发酵工程培养基

1、第三章第三章 发酵工业培养基发酵工业培养基及原料处理及原料处理v发酵工业培养基是工业发酵微生物生长和分发酵工业培养基是工业发酵微生物生长和分泌发酵产物的营养物质。泌发酵产物的营养物质。v发酵培养基营养基质一般含五大方面要素：发酵培养基营养基质一般含五大方面要素：碳源碳源、氮源氮源、无机盐及微量元素无机盐及微量元素、水水，以及，以及生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂等。等。v淀粉质原料是发酵工业的重要原料，必须水淀粉质原料是发酵工业的重要原料，必须水解成葡萄糖等可发酵性糖，才能被生产菌利解成葡萄糖等可发酵性糖，才能被生产菌利用；糖蜜原料也需要进行处理，发酵才能顺

2、用；糖蜜原料也需要进行处理，发酵才能顺利进行。利进行。发酵工程的流程发酵工程的流程空气空气空气净化处理空气净化处理保藏菌种保藏菌种斜面活化斜面活化扩大培养扩大培养种子罐种子罐发酵罐发酵罐培养基制备灭菌培养基制备灭菌灭菌灭菌产物分离纯化产物分离纯化成品成品原料预处理原料预处理第一节第一节 培养基的成分及来源培养基的成分及来源 一、碳源营养一、碳源营养v常用碳源：常用碳源：糖类、油脂、有机酸和低碳醇。糖类、油脂、有机酸和低碳醇。v各种菌种对不同碳源的利用速率和效率不一各种菌种对不同碳源的利用速率和效率不一样。样。 1.葡萄糖葡萄糖v微生物最易利用，是加速生长的有效的糖。微生物最易利用，是加速生长的

3、有效的糖。v但过多的初始葡萄糖会抑制微生物生长，引但过多的初始葡萄糖会抑制微生物生长，引起葡萄糖效应，这主要是葡萄糖的分解代谢起葡萄糖效应，这主要是葡萄糖的分解代谢阻遏造成。阻遏造成。v另外过多葡萄糖会过分加速菌体呼吸，以致另外过多葡萄糖会过分加速菌体呼吸，以致溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物积溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物积累，累，pH下降，影响微生物生长和产物合成。下降，影响微生物生长和产物合成。 2.糖蜜糖蜜v又称糖浆，俗称糖稀。又称糖浆，俗称糖稀。v生物发酵工业所用的糖蜜，主要是指制糖工生物发酵工业所用的糖蜜，主要是指制糖工业上的废糖蜜，它是甘蔗糖厂或甜菜糖厂的业上的废糖蜜，

4、它是甘蔗糖厂或甜菜糖厂的一种副产品。一种副产品。v含丰富的糖、氮、无机盐、维生素等。主要含丰富的糖、氮、无机盐、维生素等。主要含蔗糖，总糖可达含蔗糖，总糖可达50一一75%。v甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜的成分有所不同。甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜的成分有所不同。v甘蔗糖蜜是以甘蔗为原料，经过压榨，其蔗甘蔗糖蜜是以甘蔗为原料，经过压榨，其蔗汁在经过澄清、净化、过滤处理后，蒸发浓汁在经过澄清、净化、过滤处理后，蒸发浓缩、结晶及助晶、离心分离出来的褐色浓稠缩、结晶及助晶、离心分离出来的褐色浓稠的液体，其中含有较大量的蔗糖和转化糖。的液体，其中含有较大量的蔗糖和转化糖。v糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生产中，抗生糖蜜常用在

5、酵母和丙酮丁醇的生产中，抗生素等微生物工业也常用它作碳源。素等微生物工业也常用它作碳源。v酒精生产中若用糖蜜代甘薯粉，可省去蒸煮、酒精生产中若用糖蜜代甘薯粉，可省去蒸煮、制曲、糖化等过程，简化了工艺。制曲、糖化等过程，简化了工艺。v糖蜜使用的注意点：糖蜜使用的注意点：v除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。处理。v例：谷氨酸发酵例：谷氨酸发酵v有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）、生物素（发酵控制）。

6、晶）、生物素（发酵控制）。v预处理：澄清预处理：澄清脱钙脱钙脱除生物素脱除生物素v例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵v有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）。有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）。v预处理：预处理：黄血盐黄血盐 3.淀粉、糊精淀粉、糊精v淀粉在发酵工业中被普通使用，它可克服葡淀粉在发酵工业中被普通使用，它可克服葡萄糖代谢过快的弊病，同时淀粉来源丰富，萄糖代谢过快的弊病，同时淀粉来源丰富，价格也比较低廉。价格也比较低廉。v常用：常用：玉米淀粉，小麦淀粉和甘薯淀粉等。玉米淀粉，小麦淀粉和甘薯淀粉等。v有些微生物可直接利用玉米粉、土豆粉作碳有些微生物可直接利用玉米粉、土豆粉作

