雄黄中砷对大鼠肝肾功能的影响

1、雄黄中砷对大鼠肝肾功能的影响 【摘要】 【目的】采用混合效应线性模型评价不同毒性剂量雄黄在大鼠体内的血砷浓度变化及对其肝肾功能的影响。【方法】选用SD大鼠分别单次灌服3738、1869、0935g/kg雄黄，测定不同剂量组大鼠药后各时间点/段血砷浓度及尿N乙酰D氨基葡萄糖苷酶(NAG)、碱性磷酸酶(AKP)活性，血清天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、丙氨酸氨基转移酶(GPT)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)活力，并采用混合效应线性模型对其进行统计分析。【结果】大鼠单次灌服不同剂量雄黄，尿AKP、NAG活力，血清BUN、GOT活力的改变有显着的剂量依赖关系，并与血砷浓度变化有显着的线性关系。【结论

2、】在本研究剂量范围内，雄黄中的砷可造成肾小管上皮细胞及肝脏的损伤，但未影响到肾脏的排泄能力。 【关键词】 雄黄/毒性;砷/血液;肝肾功能;混合效应线性模型;大鼠雄黄(realgar)为硫化物类矿物雄黄族雄黄，具有燥湿、杀虫、解毒之功效，既可单独使用也可在复方中配伍使用。现代药理研究显示1，雄黄具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用，临床上多用于治疗急性早幼粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、带状疱疹、脓疱疮、溃疡性黑色素瘤、淋巴结核等疾病。雄黄是一种常见的含砷矿物药，而砷(As)是一种常见的环境毒物和已知的人类致癌物。近年来动物实验和人群流行病学调查均表明砷可引起不同程度的肝肾功能损伤3-4。现就毒性剂量

3、下，雄黄在大鼠体内血砷浓度变化的毒代动力学及对大鼠肝肾功能的影响进行研究，以期为雄黄的合理、安全使用提供实验依据。现将研究结果报道如下。1材料与方法11仪器AFS920型双道原子荧光光度计(中国北京吉天仪器公司产品)，As2型高性能砷空心阴极灯(中国北京有色金属研究总院产品)，MK1型光纤压力自控微波溶样系统(中国海新科微波技术应用研究所产品)，Echo Lcd型全自动生化分析仪(意大利Lagotech仪器公司产品)，UV260型紫外可见光分光光度计(日本Shimadaz公司产品)。12主要试剂As标准溶液：1000g/mL，5%H2SO4介质，国家标准溶液GSB G 6202790，国家钢铁

4、材料测试中心配制;丙氨酸氨基转移酶(GPT)试剂盒，上海科华东菱诊断用品有限公司，批号：20070112;天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)试剂盒，上海科华东菱诊断用品有限公司，批号：20070122;肌酐(Cr)试剂盒，上海科华东菱诊断用品有限公司，批号：20070320;尿素氮(BUN)试剂盒，上海科华东菱诊断用品有限公司，批号：20061222;碱性磷酸酶(AKP)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20070208; N乙酰D氨基葡萄糖苷酶(NAG)试剂盒，上海太阳生物技术有限公司，批号：67115。13受试动物SD大鼠，雌雄各半，体质量(30050)g，清洁级，由广东省医学实验动物中心

5、提供，合格证号：0026252。14受试药雄黄由广州药材公司购得，批号：20040612。经氢化物发生原子荧光法(HGAFS)测定其中As2S2的含量为9829g/kg，符合中华人民共和国药典规定;经测定可溶性砷为(49900223)g/kg，其中可溶性砷中的三价砷为(24290195)g/kg。15给药剂量和方法SD大鼠分为3组，分别一次性灌胃雄黄高剂量3738g/kg、中剂量1869g/kg、低剂量0935g/kg，灌胃量为10mL/kg。给药前12h禁食，不禁水。16样品采集161采血时间点及方法分别于药前，药后0、005、015、025、05、075、1、2、3、4、6、8、12、24

