体外培养破骨细胞功能的定量评定

1、    体外培养破骨细胞功能的定量评定        摘要目的建立适用于体外药理学研究的破骨细胞骨吸收功能的定量评定方法。方法机械分离法获得破骨细胞，接种于象牙簿片底物上，分别于培养1d、3d、5d、7d取出象牙簿片各4张，采用光镜和扫描电镜观察骨吸收陷窝数量的变化；对随机拍摄的陷窝照片进行计算机形态计量分析，测算陷窝的面积和深度。结果骨吸收陷窝计数光镜法和扫描电镜法具有良好的相关性，r0.9998，P0.001。随着培养时间的延长，陷窝数量逐渐增多、面积扩大、深度加深。结论

2、骨吸收陷窝计数光镜法可以用于体外培养破骨细胞功能的定量评价，结合陷窝面积和深度分析，可以较为全面地评价体外培养破骨细胞的骨吸收功能。关键词破骨细胞骨吸收陷窝数量面积深度 Quantitative Evaluation of The Function of Osteoclast Gultured in VitroZhan Hongshenget al Zhejiang college of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou (310053)Shi Yinyu,Zhao Yongfang(Shanghai University of TCM)Key wor

3、ds osteoclast,bone absorptive lacunae,amount,area,depth正常骨重建起始于破骨细胞的激活，破骨细胞性骨吸收伴随生命活动的始末，破骨细胞异常活跃或功能低下，可诱发一系列临床病症，如骨质疏松症、Paget氏病、关节置换术后假体松动、牙周病变或骨硬化症等。体外破骨细胞培养方法的建立，将有助于丰富对破骨细胞活化和功能调控机制的认识，而稳定、灵敏的破骨细胞功能评价方法，对新药的研制和开发是十分必要的。1材料与方法1.1主要试剂和仪器Medium 199培养基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)为Gibco公司产品，戊二醛、甲苯胺蓝

4、为E.Merck公司产品，24孔培养板为Costar公司产品；Leitz 1600型锯式切片机，SB 2200 型超声波清洗仪，Nikon 102型光学显微镜，日立S-520型扫描电镜，MTDS-B多功能显微影像真彩色数字化分析系统。1.2象牙片制备与处理取直径1.5cm的象牙毛胚，用锯式切片机横向切成50m薄片，置蒸溜水中超声波清洗10min×3次，自然晾干，紫外线照射后保存于4冰箱中备用。1.3破骨细胞分离与培养参照文献，取1日龄SD大鼠(由上海医科大学放射医学研究所实验动物中心提供)，拉颈处死，75%酒精浸泡5min，无菌分离四肢长骨，剔净软组织，用Medium 199培养液清

5、洗2次，然后于Medium 199全培养液(含20%FBS、100g/ml硫酸链霉素、100/ml青霉素钠，pH7.2)中，用解剖刀纵向剖开骨干，将骨质内表面刮入培养液，再以圆头吸管吹打骨碎片5min，静置30s，吸取上层细胞悬液均匀接种于预置有象牙薄片的24孔培养板中，每孔加培养液至1ml，37、5%CO2环境中培养30min，以Medium 199培养液冲去未贴壁的细胞，更换为全培养液至每孔2ml，每组4孔，继续培养，3d更换1次培养液。1.4骨吸收陷窝定量分析分别于培养1、3、5、7d取出培养板中的象牙薄片各4张，2.5%戊二醛固定7min，于0.25mol/L氢氧化铵中超声波清洗5mi

6、n×3次，系列梯度酒精脱水，自然凉干，1%甲苯胺蓝染液室温染色34min，蒸溜水清洗，于光镜100倍下对整张象牙薄片上的吸收陷窝计数；然后对同一张象牙薄片再经超声波清洗10min×3次，常规处理后扫描电镜300倍下对整张象牙薄片上的吸收陷窝计数。结果以陷窝数/片表示，组间进行线性相关分析。同等条件下每组随机拍摄照片各6张，采用计算机象分析系统分别测算陷窝与背景面积的比值，以及陷窝的平均光密度值。     2结果2.1骨吸收陷窝的形态特征光镜下，经甲苯胺蓝染色后吸收陷窝呈紫色或蓝紫色，培养1d的象牙薄片上可偶见着色较淡的吸收陷窝，呈圆形

7、或椭圆形；3d时有腊肠形吸收陷窝出现；5d后吸收陷窝绝大部分呈梅花瓣形或腊肠形，边界轮廓清晰，陷窝底部纤维纹路隐约可见(1-A)。扫描电镜下观察，骨吸收陷窝的变化趋势与光镜结果一致，同一标本可清楚识别形态相似的骨吸收陷窝，边界轮廓清晰，陷窝底部粗糙，纤维纹路清晰可见(1)。接种在象牙薄片上的破骨细胞所形成的骨吸收陷窝。A：甲苯胺蓝染色，骨陷窝呈紫色，边界轮廓清晰，基底部纤维纹理隐约可见，×400。B：同一视野扫描电镜观察，骨陷窝轮廓一致，基底部纤维纹理清晰可见，×100。     1破骨细胞骨吸收陷窝的形态2.2骨吸收陷窝计数结果根据