7、碳源。源。v纤维素和含淀粉较多的野生植物也是今后开纤维素和含淀粉较多的野生植物也是今后开发碳源的广阔天地。发碳源的广阔天地。 4.油和脂肪油和脂肪v脂肪作碳源时需供给比糖代谢更多的氧，否脂肪作碳源时需供给比糖代谢更多的氧，否则，大量脂肪酸和代谢中的有机酸积累，则，大量脂肪酸和代谢中的有机酸积累，pH下降，影响酶作用。下降，影响酶作用。v常用的油：常用的油：豆油、菜油、葵花子油、猪油、豆油、菜油、葵花子油、猪油、鱼油、棉子油等。鱼油、棉子油等。 5.有机酸有机酸v乳酸、柠檬酸、乙酸等有机酸或它的盐也能乳酸、柠檬酸、乙酸等有机酸或它的盐也能作碳源。作碳源。v有机酸的利用常会使有机酸的利用常会使pH

8、上升，尤其是有机酸上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱性物质的产生。盐氧化时，常伴随着碱性物质的产生。v不同碳源在氧化时，对不同碳源在氧化时，对pH的影响各不相同。的影响各不相同。 6.正烷烃正烷烃v己用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和己用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的发酵。酶制剂的发酵。 7.甲醇、乙醇甲醇、乙醇v已作为生产已作为生产SCP的碳源。的碳源。v近年来国外用乙醇代粮发酵的工艺发展也十近年来国外用乙醇代粮发酵的工艺发展也十分迅速，菌体得率比葡萄糖等还高。分迅速，菌体得率比葡萄糖等还高。 二、氮源营养二、氮源营养v有机氮源和无机氮源应当混合使用。有机氮源和无机氮源应当

9、混合使用。v早期：容易利用易同化的氮源早期：容易利用易同化的氮源无机氮源。无机氮源。v中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质。质。 1.无机氮无机氮v常用的有：常用的有：铵盐、硝酸盐和氨水等。也称为铵盐、硝酸盐和氨水等。也称为速效氮源速效氮源。v无机氮源的迅速利用会引起无机氮源的迅速利用会引起pH的变化。的变化。v生理酸性物质：硫酸铵。生理酸性物质：硫酸铵。v生理碱性物质：硝酸钠。生理碱性物质：硝酸钠。v正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的酵过程的pH有积极作用。有积极作用。v氨水：氨水： v在发酵中除可以

10、调节在发酵中除可以调节pH外，它也是一种容易外，它也是一种容易被利用的氮源，在许多抗生素的生产中得到被利用的氮源，在许多抗生素的生产中得到普遍使用。普遍使用。v氨水因碱性较强，因此使用时要防止局部过氨水因碱性较强，因此使用时要防止局部过碱，加强搅拌，并少量多次地加入。碱，加强搅拌，并少量多次地加入。v另外在氨水中还含有多种嗜碱性微生物，因另外在氨水中还含有多种嗜碱性微生物，因此在使用前应用石棉等过滤介质进行除菌过此在使用前应用石棉等过滤介质进行除菌过滤。滤。 2.有机氮源有机氮源v常用常用：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白陈、酵母粉、鱼粉

11、、米浆、玉米蛋白粉、蛋白陈、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。v它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被吸收后再进一步分解代谢。氨基酸，被吸收后再进一步分解代谢。v成分复杂成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。提供大量的无机盐及生长因子。v例玉米浆例玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸、较多的乳酸，硫、磷、微量素）、苯乙酸、较多的乳酸，硫、磷、微量元素等；元素等；磷酸肌醇。磷酸肌醇。v玉米浆：玉米浆：v易被利用

12、的氮源，对促进红霉素、链霉素、易被利用的氮源，对促进红霉素、链霉素、青霉素和土霉素的生产有作用。青霉素和土霉素的生产有作用。v是玉米淀粉的副产物，固形物含量是玉米淀粉的副产物，固形物含量50%左右，左右，还含有较多的有机酸，如乳酸，还含有较多的有机酸，如乳酸，pH在在4左右。左右。v玉米来源不同，加工条件不同，玉米浆的成玉米来源不同，加工条件不同，玉米浆的成分常有较大波动，在应用时应注意适当调配。分常有较大波动，在应用时应注意适当调配。v尿素：尿素：v常用有机氮源，但它成分单一，不具有上述常用有机氮源，但它成分单一，不具有上述有机氮源的特点。有机氮源的特点。v在青霉素、谷氨酸等生产中也常被采用

13、。尤在青霉素、谷氨酸等生产中也常被采用。尤其是在谷氨酸生产中，尿素可提高谷氨酸的其是在谷氨酸生产中，尿素可提高谷氨酸的生产。生产。v有机氮源有的还是产物的前体。有机氮源有的还是产物的前体。 三、三、 无机盐及微量元素无机盐及微量元素v作为生物活性物质的组成或生理活性作用的作为生物活性物质的组成或生理活性作用的调节物。调节物。v低浓度时对生长和产物合成有促进作用，高低浓度时对生长和产物合成有促进作用，高浓度时常表现出明显的抑制作用。浓度时常表现出明显的抑制作用。v不同微生物及不同的生长阶段对这些物质的不同微生物及不同的生长阶段对这些物质的最适浓度要求均不相同。最适浓度要求均不相同。v镁、磷、钾、