6、、32、48、56、72、80、96、168h眶后静脉丛采血约10mL。张娟，等.雄黄中砷对大鼠肝肾功能的影响第4期2010年第27卷广州中医药大学学报162分组每个剂量组32只大鼠随机分为4组，每组8只，第1组在药后005、075、4、24、72h采血，第2组在药后015、1、6、32、80h采血，第3组在药前、药后0、025、2、48、96、168h采血，第4组在药后05、3、8、12、56h采血。血样经2400r/min离心10min分离血清，于-70冰箱保存待测。17检测指标准确量取0406mL血清于聚四氟乙烯溶样杯中，加入浓硝酸2mL，室温下放置2h进行预反应，然后进行微波消化，05

7、、10mPa压力下各加热2min，冷却后开启消解罐。将聚四氟乙烯溶样杯置于电热板上加热，赶尽NO2和过剩的HNO3，加水定容至10mL，稀释一定倍数，测定样品中血砷浓度。取第3组药前、药后0、025、96、168h血清，用于GOT、GPT、Cr、BUN测定;收集第1组大鼠096h各时间段尿液用于尿NAG、AKP的测定。18统计学方法采用SAS 913 统计分析软件(SAS. . Institute Inc.， Cary， NC， USA.)进行混合效应线性模型的分析。混合效应线性模型：Yijk=0j+1jArsenicij+b0i+ijk变量说明：Y代表待测指标(AKP、NAG、BUN、GOT

8、、Cr、GPT);i=1，2，3，分别代表雄黄高、中、低剂量组;j=1，2，3，分别代表待测指标不同测量点;k=1，8，代表第k次重复测量;Arsenicij代表第i个剂量组，在第j次测定待测指标时间点，平均血砷浓度去空白变化值;0j代表在第j次采血测量指标的时间段内，血砷浓度变化为零时，待测指标的去空白的测量值(即截距)，单位与待测指标的单位相同;1j代表在第j次采血测量指标的时间段，单位血砷浓度上升时，待测指标平均上升的值(即斜率)，单位为“待测指标/血砷浓度”;0j和1j共同表达固定效应，即血砷浓度变化对待测指标的影响;b0i代表不同剂量组的随机效应，即不同剂量对待测指标与血砷浓度之间关

9、系的影响;ijk代表随机误差。2结果21大鼠单次灌服雄黄后各剂量组血砷浓度时间关系结果见图1。大鼠单次灌服雄黄后，总砷在血清中吸收较快，分布、清除较缓慢，整个药时过程中出现2个峰。高、中、低剂量组吸收半衰期t1/2(Ka)分别为146、0716、1542h;分布半衰期t1/2()分别为773、9437、8895h;消除半衰期(t1/2)分别为1721、24285、24234h;达峰时间tmax分别为3、6、1h。22血砷浓度对尿酶活性的影响结果见图2和表1。为比较各时间段尿酶活力和血砷浓度的关系，故将各时间段内所测得各时间点血砷浓度进行平均，得到血砷的时间段数据。图2-a、b中上面的3个图从左

10、到右分别是低、中、高剂量雄黄组在10个时间段(time1)的AKP、NAG活力，下面的3个图从左到右分别是低、中、高剂量雄黄组在10个时间段(time1)的血砷浓度去空白的变化值。其中time1=1、2、10分别代表02h、26h、612h、1224h、2432h、3248h、4856h、5672h、7280h、8096h。图中折线是对图中的数据点的平均值的连接。固定效应参数估计随机效应参数估计时间段j截距(0j)斜率(1j)剂量组截距(b0i)02h1272819-01142低剂量组-3797526h2187564-004413612h3184853-0022161224h4247017-0

