赤灵芝孢子粉对环孢素A免疫抑制模型小鼠固有免疫功能的影响

1、    赤灵芝孢子粉对环孢素A免疫抑制模型小鼠固有免疫功能的影响作者：蒋催蓉， 左 丽， 钟志强 作者单位：(贵阳医学院 免疫学教研室，贵州 贵阳 550004)【摘要】 目的： 探讨赤灵芝孢子粉对环孢素A免疫抑制小鼠固有免疫功能的影响。方法： 用不同剂量赤灵芝孢子粉对环孢素A模型小鼠灌胃, 于停药后第2、20天分别检测小鼠腹腔巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬功能、免疫器官重量及血清总补体活性(CH50)。结果： 与模型空白对照组比较，停药后第2天，高、中、低均可显著提高环孢素A小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力和胸腺指数，P<0.05,血清CH50值以中剂量组

2、提高显著(P<0.05);停药后第20天，巨噬细胞的吞噬能力以中剂量组增强明显(P<0.05)，血清CH50以高剂量组提高显著(P<0.05)，胸腺指数以低剂量组提高明显(P<0.05)。结论： 赤灵芝孢子粉可增强环孢素A免疫抑制模型小鼠的固有免疫功能。【关键词】 灵芝属; 免疫抑制; 模型，动物; 吞噬细胞; 吞噬作用Effect of Ganoderma lucidum spore on Innate Immunity ofImmunosuppression Mice Induced by Cyclosporin AJIANG Cuirong， ZUO Li， ZH

3、ONG Zhiqiang(Department of Immunology，Guiyang Medical College，Guiyang 550004，Guizhou, China)Abstract Objective: To investigate the immunoregulation effect of Ganoderma lucidum spore powder in immunosuppression mice induced by cyclosporin A (CsA). Methods： Different dosages of G. lucidum spore were g

4、iven orally to CsA immunosuppression model mice, and the phagocytic function of macrophage and neutrophile, total hemolytic complement(CHSO), weight of immune organs of the experimental mice were detected on the 2nd and 20th days after the withdrawal. Results： In mice of high, middle, and low dosage

5、 subgroups of G. lucidum spore treated group on the 2nd day of withdrawal, the phagocytic rates of macrophages,and the thymus indexes were significantly higher than those in mice of control group (P<0.05), and the serum CH50 significantly increased in the middledosage subgroup (P<0.05). Compar

6、ed with the test results of control group, on the 20th day after withdrawal, the phagocytic rates of the macrophages increased remarkably in middledosage subgroup, the serum CH50 was promoted significantly in highdosage subgroup (P<0.05), and the thymus index increased greatly in lowdosage subgro

7、up (P<0.05). The phagocytosis of neutrophil, and the spleen index were promoted on the 2nd and 20th days after withdrawal. Conclusion： Ganoderma lucidum spore can enhance the innate immunity of CsA immunosuppression model mice.Key words gardenia; immunosuppression; models, animal; phagocytes; pha

8、gocytosis环孢素A (Ciclosporin A， CsA) 是临床上广泛应用的一种免疫抑制剂，主要用于自身免疫性疾病和移植排斥反应的防治1,2。破壁赤灵芝孢子粉是延年益寿的营养食品，现代医学研究发现它对老年常见病,如慢性支气管炎、神经衰弱、肝炎、糖尿病等具有疗效，并且具有抗癌、抗衰老等作用3。目前，国内外采用CsA建立免疫抑制小鼠模型的实验研究极少，2006年9月2007年2月观察灵芝孢子粉对环孢素A致免疫抑制成年模型小鼠固有免疫功能的恢复是否有积极作用，旨在为灵芝孢子粉的临床应用提供依据。1 材料与方法1.1 实验动物清洁级BALB/c小鼠100只，68周龄，体重(20±