14、硫、钙和氯镁、磷、钾、硫、钙和氯等常以盐的形式加等常以盐的形式加入。入。例如：例如：硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二钾、碳酸钙、氯化钾等。碳酸钙、氯化钾等。v钴、铜、铁、锰、锌、铜钴、铜、铁、锰、锌、铜等微量元素，除了等微量元素，除了合成培养基外，一般不再另外单独加入。合成培养基外，一般不再另外单独加入。v但有些发酵上业中也有单独加入微量元素。但有些发酵上业中也有单独加入微量元素。例如：例如：生产维生素生产维生素B12，因钴是组成成分，因钴是组成成分，因此需要加入氯化钴。因此需要加入氯化钴。v磷：磷：v具有重要代谢调节作用，有利于糖代谢，能具有重要代谢调节作用，有利于糖

15、代谢，能促进微生物的生长，但磷若过多时，许多产促进微生物的生长，但磷若过多时，许多产物的合成受抑制。物的合成受抑制。v例例1：在谷氨酸的合成中，磷浓度过高就会抑在谷氨酸的合成中，磷浓度过高就会抑制制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，使菌体生长磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，使菌体生长旺盛，而谷氨酸的产量却很低，代谢向缬氨旺盛，而谷氨酸的产量却很低，代谢向缬氨酸方向转化。酸方向转化。v例例2：链霉素、土霉素、新生霉素、柠檬酸等链霉素、土霉素、新生霉素、柠檬酸等都受到磷浓度的影响。许多次级代谢过程对都受到磷浓度的影响。许多次级代谢过程对磷酸盐的承受限度比生长繁殖过程低，必须磷酸盐的承受限度比生长繁殖过程低，必须

16、严格控制。严格控制。v但也有一些产物要求磷酸盐浓度高些。但也有一些产物要求磷酸盐浓度高些。v例如：例如：淀粉酶，添加超过菌体生长所需要的淀粉酶，添加超过菌体生长所需要的磷酸盐浓度，则能显著增加产量。磷酸盐浓度，则能显著增加产量。v钙：钙：v能控制细胞透性。能控制细胞透性。v常用碳酸钙，能与代谢产生的酸起反应，对常用碳酸钙，能与代谢产生的酸起反应，对pH有一定的调节作用。有一定的调节作用。v配制培养基时，要先将培养基用碱调到中性，配制培养基时，要先将培养基用碱调到中性，才能将碳酸钙加入。才能将碳酸钙加入。v培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀，培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀，降低了培养基中

17、可溶性磷的含量。因此，当降低了培养基中可溶性磷的含量。因此，当培养基中磷和钙均要求较高浓度时，可将二培养基中磷和钙均要求较高浓度时，可将二者分别消毒或逐渐补加。者分别消毒或逐渐补加。v镁：镁： v除叶绿素，不参与细胞的组成。除叶绿素，不参与细胞的组成。v酶激活剂，影响基质氧化与蛋白质合成。酶激活剂，影响基质氧化与蛋白质合成。v常以常以硫酸镁硫酸镁加入，碱性溶液中会生成氢氧化镁沉淀，加入，碱性溶液中会生成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。配料时要注意。v硫：硫：v是含硫氨基酸的成分和某些辅酶的活性基，如辅酶是含硫氨基酸的成分和某些辅酶的活性基，如辅酶 A、硫辛酸和谷胱甘肽等。、硫辛酸和谷胱甘肽等。v在

18、某些产物中在某些产物中硫硫是组成元素。在其生产培养基中，是组成元素。在其生产培养基中，需要加入需要加入硫酸钠或硫代硫酸钠硫酸钠或硫代硫酸钠等含硫化合物作硫源。等含硫化合物作硫源。v铁：铁： v是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分，是菌体有氧氧化必不可少的元素。的成分，是菌体有氧氧化必不可少的元素。v铁制发酵罐内的溶液即使不加任何含铁化合铁制发酵罐内的溶液即使不加任何含铁化合物，其铁离子浓度已达物，其铁离子浓度已达30 g/ml。v一些天然培养基的原料中也含有铁，所以在一些天然培养基的原料中也含有铁，所以在一般发酵培养基中不再加入含铁化合物。一般发酵

19、培养基中不再加入含铁化合物。v有些产品对铁很敏感：有些产品对铁很敏感：v例例1：青霉素要求最适铁含量在青霉素要求最适铁含量在20g/ml以下。以下。v例例2：柠檬酸生产中，铁离子会激活顺乌头酸柠檬酸生产中，铁离子会激活顺乌头酸酶，使柠檬酸进一步代谢为异柠檬酸，据报酶，使柠檬酸进一步代谢为异柠檬酸，据报导在无铁培养基中产酸率可比含铁培养基提导在无铁培养基中产酸率可比含铁培养基提高近高近3倍。倍。v例例3：生产啤酒时，糖化用水若铁离子浓度高，生产啤酒时，糖化用水若铁离子浓度高，就会降低酵母发酵活力。就会降低酵母发酵活力。v铁：铁： v新发酵罐往往会造成培养基铁离子浓度过高，新发酵罐往往会造成培养基