8、上述骨吸收陷窝的特征，光镜和电镜下可清楚辨认骨吸收陷窝，计数结果基本一致，培养1d即有极少量的吸收陷窝出现，3d时稍有增多，5d后陷窝数量急剧增多。光镜计数结果与电镜计数结果进行相关分析(2)：相关系数r0.9998，P0.001。     2.3骨吸收陷窝面积分析结果对培养1d、3d、5d、7d的象牙薄片经甲苯胺蓝染色后，随机拍摄照片各6张，采用计算机象分析系统勾画出陷窝轮廓(3)，分别计算陷窝和背景的面积，结果以两者的比值表示。随着培养时间的延长，陷窝面积逐渐扩大(4)。     3骨吸收陷窝面积分析A：甲苯胺

9、蓝染色的光镜照片。×400。B：同一照片，由计算机象分析系统所勾画出的陷窝轮廓。×400。     4骨吸收陷窝面积随时间变化的趋势(n6)2.4吸收陷窝深度分析对培养1d、3d、5d、7d的象牙薄片经甲苯胺蓝染色后，随机拍摄照片各6张。由于陷窝着色深浅与其深度有关(5)，采用计算机象分析系统计算每张照片上陷窝的平均光密度值，以此反映陷窝的深度。结果显示，培养13d陷窝深度变化不明显，35d陷窝深度不断加深，57d陷窝深度变化不明显(6)。     5骨吸收陷窝深度分析A：甲苯胺蓝染色的光镜照片

10、，实心箭头所示处着色深，空心箭头所示处着色浅。×200；B：同一陷窝的扫描电镜照片，实心箭头所示处陷窝深，空心箭头所示处陷窝浅。×300。     6骨吸收陷窝深度随时间变化的趋势(n6)3讨论骨吸收陷窝观察是评价体外培养破骨细胞功能的可靠方法之一，以往多在扫描电镜下进行陷窝计数，其技术要求高、难度大，且费时费力，不便推广。新近有研究者采用甲苯胺蓝染色，骨吸收陷窝异染明显，光镜下可以清晰辨认其轮廓，计数结果与电镜法具有良好的相关性1，本实验取得了与之相近的结果，因此可以认为，骨吸收陷窝光镜计数法能够用于体外培养破骨细胞骨吸收功能的定量

11、评定。由于陷窝的大小不同，陷窝面积分析可以弥补计数方法所可能存在的缺陷28，通常是采用计算机像分析系统对随机拍摄的同一批次陷窝照片进行分析，结果以陷窝面积与背景面积的比值表示。本实验结果显示，正常情况下，陷窝数量和面积随着培养时间的延长而逐渐增加，变化趋势基本一致，第1天陷窝少而面积小，前3天稍有增加和扩大，第5天以后无论是数量还是面积都明显增多或扩大。破骨细胞吸收骨质的过程中，通过移行不断增加陷窝面积的同时，陷窝深度也在加深，对于一根被破骨细胞侵蚀的骨小梁而言，陷窝深度的不断加深更易于引起小梁的穿孔和断裂，因此，陷窝深度测量较之陷窝面积分析的意义有所不同。我们在实验中观察到，同一张象牙薄片经

12、甲苯胺蓝染色后，陷窝着色存在明显的深浅差异，即便同一陷窝有时也存在类似现象，与扫描电镜对照观察发现，着色深的部位陷窝也较深，着色浅的部位陷窝则较浅，基于这一现象，通过计算机像分析系统，测定被甲苯胺蓝异染的陷窝光密度值，然后再除以陷窝的面积，以陷窝的平均光密度值来间接反映其深度。实验结果显示，正常情况下，培养13d象牙薄片上的骨吸收陷窝深度较浅，且基本无变化，35d深度明显增加，57d也基本无变化。这一方法的建立，为定量评定陷窝深度提供了一种新的尝试。综上，陷窝计数、面积和深度测定相结合，可以较为全面地评价体外培养破骨细胞的骨吸收功能，正常培养条件下，57d陷窝的数量明显增多、面积扩大、深度加深

13、，因此，选择加药后第57d终止培养，可以观察药物干预的效果。致谢：本文细胞培养技术的学习得到上海医科大学王洪复、金慰芳及高建军的指导和帮助，谨致谢意!浙江省自然科学基金(NO399010)和国家九五攻关项目基金(NO969060905)资助詹红生(浙江中医医院杭州310053)石印玉(上海中医药大学)赵咏芳(上海中医药大学)参考文献2，Carano A,Teitelbaum SL,Konsek JD,et al.Bisphosphonates directly inhibit the bone resorption activity of isolated avian osteoclasts in vitro.J Clin Invest.1990,85(2):4564615，赵宁侠，于世凤，庞淑珍.IL-l促进骨巨细胞瘤中破骨细胞样细胞体外骨吸收研究.北京医科大学学报，1998，30(3)：2462