9、2)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号SCXK(沪)2003-0002。1.2 药物来源2036/爱灵生乐牌破壁灵芝孢子粉胶囊，0.3 g/粒，为全破壁赤灵芝，由广州宝兴生物科技有限公司提供，批号为G20090069。环孢素注射液，由Novartis制药公司提供，进口注册号H20020228，批号为S00500，为浓缩注射液，5 ml/支。1.3 主要试剂及仪器白色葡萄球菌菌液按常规方法配制，瑞特氏染液， Nikon TS100F型倒置显微镜，METTLER TOLEDO型电子精密天平， SHIMADZU UV1700型紫外分光光度仪。1.4 动物分组及给药100只小鼠随机分为2批，

10、分别用于停药后第2天及第20天实验，再将每批动物随机分为5组，赤灵芝孢子粉高剂量组(HD)、中剂量组(MD)和低剂量组(LD)及正常对照组(NC)、抑制模型空白对照组( IC)，每组10只(雄雌鼠各半)。除NC外的其余组均给予CsA 6 mg/(kg·d)，连续腹腔注射给药7 d，腹腔注射容积为2.5 ml/100 g，完成免疫抑制小鼠模型的建立。停药适应性喂养1 d后，给予赤灵芝孢子粉，用研磨器研碎、无菌蒸馏水溶解后灌胃。HD、MD和LD分别为1.2、0.6、0.3 g/(kg·d)。灌胃容积2 ml/100 g，每天1 次，连续灌药18 d，NC、IC分别给予等体积双蒸

11、水。于停药后第2、20天分别进行检测。1.5 吞噬功能的测定Hanks液3 ml，让小鼠活动10 min后，腹腔内注射1% 鸡红细胞混悬液1 ml。3045 min后取腹腔液涂于载玻片，待自然干燥后瑞特氏染色，油镜下计数100个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的数量, 计算吞噬率。1.6 胸腺指数、脾指数 各组小鼠称体重，断颈处死小鼠，分别取胸腺和脾脏，电子天平称重，计算胸腺指数、脾指数。小鼠胸腺(或)脾指数=胸腺脾脏(或)重量(mg)/体重(g)。1.7 CH50溶血活性测定 取各组小鼠血清，做不同稀释,加入致敏红细胞在37 水浴孵育30 min后，2 500 r/min离心5 min，分光光度计( 5

12、42nm) 读A542 nm，测出与50 % 溶血管最接近管值，CH50(U/ml)=1/引起50%溶血管血清量(ml) × 稀释倍数。1.8 统计学处理 实验数据均采用SPSS 11.5软件包进行统计分析，统计方法采用单因素方差分析，LSD法或SNK法，方差不齐时采用TamhaneT2法，t 检验,所有结果用(x± s)表示,P<0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 吞噬细胞吞噬功能从表1可见，与IC相比，停药后第2天，LD组、MD组及HD组，第20天MD组，赤灵芝孢子粉均可显著提高CsA小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力(P<0.05)，且LD组与HD组、L

13、D组与MD组之间差异具有显著性(P<0.05)，但对小鼠腹腔中性粒细胞的吞噬作用无显著增强(P>0.05)。2.2 CH50从表2可见，不同浓度赤灵芝孢子粉处理的模型小鼠与IC组相比，CH50值均有不同程度的增高，停药后第2和20天MD组及HD组增高明显，并具有统计学差异(P<0.05);与NC组相比，IC组及HD组的CH50值在停药后第2天降低明显(P<0.05)。表1 赤灵芝孢子粉对实验小鼠巨噬细胞、中性粒细胞吞噬功能的影响表2 赤灵芝孢子粉对实验小鼠血清CH50值的影响注：(1)与IC组相比，P<0.05;(3)与NC组相比，P<0.05。2.3 小鼠