20、铁离子浓度过高，所以要加以处理。所以要加以处理。v处理方法：处理方法：罐内壁涂生漆或耐热环氧树脂，罐内壁涂生漆或耐热环氧树脂，以防止铁离子脱落。以防止铁离子脱落。v氯：氯：v一般不具营养作用，但嗜盐菌除外。一般不具营养作用，但嗜盐菌除外。v在含氯产物发酵中，除从原料和水中带入的在含氯产物发酵中，除从原料和水中带入的氯外，还需加入约氯外，还需加入约0.1%氯化钾以补充氯离子。氯化钾以补充氯离子。v啤酒糖化时，氯离子在啤酒糖化时，氯离子在20-60 mg/l内，能赋内，能赋于啤酒口味柔和，并对酶和酵母的活性有促于啤酒口味柔和，并对酶和酵母的活性有促进作用。但氯含量过高会引起酵母早衰，使进作用。但氯

21、含量过高会引起酵母早衰，使啤酒带有咸味。啤酒带有咸味。v钠：钠：v与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加入少量钠盐，但用量不能过；否则会影响生入少量钠盐，但用量不能过；否则会影响生长。长。v钾：钾：v与细胞渗透压和透性有关，是许多酶的激活与细胞渗透压和透性有关，是许多酶的激活剂，能促进糖代谢。剂，能促进糖代谢。v在谷氨酸发酵中，菌体生长时需要钾离子约在谷氨酸发酵中，菌体生长时需要钾离子约0.01%，生产谷氨酸时需要约为，生产谷氨酸时需要约为0.02-0.1%(以硫酸钾计以硫酸钾计)。 四、水四、水v不同水源中存在的各种因素，对微生物发酵不同水源中存在的各种

22、因素，对微生物发酵代谢影响甚大。代谢影响甚大。v影响水源质量的主要参数：影响水源质量的主要参数：pH值、溶解氧、值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。量。v用物理或者化学方法进行改良处理，以控制用物理或者化学方法进行改良处理，以控制水的水的硬度硬度和和离子浓度离子浓度等影响发酵的重要指标。等影响发酵的重要指标。 五、生长因子、前体、促进剂和抑制剂五、生长因子、前体、促进剂和抑制剂 1.生长因子生长因子v从广义上讲从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维量的有机物质，如氨基酸、嘌

23、呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。生素等均称生长因子。v狭义的生长因子狭义的生长因子一般仅指维生素。一般仅指维生素。v生长因子是微生物自身不能合成而且是生长生长因子是微生物自身不能合成而且是生长必不可少的营养物必不可少的营养物。v微生物所需的维生素多为微生物所需的维生素多为B族维生素族维生素，如，如VB1（硫胺素）、（硫胺素）、VB2（核黄素）、（核黄素）、VB3（泛酸）等。（泛酸）等。v有机氮源是这些生长因子的重要来源有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数，多数有机氮源含有较多的有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。如及一些微生物生长不可缺

24、少的生长因子。如玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液等。玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液等。v如谷氨酸发酵使用生物素缺陷型菌株，以生如谷氨酸发酵使用生物素缺陷型菌株，以生物素为生长因子，正常情况细胞内不积累谷物素为生长因子，正常情况细胞内不积累谷氨酸，生物素不足可改变细胞膜透性，胞内氨酸，生物素不足可改变细胞膜透性，胞内谷氨酸渗出，发酵液中累积谷氨酸。谷氨酸渗出，发酵液中累积谷氨酸。v又如肠膜状明串珠菌的生长需要补充又如肠膜状明串珠菌的生长需要补充10种维种维生素、生素、19种氨基酸、种氨基酸、3种嘌呤及嘧啶等。种嘌呤及嘧啶等。 2.前体前体青霉素：分子量青霉素：分子量356356苯乙酸苯乙酸: :分

25、子量分子量136136v如青霉素生产中如青霉素生产中，加入玉米浆，产量增加，加入玉米浆，产量增加，原因是玉米浆含有苯乙酸，被优先结合到青原因是玉米浆含有苯乙酸，被优先结合到青霉素分子中去。霉素分子中去。v有些前体浓度过高时对菌体有毒性。此外，有些前体浓度过高时对菌体有毒性。此外，菌体还能分解前体，且菌体还能分解前体，且前体相对价格较高，前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，添加过多，容易引起挥发和氧化，因此常采因此常采用用少量多次地加入少量多次地加入。 3.促进剂促进剂 v指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂。的添加剂。v举

26、例：举例：v加加巴比妥盐巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌推迟自溶，延长分泌期。推迟自溶，延长分泌期。v加加酵母甘露聚糖酵母甘露聚糖可诱导甘露糖苷酶的产生，促使甘可诱导甘露糖苷酶的产生，促使甘露糖链霉素转化为链霉素。露糖链霉素转化为链霉素。v控制控制生物素生物素的加入量，可以促进谷氨酸从细胞内分的加入量，可以促进谷氨酸从细胞内分泌到细胞外。泌到细胞外。v加加聚乙烯醇衍生物聚乙烯醇衍生物可防止菌丝结球，提高糖化酶的可防止菌丝结球，提高糖化酶的产量。产量。 4.抑制剂抑制剂v抑制某些代谢途径抑制某些代谢途径的进行，同时会使的进行，同时会使另一代谢途径另一代