11、062332432h514502800662中剂量组0018013248h6157450006674856h7223596001535672h8256725-00466高剂量组377957280h919261702278096h1027544207704注：表示血砷浓度和AKP之间有显着的线性关系(P=00134);表示3248h时间段斜率显着比02h时间段高01809(P=00094);表示4856h时间段斜率显着比02h时间段高01295(P=00103);表示7280h时间段斜率显着比02h时间段高03412(P=00107);表示8096h时间段斜率显着比02h时间段高08846(P0

12、0001)表1-a中固定效应参数估计说明，血砷浓度和AKP活力之间存在显着的线性关系(P=00134)。从表中对应的参数估计可以看出，在实验的前期，即224h各时间段的斜率比02h低，血砷浓度变化对AKP的影响基本是下降或接近水平。由此说明，在实验前期， 随着血砷浓度变化，AKP下降，随时间推移下降幅度在变小;但是在后面的3248h、4856h、7280h和8096h时间段， 其斜率显着高于02h时间段(均P002)，效应的参数估计分别是00667、00153、0227、 07704。即在实验的后期，随着血砷浓度变化，AKP上升，随时间推移上升的幅度变大;通过随机效应参数估计可以看出，雄黄给药

13、剂量对AKP的影响是高剂量的AKP比群体平均剂量高出37795;中剂量基本与群体平均剂量类似，只高出001801;低剂量比群体平均剂量低37975。表1-bNAG活力和血砷浓度混合效应线性模型的参数估计固定效应参数估计随机效应参数估计时间段j截距(0j)斜率(1j)剂量组截距(b0i)02h160789-00285低剂量组-0987326h235021-000779612h329539-0002251224h46080403-0019742432h579626-003027中剂量组031903248h6538970013354856h7621830018475672h8118877-00789

14、9高剂量组066837280h969767012128096h1010084406471注 ：表示血砷浓度变化和NAG活力之间有显着的线性关系(P=00094);表示3248h时间段斜率显着比02h时间段高004185(P=00113);表示4856h时间段斜率显着比02h时间段高004697(P=00001);表示7280h时间段斜率显着比02h时间段高01497(P00001);表示8096h时间段斜率显着比02h时间段高06756(P00001);表示5672h时间段截距显着比02h时间段高58088(P=00099);表示8096h时间段截距显着比02h时间段高40055(P=0034

15、8) 表1-b中固定效应参数估计说明，血砷浓度变化和NAG活力之间存在显着的线性关系(P=00094)。 从表中可以看出232h各时间段的斜率比02h时间段低，因此，在实验的前期，血砷浓度变化对NAG的影响基本是下降的，即随着血砷浓度变化，NAG下降。但是在后面的3248h、4856h、7280h和8096h时间段， 其斜率显着高于02h时间段 (均P002)，对应的参数估计分别是001335、001847、01212、 06471。即在实验的后期，随着血砷浓度变化，NAG上升，随时间推移上升的幅度变大;通过随机效应参数估计可以看到，雄黄给药剂量对NAG的影响是给药高剂量的NAG比群体平均剂量

16、高06683;中剂量比群体平均剂量高出03190;低剂量比群体平均剂量低-09873。23血砷浓度对血生化指标的影响结果见图3、表2和表3。为比较各时间段血生化指标和血砷浓度的关系，故将各时间段内所测得各时间点血砷浓度进行平均，得到血砷的时间段数据。图3-a、b、c、d上面的3个图从左到右分别是低、中、高剂量组在3个时间段(time2)的血BUN、GOT、Cr、GPT值;下面的3个图从左到右分别是低、中、高剂量组在3个时间段(time2)的血砷浓度去空白的变化值。其中time2=1、2、3 分别代表 0025h、02596h、96168h。图中的折线是对图中数据点平均值的连接。表2BUN活力和