14、脾指数、胸腺指数与IC组相比，停药后第2天赤灵芝孢子粉LD组、MD组、HD组可显著提高免疫抑制小鼠的胸腺指数(P<0.05)，HD组提高脾指数作用显著(P<0.05)，且LD组与HD组之间的胸腺指数的差异具有显著性(P<0.05);停药后第20天，胸腺指数以LD组增高明显(P<0.05)，各组间脾指数无显著差异(P>0.05);与NC组比较，IC组的胸腺指数在停药后第2、20天仍较低，具有显著差异(P<0.05)。见表3。表3 赤灵芝孢子粉对实验小鼠脾指数及胸腺指数的影响注：(1)与IC组相比，P<0.05;(2)LD组和HD组比较，P<0.05

15、;(3)与NC相比，P<0.05。3 讨论环孢素A(Cyclosporine, CsA)是由11 个氨基酸组成的环状多肽，是土壤中一种真菌的活性代谢物。1978年英国首次将CsA应用于临床肾移植，此后CsA又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官的移植，均取得令人满意的效果，明显提高了移植病人的生存率。CsA作为一种高选择性、强力的免疫抑制剂，可抑制细胞介导的反应发生4，包括同种异体免疫、迟发性皮肤过敏、实验性过敏性脑脊髓炎、Freund氏佐剂性关节炎、GVHD以及T细胞依赖性抗体的产生。在细胞水平，环孢素抑制包括IL2、T细胞生长因子(TCGF)在内的淋巴因子的生成和释放，可阻断细胞周期G0

16、或G1期的休止淋巴细胞，并通过激活的T细胞来抑制抗原触发的淋巴因子的释放5。王俨等6发现CsA可以抑制小鼠Th17细胞的分化。灵芝孢子粉为灵芝实体成长过程中散发的孢子聚集而成，孢子内含有比灵芝更丰富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白质、酶类等特殊成分，因此灵芝孢子在增强免疫、抑制肿瘤的药效方面远远超过其母体灵芝7。目前，免疫抑制动物模型的建立多选用环磷酰胺8、糖皮质激素8等免疫抑制剂，本实验选用临床广泛应用的免疫抑制剂CsA构建免疫抑制小鼠模型，旨在观察2036/爱灵生乐牌全破壁赤灵芝破壁孢子粉对免疫抑制小鼠部分固有免疫学指标的影响，为灵芝孢子粉作为免疫功能恢复的辅助药物提供实验依据。单核吞噬系统是机

17、体固有免疫系统的重要组成部分，包括单核、巨噬细胞及中性粒细胞，它们能非特异性吞噬、清除侵入机体的病原微生物等异物。在对单核吞噬细胞系统调节作用方面，孙美芳8在灵芝孢子粉拮抗环磷酰胺毒副反应的研究中发现，灵芝孢子粉对环磷酰胺引起的小鼠巨噬细胞吞噬能力减弱有明显拮抗作用。任玮等9实验表明，灵芝孢子粉可显著增强糖皮质激素免疫抑制模型小鼠的巨噬细胞吞噬功能。本实验采用CsA建立免疫抑制小鼠模型，赤灵芝孢子粉低、中、高剂量都能明显提高CsA免疫抑制摸型小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬清除能力(P<0.05)。补体系统广泛参与机体抗微生物防御反应以及免疫调节作用，是机体固有免疫的重要组成部分。本实验

18、显示，中、低剂量的赤灵芝孢子粉对CsA模型小鼠的CH50值均有不同程度的增强作用，但模型空白组的血清总补体溶血活性仍较低(P<0.05)，高剂量赤灵芝孢子粉组的CH50值停药后第2天降低显著，停药后第20天明显升高(P<0.05)，提示停药后第2天和20天赤灵芝孢子粉高、中、低剂量可显著提高免疫抑制小鼠的胸腺指数，高剂量组的脾指数于停药后第20天提高显著(P<0.05)，表明2036/爱灵生乐牌破壁赤灵芝孢子粉对CsA免疫抑制小鼠的固有免疫功能有提高作用。【参考文献】1Leonardi S, Marchese G, Rotolo N,et al. Cyclosporin is safe and effective in severe atopic dermatitis of childhood, report of three cases J.Minerva Pedia