27、谢途径活跃活跃，从而获得人们所需的某种产物，或使正常代，从而获得人们所需的某种产物，或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。谢的某一代谢中间物积累起来。v举例：举例：v微生物发酵生产甘油。在发酵液中加入微生物发酵生产甘油。在发酵液中加入亚硫酸氢钠亚硫酸氢钠，它与代谢中产生的乙醛生成加成物，使乙醇的产生它与代谢中产生的乙醛生成加成物，使乙醇的产生受阻受阻 CH3CHO+NaHSO3 CH3CHOH - OSO3Na v乙醛不能成受氢体，而使乙醛不能成受氢体，而使NADH在细胞中积累。在细胞中积累。 G ATP ADP6-P-G 6-P-F 1，6-二磷酸二磷酸-果糖果糖 2*3-磷酸磷酸-甘油醛甘

28、油醛 2*NAD+ 2*乙醇乙醇（CH3CH2OH） 2*NADH+H+ 2*1，3-二磷酸二磷酸-甘油酸甘油酸 2*ADP （CH3CHO） 2*ATP2*3-P-甘油酸甘油酸 2*丙酮酸丙酮酸 2*ATP 2*2-P-甘油酸甘油酸 2*磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸 2*ADP EMP途径 乙醇发酵PiATP ADPCO2乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶 NADHNADH在细胞中积累，激活在细胞中积累，激活 - -磷酸甘油脱磷酸甘油脱氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮作为氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮作为NADH NADH 的的受氢体，而还原为受氢体，而还原为 - - 磷酸甘油酸，再由甘油激磷酸甘油酸，再由

29、甘油激酶催化形成甘油。酶催化形成甘油。u亚硫酸氢纳亚硫酸氢纳是是乙醇代谢乙醇代谢的抑制剂，促使甘油的抑制剂，促使甘油形成。形成。u亚硫酸钠亚硫酸钠也是也是乙醇代谢乙醇代谢的抑制剂的抑制剂u溴化剂溴化剂能抑制能抑制金霉素金霉素形成的代谢途径，促使形成的代谢途径，促使四环素的生成。四环素的生成。第二节第二节 培养基的类型及选择培养基的类型及选择 一、培养基的类型一、培养基的类型 1.按纯度按纯度 1）合成培养基）合成培养基v各种成分明确、稳定的化学试剂配制各种成分明确、稳定的化学试剂配制。v适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律。规律。v培养基营养单一，价

30、格较高，不适合用于大培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产。规模工业生产。 2）天然培养基）天然培养基v采用天然原料采用天然原料，化学成分不清楚或不恒定，化学成分不清楚或不恒定，如动植物组织或微生物浸出物、水解液等。如动植物组织或微生物浸出物、水解液等。v原料来源丰富（大多为农副产品）、营养丰原料来源丰富（大多为农副产品）、营养丰富，价格低廉、适于工业化生产。富，价格低廉、适于工业化生产。v组分复杂，不易重复，不加控制会影响生产组分复杂，不易重复，不加控制会影响生产稳定性。稳定性。 3）半合成培养基）半合成培养基v既含天然成分，又含化学试剂。发酵生产多既含天然成分，又含化学试剂。发

31、酵生产多采用。采用。MM培养基培养基(1L)(1L)： NaNa2 2HPOHPO4 4 6g 6g，KHKH2 2POPO4 4 3g 3g， NaCl NaCl 0.5g0.5g， NH4Cl 1gNH4Cl 1g， MgSO4.7H2O 0.5gMgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2 CaCl2 0.011g0.011g，葡萄糖，葡萄糖 2-10, pH 7.0 2-10, pH 7.0 YPSYPS培养基培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）：酪蛋白胨（日本大五营养）10g10g，酵母，酵母提取物（英国提取物（英国OxoidOxoid）5g, NaCl 10g5g, NaCl 10g，

32、PH 7.2 PH 7.2 培养大肠杆菌常用两种培养基培养大肠杆菌常用两种培养基 2.按状态按状态 1）固体培养基）固体培养基v适于菌种和孢子培养和保存，也广泛应用于适于菌种和孢子培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产产 。v常用麸皮、大米、小米、禾壳和琼脂等，有常用麸皮、大米、小米、禾壳和琼脂等，有的还另加其他营养成分。的还另加其他营养成分。 2）液体培养基）液体培养基v80-90%是水，内含可溶或不溶营养成分，是是水，内含可溶或不溶营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基，它有利于氧发酵工业大规模使用的培养基，它有利于氧和物质传

33、递。和物质传递。 3）半固体培养基）半固体培养基v即在配好的液体培养基中即在配好的液体培养基中加入少量琼脂加入少量琼脂，一，一般用量为般用量为0.50.8%，培养基即呈半固体状，培养基即呈半固体状态。态。v容器放倒不流下，剧烈震荡会破碎。容器放倒不流下，剧烈震荡会破碎。v主要用于主要用于：鉴定菌种，观察细菌运动特征：鉴定菌种，观察细菌运动特征（穿刺培养）、噬菌体的效价滴定及某些厌（穿刺培养）、噬菌体的效价滴定及某些厌氧菌保藏等。氧菌保藏等。 3.按用途按用途（从发酵生产应用考虑）（从发酵生产应用考虑） 1）孢子培养基）孢子培养基v供菌种繁殖孢子用。供菌种繁殖孢子用。v要求：要求：能使菌体迅速生