17、血砷浓度混合效应线性模型的参数估计变量参数估计标准误差P 值固定效应截距-012360253406406血砷浓度变化: 斜率0007028000203800009低剂量组截距-032720437704570中剂量组截距034340451104489随机效应高剂量组截距174220503800009注：表示血砷浓度与BUN有显着线性关系，斜率估计0007028显着大于零(P=00009);表示高剂量组的截距显着比群体平均剂量的截距高17422(P=00009)由表2的固定效应可见，血砷浓度变化和BUN有显着的线性关系(P=00009)。 随着血砷浓度升高，BUN升高。因为通过运用似然比检验可知，

18、血砷浓度变化时间段的交互作用是不显着的，说明在不同的时间段，血砷浓度变化和BUN之间呈现相同的显着的线性关系;随机效应说明剂量对BUN的影响表现为高剂量的BUN比群体平均剂量显着升高，增高量是3个剂量组中最大的，为17422(P=00009);中剂量比群体平均剂量高03434;低剂量比群体平均剂量低03272。不同剂量对固定效应，即对“血砷浓度变化与BUN之间的相关关系”的影响不显着。表3GOT活力和血砷浓度固定效应及随机效应参数估计固定效应参数估计随机效应参数估计时间段j截距(0j)斜率(1j)剂量组截距(b0i)0025h1685904-02120低剂量组-3976102596h22171

19、104-14316中剂量3671529-15821高剂量组-144063注：表示02596h时间段的截距显着大于零(P=00382);表示0025h时间段的截距显着比02596h时间段低-14852(P =00009);表示96168h时间段的截距显着比02596h时间段低-14996(P=00006);表示02596h时间段的斜率显着小于零(P00001);表示0025h时间段斜率显着比02596h时间段高12196(P=00003)从表3中的固定效应参数估计可见， 在开始的0025h时间段，血砷浓度变化对GOT基本是接近的，对应的参数估计是-02120(P005)

20、;在中间的02596h时间段， 斜率显着(P00001)，截距也显着比0025h、96168h时间段高14852(P=00009)、14996(P=00006)，表中对应的斜率估计是-14316。在实验的中期，GOT很高，随着血砷浓度变化，GOT大幅下降，到后期截距回到671529，GOT回到实验前期的水平。即在不同的时间段，血砷浓度变化和GOT之间呈现出不同的显着的线性关系;表中的随机效应参数估计说明了剂量对GOT的影响表现为高、中、低剂量比群体平均剂量分别低144063、高183825、低39761，但不同剂量对固定效应，即对“血砷浓度变化与GOT活力之间的相关关系”的影响不显着。根据统计

21、分析，结果显示Cr和GPT与血砷浓度变化之间无显着相关性。3讨论大鼠单次灌胃给药雄黄的毒代动力学实验中剂量的选择是以前期急性毒性实验所得半数致死量(LD50)为根据而设定的，分别设定1/2 LD50、1/4 LD50、1/8 LD50为毒代动力学实验高、中、低剂量组，其中高、中、低剂量间呈比例关系，低剂量组是临床等效剂量的10倍。尿酶活性在急性肾脏功能损害评价指标中最敏感， NAG和AKP主要反映肾小管上皮细胞的功能情况，而重金属主要损害近段肾小管，因此考虑该2项指标可能对评价大鼠单次灌服毒性剂量雄黄的肝肾毒性更为敏感。BUN是从蛋白质的正常代谢中产生的废物随尿排出，因而其在血中的升高通常说明肾的损害。由于BUN含量受营养情况和肝脏毒性的影响，而后者可为许多药物共有的作用结果，因此，在评价肾功能损害程度方面还要综合血清肌酐检查。Cr是肌酸代谢的产物，可完全经肾小球滤过，随尿排出，血清肌酐常用来评价肾脏的排泄能力。肝脏血清酶学最常用的检测指标是GPT和GOT。血清转氨酶活性的高低与肝细胞受损的程度一致，GPT存在于肝细胞胞质水溶性部分，存在于细胞质水溶性部分及线粒体中。肝细胞损害严重时，不仅胞质中的酶释放出来，而且线粒体中