志酶之一，定位于线粒体内膜，是呼吸链集合体中电子传递链的末端酶及关键酶。与有氧代谢及内呼吸密切相关，其活力直接影响线粒体氧化磷酸化过程，能真实地反映脑的能量代谢，是一个具有高敏感性、可信性和可重复性的内源性代谢标记物。有研究表明，其活力下降会造成神经细胞氧化磷酸化功能障碍和ATP合成减少8。缺氧

18、时，COX等有氧代谢酶系活性下降9。其原因是由于线粒体损伤，海马细胞中线粒体进行氧化磷酸化、合成ATP的能力下降，其内酶扩散至胞液或进一步扩散到细胞外，从而导致活性下降;或由于细胞缺氧，电子传递链不能及时将电子传给O2·，以及电子传递链上的COX等蛋白质停滞于还原状态所致10，11。本研究结果显示：依达拉奉治疗后COX活性及COX表达量较模型组显著增加。模型组COX基因有5处突变，与正常对照组比，新出现2处突变，是碱基替换，7 082位的TG，氨基酸由ValGly，7 144位的CG，氨基酸由HisAsp，比正常对照组少了4个突变位点;依达拉奉组新出现3处基因突变，比正常对照组少3个突变位点。与模型组比，依达拉奉组新出现3处基因突变，少3处突变位点。与正常对照组比，模型组COX基因新出现2个突变位点，是碱基替换，其中有1处是无义突变，另一处是8 641 GGACGA，氨基酸GlyArg，但比正常对照组少了1个突变位点。依达拉奉组新出现2个突变位点，突变频率减少，没有对照组的突变位点。