34、长，产生较多优质的孢子，能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，不易引起菌种发生变异。不易引起菌种发生变异。v基本配制要求：基本配制要求：营养不要太丰富营养不要太丰富(特别是有机氮源特别是有机氮源)，否则不易产孢，否则不易产孢子。子。所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子产量所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子产量和颜色。和颜色。要注意孢子培养基的要注意孢子培养基的pH和湿度。和湿度。v常用的孢子培养基有：常用的孢子培养基有：v麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糠、蛋白陈、牛肉膏、米碎屑培养基和用葡萄糠、蛋白陈、牛肉膏、食盐等配

35、制成的琼脂斜面培养基。食盐等配制成的琼脂斜面培养基。v大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮少，疏松、表面积大，所以是较好孢们含氮少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。子培养基。 2）种子培养基）种子培养基v供孢子发芽、生长和繁殖菌丝体。供孢子发芽、生长和繁殖菌丝体。v要求：要求：营养丰富完全，氮源和维生素的含量营养丰富完全，氮源和维生素的含量高些，总浓度略稀薄，以达到较高溶解氧。高些，总浓度略稀薄，以达到较高溶解氧。v一般有天然有机氮源一般有天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于激孢子发芽。但

36、无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以常包括有机及无机氮源。菌体迅速生长，所以常包括有机及无机氮源。v最后一级的种子培养基最好能较接近发酵培最后一级的种子培养基最好能较接近发酵培养基养基，这样可使种子迅速适应，快速生长。，这样可使种子迅速适应，快速生长。 3）发酵培养基）发酵培养基v是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。v既要迅速生长、又要能迅速合成产物。既要迅速生长、又要能迅速合成产物。v除有生长所必需的营养元素和化合物外，还除有生长所必需的营养元素和化合物外，还要有产物所需元素、前体和促进剂。要有产物所需元素、前体和促进剂。提供合成微生物细胞和发酵产物的基

37、本成分。提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。有利于提高培养基中产物的浓度，以提高单有利于提高培养基中产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。位容积发酵罐的生产能力。有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。化。原料价格低廉，质量稳定，取材容易。原料价格低廉，质量稳定，取材容易。所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率降低能耗。的影响，利于提高氧的利用率降低能耗。 有有利于产品的分离和纯化，并尽可能减少产生利于

38、产品的分离和纯化，并尽可能减少产生“三废三废”的物质。的物质。生长和合成产物需要的总的碳源、氮源、磷生长和合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或两阶段各需的最佳条件源等的浓度太高，或两阶段各需的最佳条件不同时，则考虑不同时，则考虑分批扑料分批扑料。还要考虑配比、渗透压、还要考虑配比、渗透压、pH、氧化还原等因、氧化还原等因素。素。 二、二、 培养基成分和配比的选择培养基成分和配比的选择v培养基的组分、来源、加工方法、配比，缓培养基的组分、来源、加工方法、配比，缓冲能力，粘度，消毒是否易彻底，消毒对营冲能力，粘度，消毒是否易彻底，消毒对营养破坏程度、杂质的含量等养破坏程度、杂质的含量

39、等都对菌体生长和都对菌体生长和产物形成有影响产物形成有影响。注意事项1.1.要注意快速利用的碳要注意快速利用的碳( (氮氮) )源和慢速利用源和慢速利用的碳的碳( (氮氮) )源的相互配比。源的相互配比。2.2.选用适当的碳氮比。选用适当的碳氮比。3.3.要注意生理酸、碱性盐和要注意生理酸、碱性盐和pHpH缓冲剂的加缓冲剂的加入和搭配。入和搭配。 确定最佳成分组成确定最佳成分组成 确定各成分的最佳配比确定各成分的最佳配比 确定最佳确定最佳pHpH 确定最佳配制工艺确定最佳配制工艺培养基设计与优化的任务培养基设计与优化的任务 培养基组成（包括原料来源与加工方法）培养基组成（包括原料来源与加工方法

40、） 配比配比 缓冲能力缓冲能力 黏度黏度 消毒是否彻底消毒是否彻底 消毒对营养的破坏程度消毒对营养的破坏程度 原料的杂质原料的杂质培养基中影响菌体生长和产物形成的因素培养基中影响菌体生长和产物形成的因素第三节第三节 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备 一、一、淀粉水解制糖的意义淀粉水解制糖的意义 二、淀粉水解糖的制备方法及原理二、淀粉水解糖的制备方法及原理 一、淀粉水解制糖的意义一、淀粉水解制糖的意义p 大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）生产菌不能直接利用）p 有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在有些微生物能够直接利用淀

41、粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。周期延长。p 若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。淀粉结块，发酵液粘度剧增。第三节第三节 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备v因此，在发酵生产之前，必须将淀粉水解因此，在发酵生产之前，必须将淀粉水解 为葡萄糖，才能供发酵使用。为葡萄糖，才能供发酵使用。v在工业生产中，在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖的过将淀粉水解为葡萄糖的过程称淀粉的程称淀粉的，制得的溶液叫，制得的溶液叫。v因此，在发酵生产之前，必须将淀粉水解因

42、此，在发酵生产之前，必须将淀粉水解 为葡萄糖，才能供发酵使用。为葡萄糖，才能供发酵使用。v在工业生产中，在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖的过程将淀粉水解为葡萄糖的过程称淀粉的称淀粉的，制得的溶液叫，制得的溶液叫。二、淀粉水解糖的制备方法及原理二、淀粉水解糖的制备方法及原理淀粉水解的过程：淀粉水解的过程：淀粉淀粉吸水膨胀吸水膨胀 糊化糊化 （无化学反应无化学反应）-淀粉酶或酸淀粉酶或酸 液化液化 糊精糊精 糖化酶或酸糖化酶或酸 低聚糖低聚糖 麦芽糖麦芽糖 葡萄糖葡萄糖（由7-12个葡萄糖残基组成） 3-6个 2个 1 酸解法酶解法酸酶结合法p原料： 薯类、玉米、小麦、大米等p原料淀粉的性质和水解

43、使用的催化剂的不同p定义：定义：以酸为催化剂，在高温高压下使淀以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。粉水解生成葡萄糖的方法。 1.酸解法酸解法副反应：副反应： 不利影响：不利影响：p复合反应复合反应：生成的多数复合糖不能被微生生成的多数复合糖不能被微生 物利用，使发酵结束时残糖高。物利用，使发酵结束时残糖高。p分解反应分解反应：生成的生成的55羟甲基糠醛是产生羟甲基糠醛是产生 色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困 难。难。 总之：总之：p降低了葡萄糖的收率。降低了葡萄糖的收率。p给产物的提取和糖化液的精制带来困难。给产物的提取和糖化液的精制带

44、来困难。如何控制分解反应和复合反应的发生？如何控制分解反应和复合反应的发生？ 淀粉乳浓度淀粉乳浓度 酸浓度酸浓度 不能过高不能过高 温度温度v工艺流程：工艺流程：v原料（淀粉、水、盐酸）原料（淀粉、水、盐酸） 调浆调浆通蒸汽通蒸汽糖化糖化 冷却冷却 中和（中和（Na2CO3) 、脱色（活性碳）、脱色（活性碳） 过滤除杂过滤除杂糖液糖液 评价评价优点：优点： 工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。快。缺点：缺点： 副产物多，影响糖液纯度，一般副产物多，影响糖液纯度，一般DEDE值值只有只有9090左右。左右。 对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只

45、能用纯对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。度较高的精制淀粉。定义：定义： 用专一性很强的用专一性很强的淀粉酶淀粉酶及及糖化酶糖化酶将淀粉水解将淀粉水解为葡萄糖的工艺。为葡萄糖的工艺。2.酶解法酶解法淀粉水解的过程淀粉水解的过程淀粉吸水膨胀 糊化 （无化学反应）-淀粉酶 液化 糊精 糖化酶 低聚糖 糖化酶 麦芽糖 葡萄糖（由7-12个葡萄糖残基组成） 3-6个 2个 1 （1 1）液化）液化p淀粉酶水解底物内部的淀粉酶水解底物内部的1,41,4糖苷键糖苷键，不能水解，不能水解1,61,6糖苷键，糖苷键，但能越过但能越过 -1 -16-6-糖苷键继续水解糖苷键继续水解 -

46、-1 14-4-糖苷键，而将糖苷键，而将 -1.6-1.6糖苷键糖苷键留在在水解产物中。留在在水解产物中。p直链淀粉直链淀粉 葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖。葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖。 p支链淀粉支链淀粉 以上以上+ +异麦芽糖及含有异麦芽糖及含有 -1 -16-6-糖苷键的低聚糖苷键的低聚糖糖p淀粉被淀粉被-淀粉酶淀粉酶水解后，粘度下降，表现出液化，故有液化水解后，粘度下降，表现出液化，故有液化酶之称。酶之称。 v淀粉的糊化与老化淀粉的糊化与老化v淀粉的淀粉的糊化糊化是指淀粉受热后，淀粉颗粒吸是指淀粉受热后，淀粉颗粒吸水膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状水膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体

47、，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。现象。v发生糊化现象时的温度称发生糊化现象时的温度称糊化温度糊化温度。不同。不同原料的糊化温度范围不同。原料的糊化温度范围不同。v淀粉的淀粉的老化老化实际上是分子间已断裂的氢键、实际上是分子间已断裂的氢键、糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是也就是复结晶复结晶的过程。的过程。v在酶法糖化时，在酶法糖化时， -淀粉酶很难进入老化淀淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，使淀粉很难液化，因粉的结晶区起作用，使淀粉很难液化，因此，必须采取相应的措施控制糊化淀粉的此，必须采取相应的

48、措施控制糊化淀粉的老化。老化。工艺流程工艺流程调浆调浆-配料配料-一次喷射液化一次喷射液化-液化保温液化保温-二次喷射二次喷射-高温维持高温维持-二次二次液化液化-冷却冷却-（糖化）（糖化） 两次加酶喷射液化工艺两次加酶喷射液化工艺（DDS公司）公司）酶酶淀粉淀粉+水水+酶酶蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽配料罐配料罐喷射液化器喷射液化器保温罐保温罐95-97145二次液化罐二次液化罐低压蒸汽喷射液化工艺及条件低压蒸汽喷射液化工艺及条件 在在配料罐配料罐内，将淀粉加水调浆成内，将淀粉加水调浆成淀粉乳淀粉乳，用，用Na2CO3调调PH，使，使PH值处在值处在5.0-7.0之间，加入之间，加入0.

49、15%的氯化钙的氯化钙作为淀粉酶的保护剂和激活剂，最后加入耐高温作为淀粉酶的保护剂和激活剂，最后加入耐高温-淀粉酶淀粉酶，料液经搅拌均匀后用泵打入料液经搅拌均匀后用泵打入喷射液化器喷射液化器，在喷射器中出来的料液和高温蒸汽直接接触，在喷射器中出来的料液和高温蒸汽直接接触，料液在很短时间内升温至料液在很短时间内升温至95-97，此后料液进入，此后料液进入保温罐保温罐保温保温60min，温度维持在，温度维持在95-97，然后进行，然后进行二次喷射二次喷射，在第二只喷射器内料液和蒸汽直接接触，使温度迅速升至，在第二只喷射器内料液和蒸汽直接接触，使温度迅速升至145以上，并在维持罐内维持该温度以上，并

50、在维持罐内维持该温度3-5min左右，彻底杀死耐高温左右，彻底杀死耐高温-淀粉酶，然后淀粉酶，然后料液经真空料液经真空闪急冷却闪急冷却系统进入系统进入二次液化罐二次液化罐，将温度降低到，将温度降低到95-97，在二次液化罐内，在二次液化罐内加入耐高温加入耐高温-淀粉酶，液化约淀粉酶，液化约30min，用，用碘碘呈色试验合格后，结束液化。呈色试验合格后，结束液化。 两次加酶喷射液化工艺两次加酶喷射液化工艺（DDS公司）公司）酶酶淀粉淀粉+水水+酶酶蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽配料罐配料罐喷射液化器喷射液化器保温罐保温罐95-97145二次液化罐二次液化罐v液化条件：液化条件：v3040的淀粉

51、乳浓度、的淀粉乳浓度、pH值值57、温、温度度95 C97 C。 v淀粉酶的加入量，随着酶活力的高低而定，淀粉酶的加入量，随着酶活力的高低而定，但一般控制在但一般控制在58u/g淀粉。淀粉。在液化过程中，淀粉糊化水解成较小的分子。在液化过程中，淀粉糊化水解成较小的分子。液液化程度不能太低化程度不能太低，因为：，因为：. .液化程度低，液化液的黏度就大，难于操作；液化程度低，液化液的黏度就大，难于操作；. .葡萄糖淀粉酶属于葡萄糖淀粉酶属于外酶外酶，水解是由底物分子，水解是由底物分子的非还原末端开始，底物分子越大，水解的机会就越的非还原末端开始，底物分子越大，水解的机会就越小，因此会影响到糖化的

52、速度；小，因此会影响到糖化的速度；. .液化程度低，淀粉液化程度低，淀粉易老化易老化，不利于糖化，特，不利于糖化，特别会使糖化液的过滤性较差。别会使糖化液的过滤性较差。液化程度的控制液化程度的控制液化程度的控制 液化程度也不能太高液化程度也不能太高，因为：，因为： 葡萄糖淀粉酶是先与底物分子生成络合结构，葡萄糖淀粉酶是先与底物分子生成络合结构，而后发生水解作用，使葡萄糖单位逐个从糖苷键而后发生水解作用，使葡萄糖单位逐个从糖苷键中裂解出来，要求底物分子有一定的大小。中裂解出来，要求底物分子有一定的大小。液化液化超过一定程度，不利于糖化酶生成络合结构，影超过一定程度，不利于糖化酶生成络合结构，影响

53、催化效率响催化效率，使糖化液的最终值偏低。所以，使糖化液的最终值偏低。所以必须进行灭酶必须进行灭酶. 正常液化条件下，控制值在正常液化条件下，控制值在1020%之之间为好。间为好。 (2)(2) 糖化糖化v糖化酶糖化酶从非还原性末端水解从非还原性末端水解 -1,4-1,4糖苷键和糖苷键和 -1,6-1,6糖苷键。糖苷键。v终点确定终点确定：DEDE值达最高时，停止酶反应值达最高时，停止酶反应。 优点优点： 反应条件温和，不需高温、高压设备。反应条件温和，不需高温、高压设备。副反应少，水解糖液纯度高。副反应少，水解糖液纯度高。对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓度下水解。度下水解。糖液颜色浅，质量高。糖液颜色浅，质量高。 缺点：缺点：生产周期长，一般需要生产周期长，一般需要4848小时。小时。需要更多的设备，且操作严格。需要更多的设备，且操作严格。 集酸解法和酶解法的优点而采取的生产集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。